СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕХАНОЗАВИСИМОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2014 года по МПК C07K14/65 C12N1/19 C12M1/42 

Изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, предназначено для интенсификации культивирования клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, обеспечивающих секрецию механозависимого фактора роста человека (МФР).

МФР в организме человека активирует стволовые клетки, уже присутствующие в мышечных тканях. После активации стволовые клетки начинают делиться и создают дополнительные мышечные волокна, в результате чего увеличивается размер и прочность мышц.

МФР может применяться в лечении пожилых людей, изначально неспособных к интенсивным физическим тренировкам. Увеличение уровня этого белка у пожилых людей улучшает регенерацию мышц и предотвращает атрофию. Его применение весьма перспективно для борьбы со старческой саркопенией сердечной мышцы и неврологическими осложнениями [1, 2, 3, 4].

Известен способ получения механозависимого фактора роста человека, описывающий использование дрожжей для продукции полноразмерного рекомбинантного механозависимого фактора роста человека (МФР), включающий стадии выращивания клеток штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF в питательной среде и выделения рекомбинантного механозависимого фактора роста человека из культуральной жидкости [5].

Известен способ получения МФР с использованием клеток E. coli. [6].

Недостатком этих способов является относительно большая длительность культивирования, низкая скорость накоплении биомассы дрожжей, секретирующих МФР.

Известно также, что любая биологическая система, в том числе и клетки в культуре, обладает резервом роста и развития, реализация которого возможна за счет применения неспецифических факторов [7, 8, 9, 10], в частности ультразвука, снижающего к тому же диффузионные ограничения, препятствующие снабжению клеток питательными веществами и удалению метаболитов [11].

Задачей предложенного изобретения является стимуляция ультразвуком роста и развития клеток дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, секретирующих МФР в культуральную среду.

Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в повышении скорости накопления биомассы и повышении выхода целевого продукта (МФР).

Поставленная задача решается, а технический результат достигается за счет того, что клетки в культуре на стадии засевного материала подвергаются действию ультразвука в некавитационном режиме. При этом используется ультразвук с частотой 880 кГц (разрешенной МЭК [12]) для медицинского и биомедицинского применения в интервале плотностей мощности (0,1-1,0) Вт/см³. При более низких частотах ультразвука повышается вероятность возникновения кавитации, при более высоких - снижается эффективность воздействия ультразвука на биологические объекты [11].

Следует отметить, что на сегодняшний день существенная физическая интенсификация процессов культивирования микроорганизмов в суспензиях без использования ультразвуковых технологий практически невозможна.

Способ осуществляют следующим образом.

Посевной материал подвергают действию ультразвука в процессе передавливания в ферментер через стенку тонкостенной кюветы, встроенной в систему подачи посевного материала в аппарат для ферментации. Стенка кюветы имеет толщину, кратную четверти длины волны ультразвука, что обеспечивает ее максимальную прозрачность для ультразвукового излучения [13].

Проточная ультразвуковая кювета отличается от давно известных [13], широко применявшихся [14, 15, 16, 17] и постоянно совершенствующихся [18, 19] аналогов, частотой ультразвука и соответствующей толщиной стенки, через которую происходит воздействие. В качестве источника ультразвука использовался стандартный терапевтический аппарат УЗТ-1.01 Ф. Конструкция проточной кюветы обеспечивает стимулирующее воздействие ультразвука на посевной материал при сохранении стерильности посевного материала и среды культивирования.

Посевным материалом после воздействия на него ультразвуком засевали ферментационную среду в ферментере. Биосинтез МФР проводили в стандартных условиях и после культивирования в течение 24, 36 и 48 часов отбирали из аппарата пробы, в которых определяли оптическую плотность и содержание МФР в культуральной жидкости.

Результаты измерения оптической плотности приведены в таблице 1. Результаты измерения содержания МФР в культуральной жидкости приведены в таблице 2. Опыты проведены в трех параллельных аппаратах. Для статистической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения усредненной величины.

Примеры осуществления способа

Пример 1

Посевной материал в виде споровой суспензии с концентрацией клеток 2·10⁸ КОЕ/мл, что соответствует оптической плотности (А₆₀₀) 23-25, подвергают действию ультразвука с плотностью мощности 0,1 Вт/см³ в процессе передавливания в ферментер со скоростью 1 мл/с, что обеспечивает ультразвуковое воздействие на весь засевной материал в течение 120 с. Исходный титр клеток в ферментационной среде составлял от 0,5·10⁶ до 1·10⁷ КОЕ/мл.

По истечении 24, 36 и 48 часов культивирования отбирали образцы. В образцах определяли значение оптической плотности и содержание МФР в культуральной жидкости. Полученные данные показывают, что значимых изменений оптической плотности и концентрации МФР при выбранной плотности мощности ультразвука не выявлено.

Пример 2

Посевной материал в виде споровой суспензии с концентрацией клеток 2·10⁸ КОЕ/мл, что соответствует оптической плотности (A₆₀₀) 23-25, подвергают действию ультразвука с плотностью мощности 0,3 Вт/см³ в процессе передавливания в ферментер со скоростью 1 мл/с, что обеспечивает ультразвуковое воздействие на весь засевной материал в течение 120 с. Исходный титр клеток в ферментационной среде составлял от 0,5·10⁶ до 1·10⁷ КОЕ/мл.

По истечении 24, 36 и 48 часов культивирования отбирали образцы. В образцах определяли значение оптической плотности и содержание МФГ. Полученные данные приведены в таблицах 1 и 2. В результате культивирования клеток, оптическая плотность культуральной среды повышается со значений в контроле 15, 38, 40 к 24, 36 и 48 часу соответственно до значений в опыте 25, 65, 67 соответственно. А концентрация МФР возрастает со значений 6,2, 8,4, 20,6 мкг/мл к 24, 36 и 48 часу соответственно до значений в опыте 8,4, 18,5. 34,0 мкг/мл.

Пример 3

Посевной материал в виде споровой суспензии с концентрацией клеток 2·10⁸ КОЕ/мл, что соответствует оптической плотности (A₆₀₀) 23-25, подвергают действию ультразвука с плотностью мощности 0,5 Вт/см³ в процессе передавливания в ферментер со скоростью 1 мл/с, что обеспечивает ультразвуковое воздействие на весь засевной материал в течение 120 с. Исходный титр клеток в ферментационной среде составлял от 0,5·10⁶ до 1·10⁷ КОЕ/мл.

По истечении 24, 36 и 48 часов культивирования в ферментере отбирали образцы. В образцах определяли значение оптической плотности. Полученные данные приведены в таблицах. В результате оптическая плотность культуральной среды повышается со значений в контроле 15, 38, 40 к 24, 36 и 48 часу соответственно до значений в опыте 26, 62, 68 соответственно. Концентрация МФР в культуральной жидкости возрастает со значений 6,2, 8,4, 20,6 мкг/мл к 24, 36 и 48 часу соответственно до значений в опыте 10.0, 22,2 и 32 мкг/мл.

Пример 4

Посевной материал в виде споровой суспензии с концентрацией клеток 2·10⁸ КОЕ/мл, что соответствует оптической плотности (A₆₀₀) 23-25, подвергают действию ультразвука с плотностью мощности 0,7 Вт/см³ в процессе передавливания в ферментер со скоростью 1 мл/с, что обеспечивает ультразвуковое воздействие на весь засевной материал в течение 120 с. Исходный титр клеток в ферментационной среде составлял от 0,5·10⁶ до 1·10⁷ КОЕ/мл.

По истечении 24, 36 и 48 часов культивирования отбирали образцы. В образцах определяли значение оптической плотности. Полученные данные приведены в таблицах. В результате оптическая плотность культуральной среды повышается со значений в контроле 15, 38, 40 к 24, 36 и 48 часу соответственно до значений в опыте 20, 36, 42. Концентрация МФР в культуральной жидкости возрастает со значений 6,2, 8,4, 20,6 мкг/мл к 24, 36 и 48 часу соответственно до значений в опыте 7,6, 15,3 и 30,5 мкг/мл.

Таблица 1 Оптическая плотность культуральной жидкости Плотность мощности ультразвука, Вт/см³ Оптическая плотность   24 часов роста 36 часов роста 48 часа роста без обработки 15±2,1 38±3,2 40±3,5 0,1 17±1,9 42±2,0 44±3,1 0,3 25±2,4 65±4,2 67±4,8 0,5 26±2,0 62±3,8 68±5,2 0,7 20±2,4 36±2,6 42±4,4

Таблица 2 Содержание МФР в культуральной жидкости Плотность мощности ультразвука, Вт/см³ Концентрация МФГ в культуральной жидкости,
мкг/мл   24 часа роста 36 часов роста 48 часов роста без обработки 6,2±1,4 8,4±2,8 20,6±3,2 0,1 5,8±2,6 9,2±2,4 19,4±3,0 0,3 8,4±1,8 18,5±2,4 34,0±4,6 0,5 10,0±1,2 22,2±3,0 32,8±3,8 0,7 7,6±2,4 15,3±2,1 30,5±2,8

Полученные результаты свидетельствуют, что стимуляция клеток посевного материала ультразвуком с частотой 880 кГц и плотностью мощности 0,1-1,0 Вт/см³ обеспечивает увеличение скорости накопления клеток Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, секретирующих МФР, в культуральную среду за счет неспецифической стимуляции клеток, причем оптимальной плотностью мощности можно считать (0,3-0,5) Вт/см³.

Таким образом, изложенные выше сведения свидетельствуют о том, что заявленное изобретение, предназначенное для использования в биотехнологии, в частности для интенсификации процесса культивирования клеток Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, секретирующих МФР, обладает заявленными выше свойствами. Для заявленного способа в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".

Литература

1. Goldspink G. Age-Related Decline in Actomyosin Structure and Function, Ewa Prochniewicz, Exp Gerontol., 2008.

2. Goldspink G. Premature Aging in Skeletal Muscle Lacking Serum Response Factor, Charlotte Lahoute, PLoS ONE. 2008.

3. Goldspink G Age-Related Cardiac Muscle Sarcopenia: Combining experimental and mathematical modeling to identify mechanisms, Jing Lin. Exp. gerontology, 2009.

4. Goldspink G, Jonnson I. Use of the insulin-like-growth factor I isoform MGF for the treatment of neurological disorders, патент W0/2001/036483, 2001.

5. Керученько Я.С., Хотченков В.П., Попов В.О., Морозкина Е.В., Марченко А.Н., Беневоленский С.В. Кассета и рекомбинантная плазмида для экспрессии и секреции механозависимого фактора роста человека (MGF), штамм Scccaromyces Cerevisiae - продуцент MGF и способ получения MGF. Патент РФ №2344173, 2006.

6. Kuznetsova T.V., Schulga А.А., Wulfson A.N., Keruchenko J.S., Ermolyuk Y.S., Keruchenko I.D., Tikhonov R.V., Lisitskaya K.V., Makarov A.A., Chobotova K., Khomenkov V.G., Khotchenkov V.P., Popov V.O., Kirpichnikov M.P., Shevelev A.B. Producing human mechano growth factor (MGF) in E. coli. Protein Expr Purif. 2008, V.58, N.1, P.70-77.

7. Коржевенко Г.Н., Шангин-Березовский Г.Н., Акопян В.Б. Скрытый резерв роста и развития живых систем Вестник сельско-хозяйственной науки, 1988, №4, (380), с.96-105.

8. Акопян В.Б., Кузнецов В.П., Олешкевич А.А. Способ получения интерферона 1988, А.С. №1575362.

9. Akopyan V.B., Oleshkevitch A., Kuznetsov V.P. The effect of Ultrasound on Interferon Biosynthesis Scipta Medica, 1990, 63, N7, p.405-408.

10. Акопян В.Б., Смирнова Л.П., Олешкевич А.А. Способ получения культуры клеток животных 1988, А.С. 1597387.

11. Акопян В.Б., Ершов А.Ю., Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами, Москва, Из-во РГТУ им. Баумана, 2006, 223 С.

12. МЭК 62127-1:2007 Ультразвук.

13. L. Bergmann, Der Ultrashall in Wissenschaft und Technic. Zurich 1954. (Бергман. Л. Ультразвук и его применение в науке и технике. Издат. Ин. Лит., М., 1957, 727 с.

14. Эльпинер, И.Е. Ультразвук. Физико-химическое и биологическое действие М., Физматгиз, 1963, 420 с.

15. Эльпинер, И.Е. Биофизика ультразвука М. Наука, 1973, 384 с.

16. Молчанов, Г.И. Ультразвук в фармации М. Медицина, 1980, 118 с.

17. Агранат Б.А. и др. Основы физики и техники ультразвука. М. Высшая школа, 1987, 351 с.

18. Маргулис, М.А. Звукохимические реакции и сонолюминисценция. М. Химия, 1986. 300 с.

19. Хмелев, В.Н. и др., Ультразвуковые многофункциональные и специализированные аппараты для интенсификации технологических процессов в промышленности. Барнаул, АлтГТУ, 2007. 416 с.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ получения механозависимого фактора роста человека предусматривает в процессе культивирования воздействие ультразвука с частотой 880 кГц и плотностью мощности в интервале 0,1-1,0 Вт/см³ на клетки Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF при передавливании в ферментер. Изобретение обеспечивает получение целевого продукта с повышенным выходом. Концентрация механозависимого фактора роста человека на 48 ч культивирования составляет 30,5-34 мкг/мл. 2 табл., 4 пр.

Способ получения механозависимого фактора роста человека, включающий культивирование клеток Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF, секретирующих механозависимый фактор, и отличающийся тем, что клетки посевного материала при передавливании в ферментер подвергают стимулирующему воздействию ультразвука с частотой 880 кГц и плотностью мощности в интервале 0,1-1,0 Вт/см³.