ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА Shigella ИЗ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к санитарной бактериологии и может быть использовано учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы, осуществляющими надзор и контроль за качеством воды поверхностных водоемов, зон рекреаций, сточных и питьевых вод.

Отсутствие специальных питательных сред для выделения шигелл из водных объектов затрудняет их высеваемость, что не позволяет дать оценку эпидемической безопасности водоисточников.

Известна питательная среда для накопления бактерий семейства Enterobacteriaceae, содержащая в качестве источника азотистого питания панкреатический гидролизат рыбы и экстракт кормовых дрожжей, глюкозу в качестве источника углеродистого питания, буферные соли - натрия гидрофосфат и калия дигидрофосфат, натрия хлорид, придающий среде изотонические свойства, селективные агенты - желчь очищенную и бриллиантовый зеленый (RU 2267530 С2).

Данная питательная среда обеспечивает тормозящее действие на представителей грамположительных микроорганизмов, но при этом обладает одинаковой степенью накопления для всех бактерий семейства Enterobacteriaceae, в том числе и Е.coli, которые при высоком содержании их в исследуемых объектах оказывают антагонистическое действие на шигеллы. Поэтому указанная среда не может быть использована для выделения шигелл при исследовании водных объектов, заведомо содержащих E.coli в больших количествах.

В практических лабораториях для выделения шигелл из объектов окружающей среды, в том числе и водных, используется селенитовая среда (Руководство по медицинской микробиологии. Частная микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II//под ред. Лабинской А.С., Костюковой Н.Н., Ивановой СМ. - М: БИНОМ, 2010. - С.1078), выбранная в качестве прототипа. Селенитовая среда включена в методические указания МУ 2.1.5. «Методы санитарно-микробиологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения» (Минздрав России, Москва, 2011) в качестве среды для выделения шигелл. Данная среда имеет следующий состав:

Ингредиенты Концентрация Натрия гидроселенит 4,0 г Пептон 5,0 г Натрия гидрофосфат 7,0 г Натрия дигидрофосфат 3,0 г Лактоза 4,0 г Вода дистиллированная до 1000 мл

Среду готовят из двух растворов.

Раствор 1. Предварительно определяют количественные соотношения фосфатов при взятом образце пептона и натрия гидроселенита, чтобы готовая среда имела pH 7,0±0,1. После определения соотношения фосфатов к раствору добавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50,0 мл и стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 минут.

Раствор 2. 10% раствор натрия гидроселенита готовят ex tempore на стерильной дистиллированной воде.

Перед началом работы во флакон с 50,0 мл раствора 1 асептически добавляют по 2,0 мл раствора 2. Готовую среду асептически разливают по 5,0-7,0 мл в стерильные пробирки и плотно закрывают пробками. Дальнейшей стерилизации не требуется.

Недостатком среды является то, что наряду с ингибированием сопутствующей микрофлоры, в том числе E.coli, происходит одновременно и угнетение роста шигелл.

Целью предлагаемого изобретения является жидкая питательная среда для выделения шигелл из воды, обеспечивающая повышение эффективности накопления шигелл. Среда содержит пептон ферментативный в качестве источника азотистого питания, экстракт кормовых дрожжей в качестве стимулятора роста, калия дигидрофосфат и едкий натр в качестве буферной смеси и источника минерального питания, натрия хлорид для придания изотонических свойств среде, бромкрезоловый зеленый и метиловый красный в качестве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры в следующих количествах:

Ингредиенты Количество 0,1% спиртовой раствор бромкрезолового зеленого 9,0 мл 0,2% спиртовой раствор метилового красного 3,0 мл Пептон ферментативный 0,5 г Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) 4,5 г Калия дигидрофосфат (КН₂РО₄) 8,7 г Едкий натр (NaOH) 1,4 г Натрия хлорид (NaCl) 5,0 г Вода дистиллированная до 1000 мл pH 6,70-6,85

Среду готовят из трех растворов.

Раствор 1. Навески пептона ферментативного, экстракта кормовых дрожжей, калия дигидрофосфата, едкого натра, натрия хлорида растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят до 1000 мл. Нагревают раствор до полного растворения ингредиентов. Стерилизуют при 112°C (0,5 кгс/м²) в течение 30 мин.

Раствор 2. 0,1% спиртовой раствор бромкрезолового зеленого готовят ex tempore на 20% растворе этанола:

0,1 г бромкрезолового зеленого растворяют в 99,9 г 20% этанола.

Раствор 3. 0,2% спиртовой раствор метилового красного готовят ех tempore на 60% растворе этанола:

0,2 г метилового красного растворяют в 99,9 г 60% этанола.

Перед началом работы к одному литру готовой питательной среды добавляют 9 мл 0,1% спиртового раствора бромкрезолового зеленого и 3 мл 0,2% спиртового раствора метилового красного. Растворы 2 и 3 используются только свежеприготовленные.

Данный способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример №1.

0,1% спиртового раствора бромкрезолового зеленого - 5,0 мл, 0,2% спиртового раствора метилового красного - 2,5 мл, пептона - 0,3 г, ЭКД - 4,0 г, калия дигидрофосфата - 8,0 г, едкого натра - 1,2 г, натрия хлорида - 3,0 г, воды дистиллированной - до 1000 мл, pH - 6,3.

Далее способ осуществляется, как описано выше.

Пример №2.

0,1% спиртового раствора бромкрезолового зеленого - 9,0 мл, 0,2% спиртового раствора метилового красного - 3,0 мл, пептона - 0,5 г, ЭКД - 4,5 г, калия дигидрофосфата - 8,7 г, едкого натра - 1,4 г, натрия хлорида - 5,0 г, воды дистиллированной - до 1000 мл, рН - 6,7.

Далее способ осуществляется, как описано выше.

Пример №3.

0,1% спиртового раствора бромкрезолового зеленого - 10,0 мл, 0,2% спиртового раствора метилового красного - 4,0 мл, пептона - 1,0 г, ЭКД - 5,0 г, калия дигидрофосфата - 9,2 г, едкого натра - 1,5 г, натрия хлорида - 5,5 г, воды дистиллированной - до 1000 мл, pH - 7,1.

Далее способ осуществляется, как описано выше.

Данные по накопительным свойствам среды представлены в таблице 1, из которой видно, что рост S.sonnei зарегистрирован до разведения 10^-7 на среде с минимальным и оптимальным содержанием компонентов. На среде с максимальным содержанием компонентов рост S.sonnei регистрировался в разведении 10^-6. Рост S.flexneri отсутствовал в разведениях 10^-6, 10^-7 на среде с минимальным содержанием компонентов и в разведениях 10^-7 на среде с максимальным содержанием компонентов, в то время как на среде с оптимальным содержанием компонентов рост данного тест-штамма был отмечен в разведении 10^-7.

Рост Е.coli (предполагаемая сопутствующая микрофлора) отмечен до разведения 10^-7 на среде с минимальным содержанием компонентов, на среде с оптимальным и максимальным содержанием - в разведении 10^-5.

Таким образом, оптимальным количественным соотношением ингредиентов для роста бактерий рода Shigella и подавления сопутствующей микрофлоры является:

Ингредиенты Количество 0,1% спиртовой раствор бромкрезолового зеленого 9,0 мл 0,2% спиртовой раствор метилового красного 3,0 мл Пептон ферментативный 0,5 г Экстракт кормовых дрожжей 4,5 г Калия дигидрофосфат 8,7 г Едкий натр 1,4 г Натрия хлорид 5,0 г Вода дистиллированная до 1000 мл pH 6,70-6,85

Пример №4.

Чувствительность среды определяли по наибольшему разведению, из которого при пересеве на твердые питательные среды наблюдался рост тест-штаммов. Тест-штаммы - S.flexneri 1а8516, S.sonnei, Е.coli 3912/41 получены из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Сравнительная характеристика чувствительности двух сред накопления представлена в таблице 2.

Из таблицы видно, что опытная среда является более чувствительной, чем селенитовая (среда сравнения), так как рост тест-штаммов в ней наблюдался до разведения 10^-7, в то время как на селенитовой среде рост S.flexneri отсутствовал в разведении 10^-5, рост S.sonnei наблюдался только до разведения 10^-6. Рост Е.coli отсутствовал в обеих средах накопления в разведении 10^-5.

Пример №5.

Эффективность накопления шигелл на двух средах исследовали на примере тест-штаммов: S.flexneri и S.sonnei. Посев микроорганизмов проводился в селенитовую и опытную среды в виде микробной взвеси, приготовленной по стандартному образцу мутности ОСО №517-1V 2010 года выпуска, из разведений от 10^-4 до 10^-7 с последующим пересевом на мясопептонный агар.

Результаты сравнения эффективности накопления шигелл, выросших при инкубации на опытной и селенитовой средах, представлены в таблице 3.

Приведенные данные свидетельствуют, что эффективность накопления тест-штамма S.sonnei на опытной среде в 10⁷ раз выше, чем на селенитовой, a S.flexneri - в 10⁶ раз, соответственно.

Пример №6.

Изучена возможность практического применения среды для накопления и выделения шигелл из воды поверхностных водоемов с различной степенью загрязнения. Количественное определение шигелл проводили путем посева воды в двух параллельных рядах в объемах: 100 мл, 10 мл, 1 мл и т.д., в зависимости от степени биологического загрязнения водного объекта.

Всего было изучено 28 проб р. Дон. С помощью опытной среды выделено 3 штамма S.flexneri, при использовании селенитовой среды не было выделено ни одного штамма шигелл.

Таким образом, предлагаемая питательная среда обеспечивает повышение накопительных свойств питательной среды за счет снижения доли ингибирующего воздействия на рост шигелл и значительного подавления роста сопутствующей микрофлоры, в том числе E.coli.

Таблица 2 Сравнение чувствительности сред накопления для выделения шигелл Тест-штаммы Опытная среда Селенитовая среда разведения разведения -5 -6 -7 -5 -6 -7 S.flexneri + + + - - - S.sonnei + + + + + - E.coli + - - - - -

Таблица 3 Эффективность накопления шигелл при культивировании на опытной   и селенитовой средах   Штаммы разведения Количество бактериальных клеток в     1 мл       опытная селенитовая S.flexneri -5 Сплош. рост 0   -6 Сплош. рост 0   -7 5×10⁶ 0 S.sonnei -5 Сплош. рост 5×10⁷   -6 Сплош. рост 8   -7 3×10⁸ 0

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к санитарной микробиологии. Предложена питательная среда для выделения бактерий рода Shigella из водных объектов. Питательная среда содержит следующие компоненты: 0,1% спиртовой раствор бромкрезолового зеленого - 9,0 мл; 0,2% спиртовой раствор метилового красного - 3,0 мл; пептон ферментативный - 0,5 г; экстракт кормовых дрожжей - 4,5 г; калия дигидрофосфат - 8,7 г; едкий натр - 1,4 г; натрия хлорид - 5,0 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; pH среды составляет 6,70-6,85. Изобретение позволяет повысить накопительные свойства питательной среды и упростить ее состав. 3 табл., 6 пр.

Питательная среда для выделения бактерий рода Shigella из водных объектов, содержащая пептон ферментативный, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что содержит экстракт кормовых дрожжей, калия дигидрофосфат, едкий натр, натрия хлорид, бромкрезоловый зеленый и метиловый красный в следующих количествах:
0,1% спиртовой раствор бромкрезолового зеленого 9,0 мл 0,2% спиртовой раствор метилового красного 3,0 мл Пептон ферментативный 0,5 г Экстракт кормовых дрожжей 4,5 г Калия дигидрофосфат 8,7 г Едкий натр 1,4 г Натрия хлорид 5,0 г Вода дистиллированная до 1000 мл,