ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI SEROVAR O164:H-, ДЕПОНИРУЕМЫЙ В ГОСУДАРСТВЕННОЙ КОЛЛЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР "ГКПМ-ОБОЛЕНСК" ПОД НОМЕРОМ В-11809 Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии (бактериологии), а именно к разделам биохимическая, серологическая и молекулярно-генетическая идентификация штаммов Escherichia coli (Е. coli), вирулентность и патогенность микроорганизмов.

Энтероинвазивные Е. coli (EIEC) широко распространены в странах с низким уровнем доходов, клинически протекают как бактериальная дизентерия.

Патогенез EIEC-инфекции связан со способностью бактерий проникать в слизистую оболочку толстой кишки человека, что обусловлено экспрессией хромосомных и плазмидных генов. После инвазии в эпителиальные клетки толстой кишки EIEC реплицируются внутриклеточно и распространяются в соседние клетки, вызывая воспалительное разрушение кишечного эпителиального барьера, что проявляется характерным синдромом дизентерии: наличием крови, слизи и лейкоцитов в стуле. Эта патогруппа характеризуется способностью к эпителиальной инвазии, которая подтверждается тестом Шереня - вызывают кератоконъюктивит у морских свинок.

Таксономическая близость EIEC и Shigella spp., идентичность патогенеза, факторов и генов вирулентности проявляется в схожести клинических проявлений заболевания. Инфекционная доза EIEC значительно выше, чем у Shigella, а заболевания, вызываемые EIEC, в некоторых случаях протекают в более легкой форме.

Важным для полного фенотипического выражения патогенности Shigella spp. и EIEC является наличие основного гена инвазивного плазмидного антигена Н (ipaH), расположенного на хромосоме в составе большой плазмиды F-типа (pINV), отвечающего за размножение и распространение возбудителя в и вне эпителиальных клеток, а также в просвете кишки. Наличие pINV характерно только для Shigella spp. и EIEC, ее потеря - очень редкое явление, которое определяет авирулентный фенотип штамма. Другие гены вирулентности, расположенные на внехромосомных плазмидах, играют вспомогательную роль в обеспечении взаимодействия возбудителя с эпителием и могут быть неравномерно распределены в штаммах Shigella spp. и EIEC, они кодируют белки, влияющие на индукцию генов инвазии в ответ на высокое осмотическое давление в толстой кишке (ial) и регуляцию транскрипции генов инвазивности (invE). Детекция только генов, расположенных на внехромосомных плазмидах, может приводить к ложноотрицательным результатам, так как штаммы часто теряют эти плазмиды.

Первое сообщение о EIEC датируют 1947 г. (Ewing 1947). Изначально они были определены как «paracolon bacillus», но позже идентифицированы как Е. coli 0124. В 1950-х и 1960-х годах, выделенные при дизентерии Е. coli, вызывающие экспериментальный кератоконъюнктивит у морских свинок, были идентифицированы как Shigella manolovi, Shigella sofia и S. metadysenteriae, позднее были переименованы в EIEC как O164. Биохимические особенности EIEC были впервые описаны в 1967 г., подобно Shigella, большинство штаммов EIEC не декарбоксилируют лизин, не ферментируют лактозу и, как правило, неподвижны. За счет таксономической близости (один геновид) EIEC и Shigella spp. обладают несколькими общими фенотипическими и генотипическими характеристиками, что затрудняет их дифференциацию, особенно в случае О-антигенных связей. В результате этого нередко происходит искажение интерпретации эпидемиологической информации, усложняя оценку реального бремени инфекций, обусловленных EIEC.

С EIEC ассоциировано ограниченное число сероваров, а именно O28ас: Н-, O29: Н-, ОП2ас: Н-, O115: Н-, O121: Н-, O124: Н-, O124: Н7, O124: ИЗО, O124: Н32, O135: Н-, O136: Н-, O143: Н-, O144: Н-, O144: Н25, O152: Н-, O159:Н-, O159.-Н2, O164: Н-, O167: Н -, O167: Н4, O167: Н5, O173: Н-, O96: Н19.

Отсутствие к настоящему времени контрольных штаммов для фенотипических и молекулярных методов идентификации Escherichia coli, принадлежащих к серологической группе O164, обусловило необходимость депонирования штамма Escherichia coli серовара O164:Н-В-11809.

Полная ферментативная характеристика, расшифровка антигенной формулы, детекция генов и факторов патогенности и вирулентности является необходимым условием правильности эпидемиологических заключений, от которых зависит эффективность профилактической и противоэпидемической работы. Предложенный штамм Escherichia coli O164:Н-В-11809, характеризующийся наличием генов wzy₁₆₄ и wzx₁₆₄ и отсутствием fliC, определяющих серогрупповую и серотиповую принадлежность, морфологическими (фенотипически неподвижный) и биохимическими свойствами (ферментация лактозы) и присутствием генов, кодирующих факторы патогенности ipaH, ipaD, ial, senB, sigA, VirF, может быть использован в качестве контрольного тест-штамма.

Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению является эталонный штамм Escherichia coli O124:Н- (CDC EDL 1284 [929-78], находящийся в Американской коллекции АТСС под номером 43893™, который содержит высокомолекулярную плазмиду, ответственную за энтероинвазивность [https://www.atcc.org/products/43893]. В отличие от него, предлагаемый в качестве изобретения штамм Escherichia coli O164:Н-В-11809, отличается антигенными свойствами (О-антиген 164), ферментативной активностью (лактозаположительный), а также помимо гена VirF, наличием дополнительных генов вирулентности (ipaH, ipaD, ial, senB, sigA).

Предлагаемый в качестве изобретения штамм Escherichia coli O164:Н-В-11809 будет способствовать расширению аналитических и диагностических возможностей лабораторий, использующих для диагностики не только классические бактериологические, но и современные генетические методы исследования.

Изобретение направлено на разработку контрольного тест-штамма Escherichia coli O164:Н-В-11809, необходимого для качественного проведения бактериологических и молекулярно-генетических исследований, необходимых для подтверждения этиологической значимости штаммов, предъявляемых СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

Авторами получен контрольный штамм, для бактериологической и молекулярно-генетической идентификации патогенного варианта Е. coli, принадлежащего к патогруппе энтероинвазивных диареегенных Escherichia coli серологическому варианту (серовару) O164:Н-, использование которого поможет минимизировать ошибки при этиологической расшифровке острых кишечных инфекций, позволит получать достоверные результаты необходимые для рациональной терапии, проведения целенаправленных профилактических и противоэпидемических мероприятий, а также для сравнительного изучения генетического родства штаммов данной патогруппы.

Заявляемый штамм выделен в лаборатории клинической микробиологии (бактериологии) Централизованной многофункциональной лаборатории ГОБУЗ «Мурманская областная клиническая больница им. Баяндина» от пациента с диагнозом «острый гастроэнтерит». Идентифицирован до вида Е. coli серогруппы O164 бактериологическим и серологическим методами. Полная антигенная характеристика штамма Е. coli O164:Н- установлена при анализе данных полногеномного секвенировании на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeqReagentKit v2 и Nextera XT (Illumina, США) при помощи веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiologv.org). Поиск генетических детерминант вирулентности проводили с использованием онлайн сервиса VirulenceFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/), принадлежность к сиквенс-типу - MLST-2.1 Server (https://cge.cbs. dtu.dk/services/MLST/).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-11809.

Характеристика штамма Escherichia coli O164:Н-В-11809

Морфологические признаки: грамотрицательные палочки с закругленными концами, не образуют спор, капсулу, неподвижные.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, IV группа патогенности согласно СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

Культуральные свойства: факультативный анаэроб, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, не прихотлив к питательным средам. Температурный оптимум 37°С при рН 7,2-7,4. На жидких средах дает обильный рост при значительном помутнении среды. Пристеночное кольцо и пленку на поверхности среды не образует.На плотных питательных средах (Эндо, Мак Конки, Плоскирева, Левина) колонии круглые выпуклые, средней величины, влажные с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем, красного цвета (лактозаположительные).

Антигенная характеристика: по результатам реакции агглютинации на стекле с сывороткой диагностической эшерихиозной ОКА поливалентной -отрицательная. Реакции агглютинации с иммуноглобулином диагностическим эшерихиозным типовым O164:К- и сывороткой эшерихиозной О-групповой адсорбированной O164 - положительные (агглютинат крупнохлопчатый, хорошо выражен, полное просветление капли с живой и прогретой культурой). Полная антигенная формула Escherichia coli O164:К:Н-.

Основные свойства штамма:

- характеризуется типичными морфологическими и нехарактерными ферментативными свойствами EIEC (ферментирует до кислоты без газа лактозу, положительная реакция в тесте с β-галактозидазой);

- отсутствие Н-антигена;

- имеет плазмиду (VirF) и гены инвазивности (ipaH, ipaD, ial), а также секретируемые протеазы (senB, sigA), оказывающие цитопатическое действие на клетки.

- является возбудителем острой кишечной инфекции.

Изобретение реализуется следующим образом:

Пример 1. Определение морфологических и ферментативных свойств бактериологическим методом штаммов Escherichia coli O164:Н-

При определении подвижности посев производили уколом петли по центру столбика 0,3-0,4% полужидкого агара, не доходя до дна пробирки. Штамм характеризовался ростом строго по уколу без помутнения среды (подвижные штаммы растут диффузно, вызывая помутнение среды, слабоподвижные штаммы вызывают помутнение отдельных участков агара вблизи укола). Для определения ферментации лактозы использовали полужидкую среду Гисса, посев производили уколом петли в центр столбика. Учет результатов проводили по изменению цвета среды, в зависимости от индикатора, после инкубации через 18-20 часов при температуре 37°С. Штамм характеризовался способностью к ферментации лактозы до кислоты без газа. При определении декарбоксилазы лизина параллельно с посевом в среду с аминокислотой производили посев в контрольную пробирку, содержащую основу без аминокислоты. После посева во все пробирки, вносили стерильное вазелиновое масло слоем 4-5 мм. Учет результатов проводили по изменению цвета среды после инкубации 18-20 часов при температуре 37°С.

Стабильность морфологических и ферментативных свойств штамма Escherichia coli O164:Н- проверялась путем трехкратного повторения с питательными средами различных производителей: ФБУН ГНЦ ПМБ (Россия), НИЦФ (Россия), а также тест систем Энтеро тест 24 и Энтеро-Рапид 24, Эрба Лахема, Чехия). Установлено, что штамм давал стабильные результаты на питательных средах и тест-системах всех производителей.

Пример 2. Принадлежность штамма Escherichia coli O164:Н- к патогруппе энтероинвазивных диареегенных Е. coli методом ПЦР с гибридизационно флюоресцентной детекцией

ПЦР проводили с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) СХТ-1000 (Bio-Rad, США). Для выявления и дифференциации ДНК диареегенных Е. coli использовали набор реагентов «АмплиСенсÒЭшерихиозы - FL» (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Интерпретацию результатов проводили на основании уровня флуоресцентных сигналов соответствующих каналов HEX, FAM или ROX. Принадлежность штамма к патогруппе EIEC устанавливали согласно инструкциям и методическим рекомендациям производителя. Штамм стабильно давал уровень флюоресценции выше порогового значения по каналу ROX в ПЦР- смеси -2.

Пример 3. Детекция генов, вирулентности методом ПЦР с электрофоретической подвижностью

Маркеры вирулентности выявляли в ПЦР со специфическими праймерами к детекции плазмиды VirF, хромосомным (ial) и плазмидным {ipaH) генам патогенности, кодирующим способность к инвазии. Выделение ДНК из штамма Shigella flexneri 2а и контрольного тест-штамма Escherichia coli O164:Н- В-11809 проводили с использованием наборов «InstaGeneMatrix» (BioRad, США), «АмплиПраймРИБО-преп» (НексБио, Россия) согласно инструкциям производителей и методом кипячения. Гены патогенности амплифицировали с помощью специфических праймеров virFl/virF2, PR1/PR2 и ipaH14a/ipaH14b, синтезируемые ЗАО «Евроген», (Россия). В состав 25 мкл ПЦР-смеси входили 10 мкл Taq MasterMix («ThermoFisher», США), по 1 мкл каждого праймера, 9 мкл Н2О и 2 мкл бактериальной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (BioRad, США) согласно протоколу: начальная денатурация 95°С -15 мин; затем 35 циклов: 95°С -15 сек, 55°С -20 сек; финальная инкубация - 37°С -3 мин. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров молекулярного веса использовали GeneRuler 100 bp DNALadder «Fermentas», (Литва). Исследуемые штаммы Escherichia coli O164:Н- и Shigella flexneri 2а имели плазмиду и два гена инвазивности.

Стабильность присутствия генов патогенности, кодирующих способность к инвазии тест-штамма Escherichia coli O164:Н- В-11809 подтверждалась повторным проведением исследования. Установлено, что штамм Escherichia coli O164:Н- В-11809 давал стабильные результаты независимо от способа выделения ДНК, состава реакционной смеси и метода ПЦР.

Пример 4. Определение отсутствия Н-антигена молекулярным методом

Выделение ДНК из исследуемого штамма Escherichia coli O164:Н- В-11809 проводили с использованием набора QIAampDNAMiniKit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Подготовку геномных библиотек для полногеномного секвенирования проводили путем синтеза с обратным термированием «lllumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов проводили с помощью секвенатора «Miseq», (США). Оценку качества полученных ридов проводили с помощью программы FastQC. Для установления серотиповой принадлежности штаммов, полученные нуклеотидные последовательности были анализированы с использованием веб-базы SerotypeFinder fhttp://www.genomicepidemiology.org).

Стабильность отсутствия гена fliC, кодирующего продукцию Н-антигена в геноме Escherichia coli O164:Н- В-11809 подтверждалась повторным секвенированием и анализом нуклеотидных последовательностей.

Пример 5. Детекция сиквенс-типа ST 270 методом анализа полногеномного секвенирования

Выделение ДНК из исследуемого штамма Escherichia coli O164:Н- fill 809 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Подготовку геномных библиотек для полногеномного секвенирования проводили путем синтеза с обратным термированием «Illumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов проводили с помощью секвенатора «Miseq», (США). Оценку качества полученных ридов проводили с помощью программы FastQC. Принадлежность к ST 270 установлена при анализе данных полногеномного секвенирования, с использованием платформы MLST-2.1 Server (http://www.genomicepidemiology.org).

Полногеномное секвенирование штаммов, использование стандартизованных методов анализа и международных баз данных, содержащих подробную информацию о генетической характеристике возбудителей, позволяют легко проводить детекцию международных клонов, а также оценивать их эволюцию и географическое распространение.

Для обеспечения достоверной лабораторной диагностики эшерихиозов, а также микробиологической диагностики острых кишечных инфекций эшерихиозной этиологии необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования. Предлагаемый штамм Escherichia coli O164:Н-В-11809 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать бактериологические (определение морфологических, ферментативных, антигенных свойств) и молекулярные исследования (детекция генов, определяющих серогрупповую принадлежность и патогенность/вирулентность) энтероинвазивных штаммов Е. coli.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм Escherichia coli serovar O164:Н-В-11809, характеризующийся наличием генов, кодирующих синтез O-антигена 164 (wzy₁₆₄, wzx₁₆₄), ответственных за инвазию: ipaH, ipaD; продукцию энтеротоксина senB; гомолога протеазы Shigella IgA - sigA и регулятора транскрипции вирулентности - virF. Штамм характеризуется отсутствием гена fliC, ответственного за синтез Н-антигена; принадлежит к сиквенс-типу ST270. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Предложенный штамм может быть использован в качестве контрольного тест-штамма при детекции энтероинвазивных Escherichia coli (EIEC); контрольного тест-штамма для индикации антигена O164 молекулярным методом (детекция генов wzy₁₆₄, wzx₁₆₄); для сравнительного изучения генетического родства и дифференции штаммов EIEC, вызывающих острые кишечные инфекции. 5 пр.

Штамм бактерий Ercherichia coli O164:Н-, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-11809, используемый в качестве контрольного тест-штамма при детекции энтероинвазивных диареегенных E.coli (EIEC) и сравнительного изучения генетического родства штаммов данной патогруппы.