ОПОСРЕДУЮЩИЕ ТРАНСПОРТ КОЛЛОИДНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61K47/48 

Изобретение относится к связанным с транспортными посредниками коллоидам, которые могут содержать лекарственные соединения или флуоресцентные маркеры, к способу их получения и к фармацевтической композиции, содержащей такие соединения.

Ковалентное связывание с коллоидами позволяет входить посредством фагоцитоза в клетки иммунной системы веществам, которые без такой модификации не могли бы поглощаться, а если бы и могли, то лишь в очень незначительных количествах. В ЕР 1230935 А1 описано химическое присоединение активных с медицинской точки зрения веществ к полисахариду с образованием линкера. Поглощение веществ соответствующим образом специализированными клетками ретикулогистиоцитарной системы показано для широкого круга коллоидов и частиц. Однако введение больших молекул в клетки организма, которые не специализированы для фагоцитоза, является проблемой. Кроме того, частицы и коллоиды, фагоцитированные макрофагами, после поглощения клеткой очень быстро попадают в лизосомы, где они расщепляются различными литическими ферментами. Ферментативный потенциал лизосом высок; соответственно, широкий спектр лекарственных соединений быстро расщепляется лизосомальными ферментами. Про Chlamydia trachomatis известно, что эта бактерия поглощается эукариотическими эпителиальными клетками без ферментативного расщепления в лизосомах. Это поглощение может быть значительно уменьшено в присутствии гепаринов или гепаринсульфата. Stephens et al. (Infection and Immunity, March 2000, p.1080-1085, Vol. 68, No. 3) показали, что этот эффект основан на блокировании гепарин-связывающего домена.

С другой стороны, авторы показывают, что полистирольные микросферы поглощаются эукариотическими клетками путем эндоцитоза после покрытия их гепарином. Гепарин сам связывается с широким спектром ферментов. Пациенты, имеющие повышенную активность супероксиддисмутазы в сыворотке крови, часто обладают мутантным вариантом фермента (CHU et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2006; 26: 1985).

В мутантном варианте (R213G) присутствует глицин вместо аминокислоты аргинина на позиции 213. Из-за этого связывание фермента с гепарином невозможно. Вследствие этого, страдающие пациенты имеют повышенную активность фермента, поскольку фермент в основном присутствует в сыворотке, а не в клетках. Для носителей такого генетического дефекта это означает в 2,3 раза более высокий риск возникновения ишемической болезни сердца. В EP 083768 A1 описаны прямые гепарин-белковые конъюгаты, в которых концевая альдоза гепарина связана с N-концевой аминогруппой серпина для усиления эффекта серпинов на коагуляцию крови и синдромы расстройства дыхания. После связывания с гепаринами белки и ферменты очень быстро выводятся из сыворотки. Небольшие белки размером менее 70 кДа исчезают практически полностью уже в процессе первого прохождения через почки. Кроме того, как известно, многие белки имеют проблемы со стабильностью и растворимостью, на которые может положительно повлиять ковалентное связывание с водорастворимым полисахаридом.

Гепарин принадлежит к группе глюкозаминогликанов, которые состоят из линейных цепей из сульфатированных дисахаридных единиц. Каждая дисахаридная единица состоит из одной гексуроновой кислоты, которая является или глюкуроновой или идуроновой кислотой, и 2-амино-2-дезокси-D-глюкозы или N-сульфо-D-глюкозамина. Подобно полисахаридам, гепарин и глюкозаминогликаны имеют свободную альдегидную группу в концевой части. Гепарин находится внутри клеток, почти исключительно в тучных клетках. Однако более высокосульфатированные гепарины, или гепаринсульфаты, встречаются почти повсеместно на клеточных мембранах высших млекопитающих, независимо от вида органов.

Антикоагулянтный эффект гепарина основан прежде всего на его сродстве к ингибитору сериновой протеазы антитромбину III. Наименьший из гепаринов, который обладает таким эффектом на AT III, содержит 5 сахаридных единиц с 3-O-сульфатной группой на глюкозаминовой группе. Этот пентасахарид может образовывать комплекс гепарин/AT III, который ингибирует фактор свертывания Xa. Тромбин также может ингибироваться путем связывания со специфическими гепариновыми структурами, которые, однако, не присутствуют на пентасахариде, имеющем только 5 сахаридных единиц. Для ингибирования тромбина необходимы гепариновые соединения, имеющие по меньшей мере 18 сахаридных единиц.

Молекулярный размер и степень сульфатации имеют решающее значение не только для избирательного действия гепарина на факторы свертывания крови, но и для взаимодействия с широким кругом эндогенных цитокинов и факторов роста. Для взаимодействия гепарина с фактором роста фибробластов (FGF) необходимо как минимум 18 глюкозаминогликановых единиц со специфической сульфатацией атома кислорода, находящегося на C2. Сульфатированные гепарины от 8 сахаридных единиц оказывают ингибиторный эффект на ангиогенез. Для этих сульфатированных октасахаридов обсуждается ингибирование ангиогенеза в опухолевых клетках. В то же время, эти гепарины, очевидно, не влияют на свертываемость крови. Молекулярный размер и химические свойства, такие как количество и локализация сульфатных, карбоксильных и аминогрупп, оказывают решающее влияние на эффект гепаринов. Сульфатные группы и, что менее важно, карбоксильные группы идуроновой и глюкуроновой групп являются причиной того, что гепарин является одной из наиболее сильно электроотрицательно заряженных молекул в организме млекопитающих. Молекулярный размер, а также количество и положение сульфатных и карбоксильных групп создают определенную зарядную матрицу или определенное распределение зарядов на молекулах гепарина. Определенное распределение зарядов играет важную роль для сродства соединений в отношении прокоагулянтных белков и протеаз, а также в отношении гепарин-связывающих доменов эндотелиальных клеток. Транспортно-посредническая функция гепаринов, которая проявляется на клеточных мембранах, еще более сильно зависит от структуры зарядов глюкозаминогликана. Вследствие этого, ковалентное включение гепаринов в водорастворимые полисахариды, как транспортных посредников, существенно отличается от включения активных с медицинской точки зрения соединений. По возможности, гепарин должен быть связан с коллоидом таким образом, чтобы сайт связывания с определенным числом дисахаридных единиц и зарядов стереоизбирательно соответствовал гепарин-связывающему домену клеток. Это означает, что этот сегмент гепарина остается химически несвязанным и, кроме того, имеет нестерические препятствия со стороны остальной молекулы. В данном случае, как и в случае со специфическим эффектом гепарина на AT III и тромбин, длина цепи и число сульфатированных единиц гексуроновой кислоты и аминодезоксиглюкозы, свободно выступающих из полисахарида, имеют большое значение. Кроме того, существуют указания на то, что сегменты молекулы гепарина, имеющие отношение к гепарин-связывающим доменам, обнаружены преимущественно в середине молекулы гепарина. Часть молекулы, используемая для описанного соединения со связывающими доменами, сильно электроотрицательно заряжена из-за карбоксильных и сульфатных групп. Блокировка или нарушение этой стереоспецифически соответствующей зарядной матрицы ковалентным связыванием с полисахаридом с помощью линкера должно быть, по возможности, предотвращено на этих участках.

Будучи строго линейным глюкозаминогликаном, гепарин имеет функциональные группы, которые могут быть использованы для связывания с другими молекулами. В области идуроновой и глюкуроновой кислоты карбоксильные группы присутствуют на C6. Существуют гидроксильные группы на C2 и C3, и C1 первой сахаридной единицы. Каждая вторая сахаридная группа несет аминогруппу на атоме С2. Эта аминогруппа и карбоксильная группа могут быть сульфатированы. И наконец, гепарин имеет альдегидную группу на концевом фрагменте.

Известно, что точечные мутации в некоторых генах, кодирующих белки, приводят к замене диаминомонокарбоновых кислот другими аминокислотами. В некоторых из этих случаев (супероксиддисмутаза) это изменение аминокислотной последовательности сопровождается потерей способности связываться с гепаринсульфатами, в результате чего белок больше не транспортируется в клетку. Эти результаты также показывают, что включение гепаринов в макромолекулы, как транспортных посредников, то есть с целью регулирования прохода через клеточные мембраны, зависит от региоселективных условий на части макромолекулы. В данном случае, утрата аминогрупп, не связанных пептидными связями, означает потерю способности встраиваться в транспортный посредник гепарин. В медицинской практике часто пытаются предотвратить образование сгустков крови на имплантатах путем неспецифического ковалентного связывания с гепарином.

Для введения активных с медицинской точки зрения веществ в определенные органы и клеточные системы организма должны быть выполнены следующие условия:

1. Поглощение связанного лекарственного средства также осуществляется в клетках, не специализированных для фагоцитоза.

2. После прохождения через внешнюю мембрану клетки связанное лекарственное средство не должно поглощаться лизосомами и не должно разрушаться ферментами.

3. Лекарственный комплекс, состоящий из лекарственного средства, химически связанного с транспортным посредником и/или коллоидом, должен быть растворим в воде и циркулировать в крови в течение достаточного периода времени.

4. Лекарственный комплекс не должен оказывать никакого влияния на свертываемость крови.

Удивительно, но было обнаружено, что связывание транспортного посредника с коллоидом (коллоидно-активным соединением) решает вышеуказанные проблемы и служит, в частности, подходящей транспортной системой для лекарственных средств и/или флуоресцентных маркеров, ковалентно присоединенных к нему. Это относится, в частности, к случаю, когда коллоид и транспортный посредник стереоизбирательно связаны друг с другом. Кроме того, к удивлению было обнаружено, что продукт связывания может связываться с мембраносвязанными и внутриклеточными связывающими доменами, если стереоспецифические структуры соединения транспортный посредник/коллоид остаются свободными для ассоциации и связывания с клеточными связывающими доменами.

Настоящее изобретение относится к соединению общей формулы (I)

,

где

Т представляет собой транспортный посредник;

Р представляет собой коллоидно-активное соединение;

Z представляет собой первый линкер, с помощью которого Т и Р ковалентно связаны друг с другом; и

n представляет собой целое число, по меньшей мере равное 1;

и где транспортный посредник Т и/или коллоид Р несет m групп -(L-A), где

А представляет собой активное с медицинской точки зрения вещество или флуоресцентный маркер;

L представляет собой второй линкер, посредством которого Р ковалентно связан с A, или посредством которого T ковалентно связан с A; и

m представляет собой целое число, равное 0 или по меньшей мере 1.

Предпочтительно, транспортный посредник T имеет по меньшей мере один сайт связывания для соединения с клеточными связывающими доменами.

В соответствии с изобретением, транспортные посредники T отличаются от коллоидов P.

Транспортные посредники T по настоящему изобретению способствуют проникновению в клетки.

Транспортный посредник T представляет собой гликан, более предпочтительно, выбранный из группы, состоящей из сиаловой кислоты, полисиаловой кислоты, нейраминовой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, маннозы, N-ацетилманнозы, N-пропанолманнозамина, фукозы, N-ацетилфукозы, галактозы, N-ацетилгалактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозы, гексоз, N-ацетилгексоз, керамидов, глюкозо-6-фосфата, маннозо-6-фосфата, глюкозилфосфатидилинозитола, ретиноевой кислоты, иммуноглобулинов, моноглицератов, диацилглицератов, сфингомиелина, бисфосфонатов, гликопротеинов и глюкозаминогликанов.

Глюкозаминогликаны или производные глюкозаминогликанов оказались особенно подходящими транспортными посредниками T.

Вследствие этого, в предпочтительном варианте осуществления транспортный посредник T выбирают из группы, состоящей из гепарина и гепаринсульфата, в частности гепарина или гепаринсульфата, имеющих менее 6 сахаридных единиц. Гепарины, имеющие менее 6 сахаридных единиц, в качестве транспортных посредников имеют то особое преимущество, что при использовании таких гепаринов можно в значительной степени избежать возможной индукции аутоантител.

Коллоидно-активное соединение P (также для простоты в дальнейшем называемое «коллоид P») предпочтительно выбирают из группы, состоящей из амилоз, амилопектинов, ацеманнанов, арабиногалактанов, галактоманнанов, галактоглюкоманнанов, ксантанов, каррагенанов, крахмала и модифицированного крахмала.

Модифицированные крахмалы оказались особенно подходящими. Крахмалы можно модифицировать, например, путем гидроксиалкилирования или эстерификации. Кроме того, крахмалы можно также аминировать, например, путем восстановительного аминирования.

Удивительно, но оказалось, что аминирование коллоида P путем восстановительного аминирования может приводить к образованию аминированных коллоидов, в частности модифицированных крахмалов, таких как аминированный гидроксиэтилкрахмал или аминированный карбоксиметилкрахмал, которые могут включаться в транспортные посредники с высокой стереоизбирательностью таким образом, что полученное соединение очень похоже на соединения, поглощаемые клетками организма из комплексов с транспортными посредниками.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения связывание транспортного посредника и коллоида происходит стереоизбирательно. Кроме того, предпочтительно, если соединение активного с медицинской точки зрения вещества или флуоресцентного маркера с коллоидом и/или транспортным посредником также происходит стереоизбирательно.

В предпочтительном варианте осуществления коллоид P выбирают из группы, состоящей из гидроксиалкилкрахмалов, этерифицированных крахмалов, карбоксиалкилкрахмалов, гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмала, аминированного гидроксиалкилкрахмала, аминированного гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмала и аминированного карбоксиалкилкрахмала.

Карбоксиалкилкрахмалы предпочтительно выбирают из карбоксиметилкрахмала и карбоксиэтилкрахмала.

Преимущественно, другие специальные фрагменты, делающие возможным химическое связывание активного с медицинской точки зрения вещества или флуоресцентного маркера или транспортного посредника, например биотин, аминокислоты или фрагменты, несущие сульфидные группы, такие как цистеин, также можно включать в коллоиды.

Более предпочтительно, в соответствии с настоящим изобретением, коллоид P представляет собой модифицированный крахмал, выбранный из группы, состоящей из гидроксиэтилкрахмала или аминированного гидроксиэтилкрахмала, в частности гидроксиэтилкрахмала, аминированного путем восстановительного аминирования.

Гидроксиалкильные группы в гидроксиэтилкрахмале (HES) введены в молекулу для препятствования ферментативному расщеплению крахмала в сыворотке и для улучшения растворимости в воде. Степень замещения, DS, определяется как отношение общего количества замещенных мономерных единиц к общему количеству мономерных единиц. В дальнейшем степень замещения, DS, указывают при введении заместителей.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения коллоидно-активное соединение имеет средний молекулярный вес от 20000 до 800000 дальтон, предпочтительно от 25000 до 500000 дальтон, в частности от 30000 до 200000 дальтон.

Степень замещения, DS, модифицированных крахмалов, в частности гидроксиэтилкрахмала, предпочтительно составляет от 0,2 до 0,8, в частности от 0,3 до 0,6.

Что касается лекарственных средств A, можно использовать все вещества, которые можно включать в вышеупомянутые коллоиды и/или транспортные посредники T через линкер L.

Соединения по изобретению могут быть необязательно связаны с активными с медицинской точки зрения соединениями или флуоресцентными маркерами. Предпочтительно, активное с медицинской точки зрения соединение выбирают из группы, состоящей из антибиотиков, химиотерапевтических средств, цитостатиков, антигенов, олигонуклеотидов, медиаторов, ложных метаболических субстратов, анальгетиков и цитотоксических веществ.

Флуоресцентные маркеры предпочтительно выбирают из группы, состоящей из флуоресцеинизотиоцианата (FITC), фикоэритрина, родамина и 2-аминопиридина.

Помимо чистых активных с медицинской точки зрения веществ, флуоресцентные маркеры, например флуоресцеинизотиоцианат, можно также терапевтически использовать в связи с комплексом транспортный посредник/коллоид. Некоторые опухоли, как известно, экспрессируют мембраносвязанные связывающие домены в больших количествах, например, для того, чтобы получить доступ к сосудистой системе (рецепторы FGF). Маркировка комплексов транспортный посредник/коллоид по изобретению, специфичных для таких связывающих доменов, флуоресцентными маркерами, такими как флуоресцеинизотиоцианат (A.N. De Belder, K. Granath: Preparation and Properties of fluorescein-labelled dextrans, Carbohydrate Research, 30 (1973) 375-378) позволяет хирургу оптически определять участки органов, имеющие большее число клеток с такими связывающими доменами, после инъекции данного соединения (флуоресцентное изображение в ближней инфракрасной области спектра, NIRF).

В соединении формулы (I), (T-Z)_n-P, транспортный посредник T ковалентно связан с коллоидом P через первую линкерную группу Z. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкер Z представляет собой функциональную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, амидов карбоновых кислот, уретана, эфира и аминогрупп, либо содержит по меньшей мере одну такую функциональную группу. Более предпочтительно, ковалентная химическая связь T с P через линкер Z является обратимой, то есть может быть вновь расщеплена без труда, например, ферментативно.

Второй линкер L, через который коллоид P ковалентно связан с активным с медицинской точки зрения веществом или флуоресцентным маркером, или через который транспортный посредник ковалентно связан с активным с медицинской точки зрения веществом или флуоресцентным маркером, также соответствует первому линкеру Z по своей функциональности и конструкции. Что качается линкера L, особым преимуществом являлась бы возможность расщеплять его вновь без труда, например, ферментативно, что способствовало бы высвобождению активного с медицинской точки зрения вещества или флуоресцентного маркера.

Образование линкера Z или L можно осуществлять способами, описанными в известном уровне техники для образования сложных эфиров карбоновых кислот, амидов карбоновых кислот, уретанов, эфиров и аминов.

В предпочтительном варианте осуществления соединение по изобретению можно получать реакцией по меньшей мере одной свободной

изоцианатной группы (-NCO);

карбоксильной группы (-COOH);

галоидной группы карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I);

алкиленкарбоксильной группы (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10);

сложноэфирной группы (-COOR, где R = органический радикал);

эпоксигруппы;

или нуклеофильной уходящей группы;

исходного коллоида P со свободной

гидроксильной группой (-OH)

исходного транспортного посредника T с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник связан с m единицами -(L-A).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение по изобретению можно получать реакцией по меньшей мере одной свободной

гидроксильной группы (-OH)

исходного коллоида P со свободной

изоцианатной группой (-NCO);

карбоксильной группой (-COOH);

галоидной группой карбоновой кислоты (-CO-A, где A = Cl, Br или I);

алкиленкарбоксильной группой (-(CH₂)_q-COOH, где q = 1-10);

сложноэфирной группой (-COOR, где R = органический радикал);

эпоксигруппой;

или нуклеофильной уходящей группой;

исходного транспортного посредника T с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение по изобретению можно получать реакцией по меньшей мере одной свободной

аминогруппы (-NH₂)

исходного коллоида P со свободной

изоцианатной группой (-NCO);

карбоксильной группой (-COOH);

галоидной группой карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I);

алкиленкарбоксильной группой (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10);

сложноэфирной группой (-COOR, где R = органический радикал);

эпоксигруппой;

или нуклеофильной уходящей группой;

исходного транспортного посредника T с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления соединение по изобретению можно получать реакцией по меньшей мере одной свободной

изоцианатной группы (-NCO);

карбоксильной группы (-COOH);

галоидной группы карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I);

алкиленкарбоксильной группы (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10);

сложноэфирной группы (-COOR, где R = органический радикал);

эпоксигруппы;

или нуклеофильной уходящей группы;

исходного коллоида P со свободной

аминогруппой (-NH₂)

исходного транспортного посредника T с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Более предпочтительно, соединение по изобретению можно получать реакцией по меньшей мере одной свободной

гидроксильной группы (-OH); или

аминогруппы (-NH₂)

исходного коллоида P со свободной

изоцианатной группой (-NCO);

карбоксильной группой (-COOH);

галоидной группой карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I);

алкиленкарбоксильной группой (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10);

сложноэфирной группой (-COOR, где R = органический радикал);

эпоксигруппой;

или нуклеофильной уходящей группой;

исходного транспортного посредника T с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

В соответствии с настоящим изобретением, нуклеофильные уходящие группы предпочтительно выбирают из группы галоидов и тозилатов.

Кроме того, соединения по изобретению можно получать реакцией диамина общей формулы II

R¹(-NH₂)₂ (II)

где R¹ выбирают из

одинарной связи;

линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных, алифатических или алициклических углеводородных групп с 1-22 атомами углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп с 5-12 атомами углерода в арильной группе, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп с 3-8 атомами углерода в гетероарильной группе и одним или двумя гетероатомами, выбранными из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами;

со свободной функциональной группой исходного транспортного посредника T и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида P, которые независимо выбирают из

изоцианатной группы (-NCO);

карбоксильной группы (-COOH);

галоидной группы карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I);

алкиленкарбоксильной группы (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10);

сложноэфирной группы (-COOR, где R = органический радикал);

эпоксигруппы;

или нуклеофильной уходящей группы;

с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Подходящие диамины включают, например, 1,2-диаминоэтан, 1,2- или 1,3-диаминопропан, 1,2-, 1,3- или 1,4-диаминобутан, 1,5-диаминопентан, 2,2-диметил-1,3-диаминопропан, гексаметилендиамин, 1,7-диаминогептан, 1,8-диаминооктан, триметил-1,6-диаминогексан, 1,9-диаминононан, 1,10-диаминодекан, 1,12-диаминододекан, 1,2-диаминоциклогексан, 1,4-диаминоциклогексан, 1,3-циклогексанбис(метиламин), 1,2-фенилендиамин, 1,3-фенилендиамин, 1,4-фенилендиамин, 4,4'-этилендианилин, 4,4'-метилендианилин, 4,4'-диаминостилбен, 4,4'-тиодианилин, 4-аминофенилдисульфид, 2,6-диаминопиридин, 2,3-диаминопиридин, 3,4-диаминопиридин, 2,4-диаминопиридин, 4,5-диаминопиридин, 4,6-диаминопиридин.

Кроме того, в следующем варианте осуществления настоящего изобретения соединения по изобретению можно получать реакцией диола общей формулы III

R²(-OH)₂ (III),

где R² выбирают из

линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных, алифатических или алициклических углеводородных групп с 2-22 атомами углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп с 5-12 атомами углерода в арильной группе, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп с 3-8 атомами углерода в гетероарильной группе и одним или двумя гетероатомами, выбранными из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами;

со свободной функциональной группой исходного транспортного посредника T и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида P, которые независимо выбирают из

изоцианатной группы (-NCO);

карбоксильной группы (-COOH);

галоидной группы карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I);

алкиленкарбоксильной группы (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10);

сложноэфирной группы (-COOR, где R = органический радикал);

эпоксигруппы;

или нуклеофильной уходящей группы;

с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Подходящие диолы включают, например, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутиленгликоль и неопентилгликоль, пентандиол-1,5,3-метилпентандиол-1,5, бисфенол A, 1,2- или 1,4-циклогександиол, капролактондиол (продукт реакции капролактона и этиленгликоля), гидроксиалкилированные бисфенолы, триметилолпропан, триметилолэтан, пентаэритритол, гександиол-1,6, гептандиол-1,7, октандиол-1,8, бутандиол-1,4, 2-метилоктандиол-1,8, нонандиол-1,9, декандиол-1,10, циклогександиметилол, ди-, три- и тетраэтиленгликоль, ди-, три- и тетрапропиленгликоль, полиэтилен- и полипропиленгликоли со средним молекулярным весом от 150 до 15000.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединения по изобретению можно получать реакцией дикарбоновой кислоты общей формулы IV

R³(-COOH)₂ (IV)

где R³ выбирают из

одинарной связи;

линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных, алифатических или алициклических углеводородных групп с 1-22 атомами углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп с 5-12 атомами углерода в арильной группе, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп с 3-8 атомами углерода в гетероарильной группе и одним или двумя гетероатомами, выбранными из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами;

со свободной функциональной группой исходного транспортного посредника T и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида P, которые независимо выбирают из

аминогруппы (-NH₂); или

гидроксильной группы (-OH)

с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Подходящие дикарбоновые кислоты включают, например, щавелевую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, глутаровую кислоту, адипиновую кислоту, пимелиновую кислоту, азелаиновую кислоту, себациновую кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, сорбиновую кислоту, фталевую кислоту, терефталевую кислоту, изофталевую кислоту или агарициновую кислоту.

В частности, соединения по изобретению можно также получать реакцией галоида дикарбоновой кислоты общей формулы V

R⁴(-CO-A)₂ (V)

где A=Cl, Br или I и R⁴ выбирают из

одинарной связи;

линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных, алифатических или алициклических углеводородных групп с 1-22 атомами углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп с 5-12 атомами углерода в арильной группе, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп с 3-8 атомами углерода в гетероарильной группе и одним или двумя гетероатомами, выбранными из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами;

со свободной функциональной группой исходного транспортного посредника T и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида P, которые независимо выбирают из

аминогруппы (-NH₂); или

гидроксильной группы (-OH)

с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Кроме того, в следующем предпочтительном варианте осуществления соединения по изобретению можно получать реакцией сложного диэфира общей формулы VI

R⁵(-COOR')₂ (VI)

где R¹ представляет собой C_1-10 алкильную группу и R⁵ выбирают из

одинарной связи;

линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных, алифатических или алициклических углеводородных групп с 1-22 атомами углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп с 5-12 атомами углерода в арильной группе, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп с 3-8 атомами углерода в гетероарильной группе и одним или двумя гетероатомами, выбранными из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами;

соответственно с одной свободной функциональной группой исходного транспортного посредника T и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида P, которые независимо выбирают из

аминогруппы (-NH₂); или

гидроксильной группы (-OH)

с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Более предпочтительно, соединения по изобретению можно получать реакцией диизоцианата общей формулы VII

R⁶(-NCO)₂ (VII)

где R⁶ выбирают из

линейных или разветвленных, насыщенных или ненасыщенных, алифатических или алициклических углеводородных групп с 1-22 атомами углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп с 5-12 атомами углерода в арильной группе, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп с 3-8 атомами углерода в гетероарильной группе и одним или двумя гетероатомами, выбранными из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆ алкильными и/или C₂-C₆ алкокси группами;

соответственно с одной свободной функциональной группой исходного транспортного посредника T и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида P, которые независимо выбирают из

аминогруппы (-NH₂); или

гидроксильной группы (-OH)

с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

Подходящие диизоцианаты включают, например, толуилендиизоцианат, битолуилендиизоцианат, дианизидиндиизоцианат, тетраметилендиизоцианат, гексаметилендиизоцианат, м-фенилендиизоцианат, м-ксилилендиизоцианат, C₁-C₆ алкилбензолдиизоцианат, 1-хлорбензол-2,4-диизоцианат, циклогексилметандиизоцианат, 3,3'-диметоксидифенилметан-4,4'-диизоцианат, 1-нитробензол-2,4-диизоцианат, 1-алкоксибензол-2,4-диизоцианат, этилендиизоцианат, пропилендиизоцианат, циклогексилен-1,2-диизоцианат, 3,3'-дихлор-4,4'-бифенилендиизоцианат, дифенилендиизоцианат, 2-хлортриметилендиизоцианат, бутилен-1,2-диизоцианат, этилидендиизоцианат, дифенилметан-4,4'-диизоцианат, дифенилэтандиизоцианат, 1,5-нафталиндиизоцианат, циклогександиизоцианат и изофорондиизоцианат.

Более предпочтительно, соединения по изобретению можно получать реакцией диэпоксида соответственно с одной свободной функциональной группой исходного транспортного посредника T и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида P, которые независимо выбирают из

аминогруппы (-NH₂); или

гидроксильной группы (-OH)

с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

В частности, 1,2,3,4-диэпоксибутан или 1,2,7,8-диэпоксиоктан оказались подходящими диэпоксидами.

Соединения, в которых связывание транспортного посредника T и коллоида P осуществляется путем восстановительного аминирования, оказались особенно подходящими. Таким образом, более предпочтительно, соединения по изобретению можно получать путем восстановительного аминирования коллоида P, имеющего свободные аминогруппы (-NH₂), с транспортным посредником T, имеющим по меньшей мере одну альдегидную или кетогруппу, и где коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A).

В данном документе коллоид P, имеющий аминогруппы, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из аминированного крахмала, аминированного гидроксиалкилкрахмала, аминированного гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмала и аминированного карбоксиалкилкрахмала. Особенно предпочтительным является аминированный гидроксиалкилкрахмал, который сам может быть получен, например, путем восстановительного аминирования.

Более предпочтительно, коллоиды P, связанные путем восстановительного аминирования с транспортными посредниками T, включают транспортные посредники, выбранные из группы гепарина или производных гепарина.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения транспортный посредник T представляет собой гепарин и коллоид P представляет собой гидроксиэтилкрахмал, а первый линкер Z представляет собой -NH группу.

Как уже изложено выше, второй линкер L предпочтительно представляет собой функциональную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, амида карбоновой кислоты, уретана, эфира и аминогрупп, либо содержит по меньшей мере одну такую функциональную группу.

Кроме того, несколько коллоидов P также могут быть связаны через линкерные молекулы L и/или Z в более крупные кластеры. Эта реакция может конкурировать с присоединением A и/или T к коллоиду P. В соответствии с изобретением, на соотношение этих конкурирующих реакций можно влиять соответствующим изменением используемого метода. Проще всего это можно сделать, изменяя соотношение используемых реагентов и субстратов и изменяя молекулярный вес коллоида. Кроме того, условия реакции, такие как температура, давление и катализаторы, также влияют на соотношение двух реакций.

Коллоид P может иметь один или более транспортных посредников T, связанных через первый линкер Z. Число транспортных посредников T, связанных с коллоидом P, определяется параметром n. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения n представляет собой целое число от 1 до 10000, предпочтительно от 2 до 1000, более предпочтительно от 5 до 500, в частности от 10 до 100.

В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения транспортный посредник Т и/или коллоид Р ковалентно связан через второй линкер L с А, то есть активным с медицинской точки зрения веществом или флуоресцентным маркером. Вследствие этого, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения параметр m представляет собой целое число, равное по меньшей мере 1, предпочтительно, m представляет собой целое число от 1 до 10000, более предпочтительно от 2 до 1000, еще более предпочтительно от 5 до 500, в частности от 10 до 100.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по изобретению.

Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно представляет собой водную композицию, и более предпочтительно инъецируемую композицию. Предпочтительно, соединение по изобретению находится в концентрации от 0,0001 до 50% по весу, в частности от 0,01 до 10% по весу, например от 0,1 до 5,5% по весу, соответственно, исходя из общего состава.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения соединения по изобретению путем связывания транспортного посредника Т с коллоидно-активным соединением Р с образованием линкера Z, через который Т и Р ковалентно связаны друг с другом, и где коллоид P и/или транспортный посредник T связан с m единицами -(L-A). Значения T, P, Z, L и A такие же, как это определено выше.

В предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению связывание транспортного посредника T и коллоида P осуществляется путем восстановительного аминирования.

В данном документе, предпочтительно, на первой стадии проводят взаимодействие коллоида P, выбранного из группы, состоящей из аминированного крахмала, аминированного гидроксиалкилкрахмала, аминированного гидроксикарбоксиалкилкрахмала и аминированного карбоксиалкилкрахмала, с транспортным посредником T, выбранным из группы гепаринов или производных гепаринов, в присутствии восстановителя.

Предпочтительно, восстановитель выбирают из группы, состоящей из LiAlH₄, LiBH₄, NaBH₄ и NaBCNH₃.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа получения по изобретению, восстановительное аминирование модифицированного крахмала, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала или карбоксиметилкрахмала, сначала осуществляют на предварительной стадии. Восстановительное аминирование преимущественно осуществляют с использованием аммиака или гидроксида аммония в присутствии катализатора. Эту реакцию предпочтительно проводят в атмосфере водорода при повышенном давлении, например, от 10 до 300 бар, предпочтительно от 20 до 100 бар, и при температурах в диапазоне от 50 до 300°C, предпочтительно от 80 до 200°C. В качестве катализаторов используют скелетный никелевый катализатор или кобальт-никелевый катализатор.

Полученный таким образом аминированный модифицированный крахмал можно затем связывать с транспортным посредником, например глюкозаминогликаном, в другой реакции восстановительного аминирования.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению транспортный посредник T, предпочтительно глюкозаминогликан, в частности гепарин или производное гепарина, на первой стадии наносят на электрически заряженную подложку. Затем проводят дальнейшую реакцию связывания с коллоидом P, при этом транспортный посредник T остается на заряженной подложке. Нанесение транспортного посредника на заряженную подложку оказалось полезным, поскольку ионозаряженные области транспортного посредника T, в частности гепарина или производного гепарина, будут ориентироваться на носитель заряда, и вследствие этого такие области будут труднодоступны для реакции связывания с коллоидом P. Таким образом, с помощью такого способа можно избирательно получать специфические связывающие домены транспортного посредника.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гепарин или производное гепарина используют в качестве транспортного посредника, а гидроксиэтилкрахмал или карбоксиметилкрахмал используют в качестве коллоида.

Предпочтительно, часть молекулы гепарина, предназначенная для связывания с гепарин-связывающим доменом, связана с несущей системой, предпочтительно, наноструктурированной несущей системой, более предпочтительно положительно заряженной системой, и остается свободной от ковалентного связывания с молекулой гидроксиэтилкрахмала и/или карбоксиметилкрахмала. Например, для этой цели медную пластину можно покрывать диэлектриком и освобождать от слоя диэлектрика на выбранных участках с помощью лазера. Особенно удобно, если заряженные структуры гепарин-связывающих доменов обнаруживают с помощью сканирующего электронного микроскопа и соответствующие зарядные рельефы для иммобилизации молекул гепарина прожигают в слое диэлектрика. Кроме того, сканирующую электронную микроскопию можно использовать для введения подходящих зарядных рельефов в диэлектрический слой связывающей системы. Соответствующие способы применения лазерной технологии известны специалисту в данной области. Нанесение транспортного посредника на заряженную поверхность можно также осуществлять непосредственно путем нанесения на другие положительно заряженные молекулы. Особенно подходящими для этой цели являются сильно положительно заряженные полимеры, которые присутствуют в виде пленки в качестве поликатиона в условиях реакции синтеза по изобретению. В линкерах, реагирующих в щелочных условиях реакции, хитозан, например, присутствует в качестве поликатиона, с которым гепарин легко связывается. Следует отметить, что когда гепарин ковалентно связан с коллоидом P, в частности гидроксиэтилкрахмалом, связь не должна быть образована между функциональной группой хитозана и полисахарида, но только между гидроксиэтилкрахмалом и гепарином.

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, но не будет ими ограничено.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1A (связывание связанного с флуоресцеинизотиоцианатом гидроксиэтилкрахмала (FITC-HES) с гепарином).

200 мг гепарина¹⁾ растворяют в 10 мл PBS (фосфатно-солевом буфере), pH 7,5, и раствор пипеткой наносят на пластину, положительно заряженную генератором Ван-де-Граафа. Пластину оставляют заряженной на 1 неделю, пока раствор не высохнет, образуя пленку. На пленку пипеткой наносят 0,2 мл 1,2,7,8-диэпоксиоктана (от ALFA-AESAR GmbH & Co. KG, Germany) и распределяют вращением. В соответствии с методом, описанным DeBelder and Granath²⁾, 80 мг гидроксиэтилкрахмала (HES) [средний молекулярный вес: 50 кДа; DS=0,4] ковалентно связывают с флуоресцеинизотиоцианатными единицами (FITC-HES). FITC-HES растворяют в 10 мл смеси из 3 мл 1 Н NaOH и 7 мл ацетона и капают на заряженную пластину при встряхивании. Смесь доводят до рН 10 и встряхивают каждые 30 минут в темной комнате. Через 12 часов раствор отбирают, диализуют против дистиллированной воды, а затем лиофилизируют. Реагент растворяют в 10 мл PBS, pH=7,5. При электрофорезе продукт связывания мигрирует значительно быстрее, чем FITC-HES, не связанный с гепарином.

ПРИМЕР 1B (эффективность соединения FITC-HES-гепарин из примера 1a))

100 мг сухой субстанции соединения FITC-HES-гепарин, синтезированного в примере 1a), растворяют в 5 мл водного раствора 0,9% NaCl и раствор вводят в/б инъекцией крысе линии Wistar. Через 6 часов животное умерщвляют под анестезией и органы удаляют.

Из селезенки брали кусочек ткани размером 0,6×0,8 см и помещали в формалин на ночь. После проводки через набор спиртов с восходящей концентрацией и метилбензоат, готовили срезы толщиной 6-8 мкм. Препараты рассматривали под флуоресцентным микроскопом при длине волны 450-490 нм.

На фигурах 1 и 2 показана сильная флуоресценция клеток при 20-кратном увеличении. Яркие области на фотографиях демонстрируют поглощение флуоресцентно-меченого комплекса HES-гепарин клетками ткани селезенки.

ПРИМЕР 2 (связывание карбоксиметилгидроксиэтилкрахмала с гепарином)

200 мг гепарина¹⁾ растворяют в дистиллированной воде и обрабатывают, как в примере 1a). 10 мл 6% карбоксиметилгидроксиэтилкрахмала [DS для карбоксиметильных групп = 0,06 и DS для гидроксиэтильных групп = 0,34] растворяют в 10 мл раствора 0,1 Н HCl-ацетон (3 мл 0,1 Н HCl и 7 мл ацетона) и добавляют вместе с 0,2 мл 1,2,7,8-диэпоксиоктана, с последующим встряхиванием.

Смесь доводят до рН 3-4 добавлением раствора HCl-ацетон и встряхивают каждые 30 минут. Через 12 часов раствор отбирают, диализуют против дистиллированной воды, а затем лиофилизируют.

ПРИМЕР 3 (связывание аминированного HES с гепарином)

200 г гидроксиэтилкрахмала (HES) [средний молекулярный вес Mw=50000; DS=0,3] помещают в автоклав вместе с 27% раствором гидроксида аммония и 300 г катализатора никель/медь/хром с долей никеля 75%, долей меди 23% и долей хрома 2%. При добавлении водорода в автоклаве поддерживают давление в течение 12 часов. Температуру доводят до 220°C. Затем смесь удаляют, диализуют и лиофилизируют. 200 мг гепарина¹⁾ растворяют в 5 мл PBS, pH=7,5, и пипеткой наносят на чашку Петри, положительно заряженную генератором Ван-де-Граафа. 200 мг аминированного восстановлением гидроксиэтилкрахмала растворяют в 10 мл дистиллированной воды и раствор осторожно добавляют. После этого в смесь добавляют 0,025 мг натрия цианоборгидрида NaBH₃CN. Чашку Петри осторожно встряхивают. Через 2 часа вновь добавляют 0,025 мг натрия цианоборгидрида и смесь осторожно встряхивают до тех пор, пока пузырьки не перестанут подниматься. Добавление натрия цианоборгидрида аналогичным образом повторяют четыре раза. После этого реагент выдерживают в течение 72 часов; в конечном итоге, его растворяют в избытке PBS, pH=7,5, диализуют и лиофилизируют.

ПРИМЕР 4 (связывание аминированного HES с гепарином, с последующей реакцией с альбумином человека)

200 г гидроксиэтилкрахмала (HES) [средний молекулярный вес Mw=50000; DS=0,3] помещают в автоклав вместе с 27% раствором гидроксида аммония и 300 г катализатора никель/медь/хром с долей никеля 75%, долей меди 23% и долей хрома 2%. При добавлении водорода в автоклаве поддерживают давление в течение 12 часов. Температуру доводят до 270°C. Затем смесь удаляют, диализуют и лиофилизируют. 200 мг гепарина¹⁾ растворяют в 5 мл PBS, pH=7,5, и пипеткой наносят на чашку Петри, положительно заряженную генератором Ван-де-Граафа. 200 мг аминированного восстановлением гидроксиэтилкрахмала растворяют в 10 мл дистиллированной воды, и раствор осторожно добавляют. После этого в смесь добавляют 0,025 мг натрия цианоборгидрида NaBH₃CN. Чашку Петри осторожно встряхивают. Через 2 часа вновь добавляют 0,025 мг натрия цианоборгидрида и смесь осторожно встряхивают до тех пор, пока пузырьки не перестанут подниматься. Добавление натрия цианоборгидрида аналогичным образом повторяют четыре раза.

После этого реагент выдерживают в течение 24 часов. После новой зарядки генератором Ван-де-Граафа добавляют 10 мг альбумина человека в 10 мл PBS (pH=7,5). Затем добавляют 0,025 мг натрия цианоборгидрида NaBH₃CN. Чашку Петри осторожно встряхивают. Добавление 0,025 мг натрия цианоборгидрида NaBH₃CN с последующим встряхиванием повторяют четыре раза с использованием и четыре раза без использования генератора Ван-де-Граафа. В конечном итоге, реагент растворяют в избытке PBS (pH 7,5), диализуют и лиофилизируют.

ПРИМЕР 5 (связывание гидроксиэтилкрахмала с гепарином через гексан-1,6-диамин)

a) Тозилирование гидроксиэтилкрахмала

HES₄₀ ³⁾ (20 г) суспендируют в пиридине (200 мл) и нагревают с обратным холодильником до образования прозрачного раствора. После этого раствор охлаждают до 0°С, тозилхлорид (19,4 г, 200 экв.) добавляют порциями при перемешивании и реакционный раствор оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры. При перемешивании реакционный раствор добавляют к ацетонитрилу (500 мл). Сразу же образуется белый осадок, который отфильтровывают и высушивают в вакууме. Образовавшуюся белую пену выпаривают вместе с ацетонитрилом три раза, осадок растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение 24 часов. После испарения воды получают указанное в заголовке соединение в виде бесцветного твердого вещества (2,6 г). По сравнению с чистым HES₄₀, в H¹-ЯМР спектре (400 МГц, D₂O) дополнительно присутствуют типичные симметричные пики ароматических СН с химическим сдвигом в 7-8 промилле, что является признаком тозильных групп.

b) Замещение тозилированного HES амино-линкером.

Раствор 2305-BA-100 (3,3 г) и гександиамин (10,0 г, 1000 экв.) в DMF (5 мл) перемешивают при 50°C в течение ночи, а затем выливают в ацетон (300 мл). Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Для дальнейшей очистки сырой продукт растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение 24 часов. После испарения воды упомянутый выше продукт реакции получают в виде бесцветного твердого вещества (1,5 г). По сравнению с гепарином, в H¹-ЯМР спектре (400 МГц, D₂O) дополнительно присутствуют типичные пики CH₂ с химическим сдвигом в 1-2 промилле, что является признаком амино-линкера.

c) связывание с помощью EDC⁴⁾ продукта реакции, полученного на стадии b), с HEP¹⁾

К раствору HEP (60 мг) и продукту, полученному на стадии b) (200 мг) в дистиллированной воде (4 мл), добавляют EDC⁴⁾ гидрохлорид (80 мг, 100 экв.). Реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, а затем выливают в ацетон (5 мл). Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Для дальнейшей очистки сырой продукт растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение 24 часов. После испарения воды получают продукт связывания HES и гепарина, как показано на схеме реакции, в виде бесцветного твердого вещества (0,11 г).

ПРИМЕР 6 (связывание гидроксиэтилкрахмала с гепарином через гексан-1,6-диамин)

a) связывание с помощью EDC⁴⁾ гепарина (HEP) с амино-линкером

К раствору HEP (1,0 г) и гексан-1,6-диамина (0,8 г, 100 экв.) в дистиллированной воде (10 мл) добавляют EDC⁴⁾ гидрохлорид (14 г, 100 экв.). Реакционный раствор перемешивают при 20°C в течение ночи, а затем выливают в ацетон (20 мл). Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. С помощью ЖХ-МС определено, что в продукте реакции содержится непрореагировавший гександиамин. Для дальнейшей очистки сырой продукт растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение 24 часов. После испарения воды получают продукт связывания, показанный на схеме реакции, в виде бесцветного твердого вещества (0,8 г). По сравнению с гепарином, в H¹-ЯМР спектре (400 МГц, D₂O) дополнительно присутствуют типичные пики CH₂ с химическим сдвигом в 1-2 промилле.

b) Нуклеофильное замещение продукта связывания, полученного на стадии a), тозилированным HES из примера 5, стадия a)

В суспензию 2305-AA-1 (30 мг) и 2305-BA100 (100 мг, MW: примерно 50 кДа) в ДМСО (4 мл), инъецируют Et₃N (0,003 мл, 100 экв.) с последующим нагреванием до 80°C при перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов, а затем выливают в ацетон (6 мл). Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Указанное в заголовке соединение получают в виде слегка бежевого твердого вещества (0,1 г). По сравнению с гепарином, в H¹-ЯМР спектре (400 МГц, D₂O) дополнительно присутствуют типичные пики CH₂ с химическим сдвигом в 1-2 промилле.

ПРИМЕР 7 (связывание аминированного гидроксиэтилкрахмала с гепарином путем восстановительного аминирования)

a) Аминирование гидроксиэтилкрахмала (HES)

HES₄₀ (5,1 г, MW: 40 кДа) растворяют в водном растворе гидроксида аммония (100 мл, 22%). К раствору добавляют катализатор, состоящий из никеля (5,6 г, 325 меш), хрома (0,15 г, 100 меш) и меди (1,8 г, 1 мкм). Смесь перемешивают в атмосфере водорода при 120°С в автоклаве в течение 48 часов. После охлаждения до 20°С катализатор отфильтровывают и фильтрат выливают в этанол (20 мл). Выпавший осадок отфильтровывают, промывают небольшим количеством смеси этанол/вода и высушивают. Аминированный HES получают в виде слегка голубоватого твердого вещества (1,2 г).

b) Восстановительное аминирование аминированного HES, полученного на стадии a), с гепарином

HEP (200 мг) растворяют в водном фосфатном буферном растворе (5 мл, рН=7,5) и по каплям добавляют раствор аминированного гидроксиэтилкрахмала со стадии a) (200 мг) в дистиллированной воде (10 мл). С интервалами в 2 часа к реакционному раствору добавляют NaCNBH₃ шесть раз (каждый раз по 0025 мг, из водного маточного раствора). Реакционную смесь вновь перемешивают при 20°С в течение 2 часов. Для дальнейшей очистки сырой продукт диализуют в течение 24 часов. После испарения воды продукт связывания гепарина и аминированного гидроксиэтилкрахмала, как показано на схеме реакции, получают в виде бесцветного твердого вещества (250 мг).

ПРИМЕР 8 (связывание флуоресцентно-меченого гепарина с аминированным гидроксиэтилкрахмалом (HES) путем восстановительного аминирования)

a) Связывание гепарина (HEP) с флуоресцентным маркером 2-аминопиридином

(HEP* = флуоресцентно-меченый)

К раствору 2-аминопиридина (31,7 г, 0,33 моль, 1000 экв.) и NaCNBH₃ (2,1 г, 0,033 моль, 100 экв.) в формамиде (50 мл), добавляют гепарин (5,0 г). Полученную суспензию перемешивают при 37°С в течение ночи, и постепенно образуется прозрачный раствор. Реакционный раствор выливают в EtOH (50 мл). Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Продукт соединения (HEP*), показанный на схеме реакции, получают в виде слегка бежевого твердого вещества (1,3 г). Как в водном растворе, так и в виде твердого вещества, продукт связывания демонстрирует интенсивную сине-фиолетовую флуоресценцию при облучении УФ светом с длиной волны 366 нм. По сравнению с гепарином, в H¹-ЯМР спектре (400 МГц, D₂O) дополнительно присутствуют типичные пики ароматических СН с химическим сдвигом в 6,6-7,8 промилле, что является признаком типичных пиридиновых заместителей.

b) Связывание флуоресцентно-меченого гепарина (HEP*), полученного на стадии a), с аминированным гидроксиэтилкрахмалом, полученным в примере 7, стадия a), путем восстановительного аминирования

HEP* со стадии a) (200 мг, средний молекулярный вес 15 кДа) растворяют в водном фосфатном буферном растворе (5 мл, рН=7,5) и по каплям добавляют раствор аминированного HES из примера 7, стадия a) (200 мг) в дистиллированной воде (10 мл). С интервалами в 2 часа к реакционному раствору добавляют NaCNBH₃ три раза (каждый раз по 0025 мг, из водного маточного раствора). Реакционную смесь вновь перемешивают при 20°С в течение 2 часов. Для дальнейшей очистки сырой продукт диализуют в течение 24 часов. После испарения воды продукт связывания аминированного HES и флуоресцентно-меченого гепарина получают в виде бесцветного твердого вещества (200 мг).

Как в водном растворе, так и в виде твердого вещества, соединение демонстрирует интенсивную желто-зеленую флуоресценцию при облучении УФ светом с длиной волны 366 нм. По сравнению с гепарином, в H¹-ЯМР спектре (400 МГц, D₂O) дополнительно присутствуют типичные пики ароматических СН с химическим сдвигом в 7,0-7,8 промилле, что является признаком типичных пиридиновых заместителей.

ПРИМЕР 9 (связывание продукта, полученного в примере 5, стадия b), с флуоресцентно-меченым гепарином из примера 8, стадия a) путем соединения при помощи EDC⁴⁾

К раствору HEP* (пример 8, стадия a)) (60 мг) и продукту реакции из примера 5, стадия b) (160 мг) в дистиллированной воде (4 мл) добавляют EDC гидрохлорид (80 мг, 100 экв.). Реакционный раствор перемешивают при 20°C в течение ночи, а затем выливают в ацетон (5 мл). Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Для дальнейшей очистки сырой продукт растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение 24 часов. После испарения воды получают желаемый продукт связывания, соответствующий схематичной формуле, приведенной выше, в виде бесцветного твердого вещества (0,1 г).

Как в водном растворе, так и в виде твердого вещества, соединение демонстрирует интенсивную желто-зеленую флуоресценцию при облучении УФ светом с длиной волны 366 нм. По сравнению с гепарином, в H¹-ЯМР спектре (400 МГц, D₂O) дополнительно присутствуют типичные пики ароматических СН с химическим сдвигом в 7,0-7,8 промилле, что является признаком типичных пиридиновых заместителей.

¹⁾ Гепарин (также сокращенно обозначаемый HEP): использовали натриевую соль (свиного происхождения), pH=7, средний Mw=12-15 кДа, производитель: Changzhou Qianhong Bio-Pharma Co., Ltd., Jiangsu, Китай.

²⁾ A.N. De Belder and Kirsti Granath; Carbohydrate Research, 30 (1973), 375-378.

³⁾ HES₄₀: Гидроксиэтилкрахмал, имеющий средний молекулярный вес Mw=40 кДа, степень замещения DS=0,3; производитель: BBraun, Crissier, Швейцария.

⁴⁾ EDC: N-диметиламинопропил-N-этилкарбодиимида гидрохлорид.

Изобретение относится к связанным с транспортными посредниками коллоидам, содержащим фармацевтические вещества или флуоресцентные маркеры, к способу их получения, а также к фармацевтическому препарату, содержащему указанные соединения. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 9 пр., 2 ил.

1. Соединение общей формулы (I)
,
где
Т представляет собой транспортный посредник, представленный глюкозаминогликаном;
Р представляет собой коллоидно-активное соединение, выбранное из гидроксиалкилкрахмала и карбоксиалкилкрахмала;
Z представляет собой первый линкер, с помощью которого Т и Р ковалентно связаны друг с другом; и
n представляет собой целое число, по меньшей мере равное 1;
и где транспортный посредник Т и/или коллоид Р несет m групп -(L-A), где
А представляет собой активное с медицинской точки зрения вещество или флуоресцентный маркер;
L представляет собой второй линкер, посредством которого Р ковалентно связан с А, или посредством которого Т ковалентно связан с А; и
m представляет собой целое число, равное по меньшей мере 1;
и где активное соединение А выбирают из группы, состоящей из антибиотиков, химиотерапевтических средств, цитостатиков, анальгетиков и цитотоксических веществ.

2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что указанный транспортный посредник имеет по меньшей мере один сайт связывания для соединения с клеточными связывающими доменами.

3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что указанный транспортный посредник Т выбирают из группы, состоящей из гепарина и гепаринсульфата, в частности гепарина или гепаринсульфата, имеющих менее 6 сахаридных единиц.

4. Соединение по п.3, отличающееся тем, что коллоидно-активное соединение выбирают из группы, состоящей из гидроксиалкилкрахмалов, этерифицированных крахмалов, карбоксиалкилкрахмалов, гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмала, аминированного гидроксиалкилкрахмала, аминированного гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмала и аминированного карбоксиалкилкрахмала.

5. Соединение по п.4, отличающееся тем, что коллоидно-активное соединение выбирают из гидроксиэтилкрахмала или аминированного гидроксиэтилкрахмала.

6. Соединение по п.4, отличающееся тем, что указанное коллоидно-активное соединение имеет средний молекулярный вес от 20000 до 800000 дальтон, предпочтительно от 25000 до 500000 дальтон, в частности от 30000 до 200000 дальтон.

7. Соединение по п.4, отличающееся тем, что степень замещения, DS, коллоидно-активного соединения, в частности гидроксиэтилкрахмала, составляет от 0,2 до 0,8, предпочтительно от 0,3 до 0,6.

8. Соединение по п.1, отличающееся тем, что указанный флуоресцентный маркер выбирают из группы, состоящей из флуоресцеинизотиоцианата (FITC), фикоэритрина, родамина и 2-аминопиридина.

9. Соединение по п.1, отличающееся тем, что указанный линкер Z представляет собой функциональную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, амидов карбоновых кислот, уретана, эфира и аминогрупп, либо содержит такую группу.

10. Соединение по п.1, получаемое реакцией по меньшей мере одной свободной
гидроксильной группы (-ОН); или
аминогруппы (-NH₂)
исходного коллоида Р со свободной
изоцианатной группой (-NCO);
карбоксильной группой (-СООН);
галоидной группой карбоновой кислоты (-CO-A, где А=Cl, Br или I);
алкиленкарбоксильной группой (-(СН₂)_q-COOH, где q=1-10);
сложноэфирной группой (-COOR, где R = органический радикал);
эпоксигруппой;
или нуклеофильной уходящей группой
исходного транспортного посредника Т с образованием линкера Z, где указанный коллоид Р и/или транспортный посредник Т связан с m единицами -(L-A).

11. Соединение по п.1, получаемое реакцией диэпоксида соответственно с одной свободной функциональной группой исходного транспортного посредника Т и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного коллоида Р, которые независимо выбирают из
аминогруппы (-NH₂); или
гидроксильной группы (-ОН)
с образованием линкера Z, где указанный коллоид P и/или
транспортный посредник Т связан с m единицами -(L-A).

12. Соединение по п.1, получаемое путем восстановительного аминирования коллоида Р, имеющего свободные аминогруппы (-NH₂), с транспортным посредником Т, имеющим по меньшей мере одну альдегидную или кетогруппу, и где коллоид Р и/или транспортный посредник Т связан с m единицами -(L-A).

13. Соединение по п.12, отличающееся тем, что указанный коллоид Р, имеющий аминогруппы, выбирают из группы, состоящей из аминированного крахмала, аминированного гидроксиалкилкрахмала, аминированного гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмала и аминированного карбоксиалкилкрахмала.

14. Соединение по п.12, отличающееся тем, что указанный транспортный посредник представляет собой гепарин или производное гепарина.

15. Соединение по п.1, отличающееся тем, что указанный транспортный посредник Т представляет собой гепарин, и указанный коллоид Р представляет собой гидроксиэтилкрахмал, а первый линкер Z представляет собой -NH группу.

16. Соединение по п.1, отличающееся тем, что указанный второй линкер L представляет собой функциональную группу, выбранную из сложного эфира карбоновой кислоты, амида карбоновой кислоты, уретана, эфира и аминогрупп, либо содержит такую группу.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по крайней мере одному из пп.1-16 в качестве транспортной системы для лекарственных средств и/или флуоресцентных маркеров.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что указанная композиция является водной и инъецируемой.

19. Способ получения соединения общей формулы (I) по крайней мере одному из пп.1-16 путем связывания транспортного посредника Т с коллоидно-активным соединением Р с образованием линкера Z, через который Т и Р ковалентно связаны друг с другом, и где коллоид Р и/или транспортный посредник Т связан с m единицами -(L-A).

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что связывание транспортного посредника Т и коллоида Р осуществляется путем восстановительного аминирования.

21. Способ по п.19, отличающийся тем, что на первой стадии проводят взаимодействие коллоида Р, выбранного из группы, состоящей из аминированного крахмала, аминированного гидроксиалкилкрахмала, аминированного гидроксикарбоксиалкилкрахмала и аминированного карбоксиалкилкрахмала, с транспортным посредником Т, выбранным из группы гепаринов или производных гепаринов, в присутствии восстановителя.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что восстановитель выбирают из группы, состоящей из LiAlH₄, LiBH₄, NaBH₄ и NaBH₃CN.