ШТАММ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1-ГО ТИПА ИВ742 СУБТИПА А ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 G01N33/569 

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов.

Проблема ВИЧ-инфекции до сих пор остается одной из серьезных мировых проблем. Миллионы людей в мире уже инфицированы ВИЧ, и каждую минуту происходит новое заражение вирусом. В нашей стране эта проблема, к сожалению, тоже актуальна. Свыше 80% ВИЧ-инфицированных составляют лица от 30 до 40 лет, то есть речь идет о нетрудоспособности огромного числа лиц трудоспособного возраста [1]. В итоге данная проблема из разряда медицинской переходит в разряд социальной. В связи с этим создание вакцины против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) является актуальной проблемой. В настоящее время в ряде стран проводятся испытания вакцинных препаратов, созданных на основе изолятов ВИЧ-1, относящися к субтипу Е, доминирующего на Африканском континенте и Азии, и на основе изолятов ВИЧ субтипа В, преобладающего в Европе и Северной Америке [2, 3]. Однако для территории РФ характерен вариант ВИЧ, относящийся к субтипу А, поэтому для разработки диагностических и вакцинных препаратов и изучения химиопрепаратов нового поколения необходимо использовать штамм ВИЧ-1 именно данного субтипа [4, 5].

Задача изобретения - получение штамма вируса иммунодефицита человека, принадлежащего к субтипу А, доминирующему в настоящее время на большей части территории РФ.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в использовании его для изучения антивирусного действия химиопрепаратов нового поколения и для создания вакцины.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 субтипа А для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1187 от 01.07.11 и имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1, хранится в коллекции вирусов НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови больного СПИД, не получавшего антиретровирусную терапию. При получении штамма использованы методы сокультивации лимфоцитов больного с лимфоцитами крови здорового донора, стимулированных митогеном, а также с человеческими перевиваемыми клеточными линиями.

Репродукция

Штамм ВИЧ-1 ИВ-742 обладает высокой репродуктивной активностью и реплицируется в лимфоцитах периферической крови, лимфобластоидных клеточных культурах МТ-4 и Jurkat. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием и синицитеобразованием. Штамм может поддерживаться длительное время при пассировании на клеточных линиях. Через 5-6 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь замораживается и после размораживания и осветления при 1000 об/мин вносится к свежим неинфицированным клеткам в соотношении 1:10.

Инфекционный титр вируса определяли по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на модели вышеуказанных клеточных культур в сравнении со штаммом-аналогом ВИЧ-1 LAV, который является первым изолятом ВИЧ-1, выделенным от больного СПИДом [6]. Продуктивная активность штамма составляет 6,0 Ig ТЦД50 и сопоставима с инфекционным титром штамма-аналога (таблица 1).

Антигенные свойства

ВИЧ-1 относится к семейству Retroviridae, род Lentivirus. Вирусы этой подгруппы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами, которые могут быть выявлены в инфицированных клетках с помощью различных иммунологических и вирусологических методов.

Иммунофлюресценция. Исследование методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки больного СПИДом, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие антигенов ВИЧ-1 в 45-50% инфицированных клеток.

Иммуноблот. Исследование в иммуноблоте показало, что вирус обладает антигенными детерминантами, характерными для ВИЧ-1: 120/160, 65, 55, 41, 31, 24, 17 кД (таблица 2).

Субтипирование. Генетический анализ области, кодируемой геном ро1, проведенный с помощью субтипспецифических праймеров (CCAAAGGTTAAACAATGG, TTAGATTCTTAAATGGCTCC) подходящих для изучения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России, показал, что данный штамм вируса относится к субтипу А.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 по цитопатическому действию

Исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 и Jurkat в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). Клетки инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Далее инкубировали культуры клеток при 37°С в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим на 6-7 сутки. За титр вируса принимали величину, обратную его максимальному разведению, вызывающему как минимум двухкратное превышение показателя гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Сравнительный анализ показал, что инфекционные титры штамма ИВ742 сопоставим с инфекционным титром штамма-аналога LAV, что свидетельствует об их сходной активности. Данный инфекционный титр позволяет успешно инфицировать лимфобластоидные клеточные культуры с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Пример 2. Диагностика антител к ВИЧ-1 методом иммуноблота

Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 8 сыворотками, полученными от ВИЧ-инфицированных лиц и содержащих анти-ВИЧ антитела. Сыворотки были предварительно охарактеризованы в коммерческой тест-системе фирмы «Биорад» (США). В качестве антигена использован штамм ИВ742 и штамм-аналог LAV. Выявление антител к ВИЧ-1 проводили с помощью нитроцеллюлозных стрипованных мембран (стрип) с нанесенными на них антигенами ВИЧ-1 фирмы «Биорад» (США). Готовую стрипованную мембрану предварительно замачивали на 5 мин в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-Т). Сыворотку крови в количестве 20 мкл разводили в 1 мл ФСБ-Т, содержащего 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин), и вносили в лунку со стрипом. После инкубации в течение 1 час при комнатной температуре и отмывки ФСБ-1 вносили конъюгат, разведенный в 1 мл ФСБ-Т. Далее снова проводили инкубацию в течение 1 час при комнатной температуре и после отмывки ФСБ-Т вносили 1 мл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ). Затем инкубировали в темноте до появления четких полос в контрольном стрипе. Реакцию останавливали 1 н. серной кислотой. После промывки стрипа дистиллированной водой его высушивали при комнатной температуре и визуально проводили учет результатов.

Результаты исследований представлены в таблице 2. В результате проведенных исследований установлено, что антиген штамма ИВ742 позволяет выявлять антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1 и, следовательно, может быть использован для изучения сероконверсии лиц, инфицированных ВИЧ-1, а также для изучения противовирусного действия химиопрепаратов и создания вакцины против ВИЧ.

Пример 3. Сравнительный анализ инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 по уровню антигена вируса (р24)

Определение уровня вирусного антигена в вируссодержащей жидкости проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерческого иммуноферментного набора фирмы Биорад (США) на 96-луночных панелях. В лунки, в которые предварительно был внесены исследуемые образцы, добавляли конъюгат, содержащий биотилинированные поликлональные антитела к р24 ВИЧ-1. После инкубации в течение 1 часа при 37°С панель отмывали трис-солевым буфером и вносили стрептавидин-пероксидазный конъюгат. Проводили инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре отмывали панель трис-солевым буфером и затем для визуализации реакции добавляли тетраметилбензидин (ТМБ). После инкубации в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре в лунки для остановки реакции вносили 1 н. серную кислоту. Результаты учитывали с помощью фотометра "Multiscan" при длине волны 630 нм. За положительный контроль принимали не менее чем 3-кратное превышение оптической плотности по сравнению с таковым показателем неинфицированной клеточной линии.

Результаты исследований представлены в Таблице 3. В результате проведенных исследований установлено, что штамм ИВ 742 не уступает по уровню выработки антигена ВИЧ-1, штамму-аналогу LAV и обладает высокой репродуктивной активностью, что позволяет успешно инфицировать им лимфобластоидные клеточные культуры с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Источники информации

1. Постановление от 13.02.2012 №6 «О неотложных мерах по противодействию распространения ВИЧ-инфекции в Российской Федерации».

2. Spira S., Wainberg M.A., Loemba H. et al. Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug resistance // J. Antimicrob. Chem. - 2003. - V.5L. - P.229-240.

3. Kathy Stover. "In Thailand Clinical Study, HIV Vaccine Regimen Demonstrates Modest Preventive Effect." Medical News Today. MediLexicon, Intl., 25 Sep. 2009. Web. 22 Jun. 2012. http://www.medicalnewstoday.com/releases/165277.php

4. Bobkov A.F., Kazennova E.V., Selimova L.M. et al. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A // J. Med. Virol. - 2004. - V.74. - P.191-196.

5. Nosik M., Ryzhov К., Kravtchenko A. et al. Genotypic Analyses of HIV in antiretroviral drug-naive patients from Moscow and Moscow Region, Russia // 6th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, 17-20 July 2011, Rome, Italy, Abs.CDA002.

6. Barre-Sinoussi F., Mugeyre M., Dauguet C. Isolation of a T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for AIDS // Science. - 1983. - Vol.220. - P.868-871.

Таблица 1 Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 на модели клеток МТ-4 и Jurkat Титр, Ig ТЦД50 Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток МТ-4) Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток Jurkat) LAV ИВ742 LAV ИВ742 6,0 6,0 6,0 6,0

Таблица 2 Исследование штамма ИВ742 методом иммуноблота Вирусный антиген Выявленные антитела Контроль (LAV) 160 120 65 55 53 41 31 24 17 ИВ742 160 120 65 55 53 41 31 24 17

Таблица 3 Сравнительный анализ инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 по уровню антигена вируса (р24) Контроль клеток Штаммы ВИЧ-1 Контроль (LAV) ИВ735 0,159* 2,961 2,955 * оптическая плотность

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1187. Штамм обладает стабильной репродуктивной активностью. Инфекционный титр составляет 6 lg ТЦД 50. Штамм является моделью для изучения антивирусной активности химиопрепаратов нового поколения, а также для создания вакцинных препаратов. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 субтипа А для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1187 и имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1.