Трансформант Komagataella phaffii, содержащий ген HAC1, продуцент рекомбинантного химозина Vicugna pacos в активной форме Российский патент 2024 года по МПК C12N1/19 C12N15/81 C12N9/64 

Область техники

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается получения штаммов дрожжей Komagataella phaffii (Pichia pastoris), способных продуцировать рекомбинантный химозин в активной форме.

Уровень техники

Химозин, или реннин (ЕС 3.4.23.4) - кислая аспарагиновая (аспартатная) эндопептидаза из класса гидролаз. Химозин обладает высокой специфичностью к связи Phe105-Met106 в молекуле каппа-казеина (к-казеин) и низкой общей протеолитической активностью и находит широкое применение в сыроделии в качестве молокосвертывающего фермента.

Эталонным молокосвертывающим ферментом считается химозин коровы.

На ранней стадии в клетках желудка крупного рогатого скота молокосвертывающий фермент синтезируется как неактивный препрохимозин с молекулярной массой 43.0 кДа. После транспортировки препрохимозина в эндоплазматический ретикулум сигнальный пептид, состоящий из 16 аминокислотных остатков, отщепляется и появляется прохимозин - каталитически неактивный зимоген, который состоит из 365 аминокислот и имеет молекулярный вес 40.78 кДа. Про-пептид играет важную роль в правильном фолдинге и транспортировке (секреции из клетки) и обеспечивает ферментативную неактивность прохимозина, блокируя активный центр. Аутокаталитическая активация прохимозина происходит при изменении рН. При рН 4.2 от прохимозина удаляются 42 аминокислотных остатка с N-конца и образуется активный химозин, состоящий из 323 аминокислотных остатков и имеющий молекулярный вес 35.6 кДа. [Critical Reviews in Biotechnology, 2010, 30:4, 243-258, DOI: 10.3109/07388551.2010.483459].

Химозин является основным действующим агентом сычужного фермента, который традиционно используется для производства сыров. Сычужный фермент, представляющий собой смесь химозина и пепсина, получают обычно из сычуга - четвертого отдела желудка телят крупного рогатого скота. Соотношение показателей высокоспецифичной молокосвертывающей и побочной протеолитической активностей определяет качественную характеристику любого молочного коагулянта [Biotechnol Appl Biochem. 1988. №.10. Р 522-535.].

Производители молокосвертывающего ферментного препарата столкнулись с нехваткой сычугов молочных телят, основного сырья для производства сычужного фермента, со второй половины XX века. С 1961 года производство сыров выросло в 3.5 раза, и на данный момент доля на рынке сычужного фермента, получаемого из сычугов молочных телят крупного рогатого скота, составляет 20-30% [Recent Adv. In DNA and Gene Sequences. 2014, vol. 8, no. 1, p. 44-55].

Альтернативой природным химозинам животного происхождения являются их рекомбинантные аналоги, получаемые с использованием методов генной инженерии. Основное преимущество рекомбинантного химозина - низкая неспецифическая протеолитическая активность, в то время как сычужный фермент теленка содержит 2-20% пепсина, действие которого приводит к потерям части пептидов с сывороткой. Рекомбинантный химозин получил GRAS (Generally recognized as safe) статус для использования в сыроделии, подтвержденный FDA (Food and Drug Administration), имеет кошерную сертификацию и обеспечивает гуманное отношение к животным. Промышленное производство рекомбинантного химозина осуществляют, например, такие компании как Pfizer, Chr. Hansen, Milwaukee (Chy-max, продуцент Aspergillus niger var. awamopi), DSM Food Specialties (Maxiren, продуцент Kluyveromyces lactis) [Critical Reviews in Biotechnology, 2010, 30:4, 243-258, DOI: 10.3109/07388551.2010.483459].

В последние годы для получения рекомбинантного прохимозина все чаще используют системы экспрессии на базе дрожжей. Введение в клетки реципиента конструкции, содержащей ген прохимозина, объединенный с дрожжевым сигнальным пептидом, позволяет обеспечить секрецию прохимозина из клетки и широко используется в настоящее время для биосинтеза животного прохимозина в дрожжевых системах экспрессии K. lactis [BioTechnology, 1990, 8, 135-139], S. cerevisiae [Journal of Biotechnology, 2004, 114, 69-79], K. phaffii (P. pastoris) [J Agric Food Chem., 2008, 56, 10606-10610; World J Microbiol Biotechnol., 2012, 28, 2087-2093. DOI 10.1007/s11274-012-1012-7].

Дрожжи секретируют незначительное количество собственных белков в культуральную жидкость, что облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Наиболее часто для высокоэффективной продукции гетерологичных белков используются метилотрофные дрожжи K. phaffii [Journal of Biotechnology, 2015, 202, 118-134. http://dx.doi.org/l0.1016/j.jbiotec.2015.01.027: J Cell Physiol. 2020, 1-15. DOI: 10.1002/jcp.29583; Biomolecules, 2023, 13, 441. https://doi.org/10.3390/biom13030441], которые обладают мощными системами экспрессии и секреции рекомбинантных белков (в том числе, прохимозина) и для которых разработан экономичный процесс культивирования на минеральной среде с глюкозой или с использованием несбраживаемых источников углерода (глицерин, метанол и др.) в культуре высокой плотности клеток, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol.Rev., 2000, 24:45-66, doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014, 98, 5301-5317. DOI 10.1007/s00253-014-5732-5].

Известны примеры создания продуцентов прохимозина на основе дрожжей K. phaffii. Большинство описанных рекомбинантных штаммов K. phaffii секретируют в культуральную жидкость (КЖ) неактивный прохимозин, активацию которого осуществляют in vitro в кислой среде при рН 2.0-3.0 с последующей нейтрализацией до рН 6.0.

В работе [Protein Expression and Purification, 2015, 111, 75-81] описан штамм K. phaffii (P. pas tor is) GS115, который содержит ген прохимозина одногорбого верблюда в рамке с сигнальной последовательностью MFα, транскрипция которого контролируется промотором гена АОХ1. При культивировании в 5 л ферментере в оптимальных условиях продуцент через 144 ч ферментации набирает 270 г/л сырой биомассы и секретирует 0.3 мг/мл прохимозина. После активации прохимозина молокосвертывающая активность химозина составляет 4000 ед./мл.

В работе [Biology, 2022, 11, 1545. https://doi.org/10.3390/biology11111545] описан штамм P. pastoris GS115, который содержит плазмиду pGAPZαA/ProchymCB с геном прохимозина двугорбого верблюда Camelus bactrianus, транскрипция которого находится под контролем конститутивного промотора pGAP. При культивировании в 50 л ферментере в богатой среде YECB, приготовленной на цитрат-фосфатном буфере (рН 4.0), и при оптимальных условиях продуцент через 120 ч ферментации секретирует прохимозин, молокосвертывающая активность фермента после кислотной активации составляет 225 SU/мл

Исключение этапа кислотной активации целевого фермента в КЖ снижает время получения ферментного препарата и его себестоимость.

Рекомбинантный химозин в активной форме способны секретировать нитевидные грибы, такие как Trichoderma reesei и Aspergillus oryzae [J. Biotechnol. 1991, 17, 35-49; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993, 40, 327-332], однако культивирование грибных продуцентов в ферментере экономически затратно.

Впервые способ получения активного рекомбинантного химозина буйвола, секретируемого клетками дрожжей описан в [ЕР 2216402 A1; J. Agric. Food Chem., 2008, 56, 10606-10610. DOI:10.1021/jf802339e]. Ген прохимозина буйвола (buffalo Bubalus arnee bubalis) клонируют в интегративный экспрессионный вектор pGAPZαA (Invitrogen) с промотором гена GAP и трансформируют в клетки P. pastoris GS115. Штамм-продуцент при культивировании в колбах в среде YPD при 30°С и 300 rpm секретирует в КЖ химозин, не требующий стадии аутокаталитической активации. Молокосвертывающая активность фермента составляет 720 ед./мл после 140 ч культивирования.

В работе [Protein Expression and Purification, 2013, 92, 235-244. http://dx.doi.org/10.1016/j.pep.2013.08.018] описан трансформант P. pastoris GS115, содержащий в геноме несколько копий гена прохимозина В быка с оптимизированными для дрожжей P. pastoris кодонами под контролем промотора гена АОХ1. Культивирование осуществляют в 7 л ферментере и на стадии индукции метанолом снижают температуру с 30°С до 25°С и поддерживают рН среды равным 4.0. Молокосвертывающая активность рекомбинантного химозина, образующегося в культуральной жидкости, составляет 48 IMCU/мл КЖ.

В патенте [RU 2729403] описано получение трансформанта Escherichia coli - продуцента рекомбинантного химерного белка прохимозина, содержащего ген прохимозина альпака V. pacos с оптимизированными для Е. coli кодонами, объединенный на N-конце с последовательностью тиоредоксина для улучшения рефолдинга.

Ген прохимозина альпака V. pacos, кодирующий прохимозин, прежде не был экспрессирован в дрожжах.

Одним из способов, позволяющих повысить продукцию целевых белков в K. phaffii, является суперэкспрессия генов-помощников, входящих в систему ответа клетки на несвернутый белок (UPR - unfolded protein response) [ВМС Genomics, 2007, 8, 18. https://doi.org/10.1186/1471-2164-8-179; New Biotechnol., 2014, 31, 538-552. https://doi.org/l0.1016/j.nbt.2014.02.009]. В качестве таких генов в дрожжах K. phaffii могут быть использованы НАС1, кодирующий транскрипционный фактор для UPR генов, PDI1, кодирующий протеин дисульфидизомеразу, и KAR2, кодирующий эндоплазматический шаперон.

Известно, что суперэкспрессия гена НАС1 по-разному влияет на продукцию различных ферментов [Microb. Cell Factories, 2010, 9, 49. https://doi.org/10.1186/1475-2859-9-49: Biotechnol Lett, 2018, 40, 1149-1156. https://doi.org/10.1007/s10529-018-2571-у], и при существующем состоянии знаний в данной области, вспомогательные (хелперные) функции гена НАС1 не могут быть предсказаны даже в случае доступности геномного сиквенса штамма-реципиента [ЕА017803].

В источниках информации сведений о влиянии сверхэкспрессии гена НАС1 из S. cerevisiae на продукцию клетками К. phaffii прохимозина нами не выявлено.

Описание изобретения

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала дрожжевых рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих химозин альпака Vicugna pacos в активной форме.

Задача решена путем создания трансформанта дрожжей Komagataella phaffii, продуцирующего химозин альпака Vicugna pacos в активной форме и содержащего в хромосомной ДНК оптимизированный синтетический ген, кодирующий прохимозин альпака из Vicugna pacos, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, и ген НАС1 из Saccharomyces cerevisiae Оптимизированная, синтетическая последовательность нуклеотидов создана на основе аминокислотной последовательности прохимозина альпака V. pacos (NCBI Reference sequence: ХР_031536138.1) с учетом данных о частоте встречаемости кодонов в геноме метилотрофных дрожжей (http://www.kazusa.or.jp/codon/P.html). Полученная последовательность (далее Vp-prochy-opt), размером 1101 п.н. приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.

Получение заявляемого трансформанта включает трансформацию в клетки дрожжей К. phaffii гена Vp-prochy-opt, кодирующего прохимозин из V. pacos, и гена НАС1 из S. cerevisiae (далее ScHAC1) Трансформация указанных генов может быть осуществлена в любой последовательности, любым подходящим методом, например, методом электоропорации [http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pich_man.pdf] или методом с использованием полиэтиленгликоля или протопластов [http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K173001].

Интеграцию осуществляют путем как гомологичной, так и негомологичной рекомбинации.

Конструирование экспрессионных кассет осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. — N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] с использованием генетических

элементов, подходящих для работы с дрожжами К. phaffii.

В качестве промоторов могут быть использованы АОХ1, DAS, FLD1, ICL1, PHO89, THI11, ADH1, ENO1, GUT1, GAP, TEF1, PGK1, GCW14 или другие [Appl. Microbiol. Biotechnol, 2014, 98, 5301-5317].

В качестве сигнальных пептидов используют, например, пре-пролидерную последовательность MFα из Saccharomyces cerevisiae или последовательности PHO1, SUC2, PHA-E, KILM1, pGKL, CLY, CLY-L8, K28 pre-pro-toxin или другие [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014, 98, 5301-5317].

В качестве селективных маркеров используют любые подходящие маркеры, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, генетицину (G418) или бластицидину С, а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме K. phaffii, например, HIS4, МЕТ2, ADE1, ARG4, URA3, URA5, GUT1 [Yeast, 2005, 22, 249-270].

В качестве плечей для гомологичной интеграции используют, например, последовательности генов АОХ1, HIS4 [http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей K. phaffii.

Полученные трансформанты тестируют на стабильность фенотипов «прототрофность по гистидину» и «устойчивость к генетицину (G418) и на наличие целевого гена Vp-prochy-opt и гена ScHAC1 в составе хромосомной ДНК.

Исследование молокосвертывающей активности культуральной жидкости, полученной в результате культивировании сконструированного трансформанта показывает, что она содержит активную форму фермента - химозин, который образуется из прохимозина аутокаталитически без проведения in vitro кислотной активации.

Пример 1. Получение штамма K. phaffii, содержащего синтетический ген, кодирующий прохимозин из V pacos.

Последовательность гена Vp-prochy-opt с оптимизированными для метилотрофных дрожжей кодонами размером 1101 п.н., кодирующего прохимозин из альпака V. pacos, синтезируют методом, описанным в [Journal of Microbiological Methods, 2010, 81(2), 147-152], и получают ДНК последовательность, приведенную в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.

При конструировании интегративной экспрессионной кассеты используют метод "фьюжн-ПЦР'' [Gene, 1989, 77(1), 61-68].

Получают экспрессионную кассету размером 6870 п.н. (фиг. 1), в состав которой входят следующие генетические элементы:

1. Синтетический ген прохимозина Vp-prochy-opt, встроенный в рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида MFα, под контролем промотора pAOX1;

2. Терминатор транскрипции tAOX1;

3. Дрожжевой селективный маркер HIS4, комплементирующий у дрожжей K. phaffii мутацию в гене HIS4;

4. Область интеграции - нуклеотидную последовательность 3'-АОХ1 локуса АОХ1.

Интегративную экспрессионную кассету трансформируют в штамм K. phaffii GS115 ВКПМ Y-2837 (his4^-), который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1×10⁸ клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 мин. и промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Далее клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 40 мкл клеточной суспензии переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты и инкубируют на льду 5 мин. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. Затем к клеткам добавляют 1 мл раствора 1М сорбитола, переносят в пробирки на 1.5 мл и инкубируют в шейкере при 30°С в течение 1 ч.

Селекцию трансформантов ведут в течение 5 суток при температуре 30°С на агаризованной среде ММ следующего состава (мас. %): Na₂HPO₄ - 0,6; KH₂PO₄ - 0,3; NaCl - 0,05; NH₄Cl - 0,1; MgSO₄ 7H₂O - 0,065; агар - 2; глюкоза - 2; CaCl₂ - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин - 0,04; р-аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; CuSO₄ - 0,004; KJ - 0,01; FeCl₃ - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO₄ - 0,04, вода - остальное.

При трансформации дрожжей K. phaffii появляются как стабильные, интегративные, так и репликативные трансформанты. Отбор наиболее продуктивных трансформантов осуществляют среди стабильных трансформантов, содержащих кассету в составе хромосомной ДНК.

Тестирование на стабильность наследования признака «прототрофность по гистидину» проводят следующим образом. Трансформант K. phaffii растят в неселективных условиях, в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %), в пробирках на качалке при 30°С в течение 24 ч, затем производят пять последовательных пересевов культуры из неселективных условий в пробирки со свежей средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %). Пробирки инкубируют на качалке при 30°С в течение 24 ч. Затем рассевают культуру до отдельных колоний на чашки Петри с агаризованной неселективной средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %). С помощью репликатора отбирают 100 независимых колоний и анализируют их на способность расти на селективной среде ММ и контрольной среде - ММ с гистидином (20 мкг/мл). Отсутствие колоний, не растущих на селективной среде ММ, указывает на то, что экспрессионная кассета содержится в клетках трансформантов в составе хромосомной ДНК.

Наличие целевого гена прохимозина в составе хромосомной ДНК отобранных интегративных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием олигонуклеотидов Vp-prochy-F: tctggtattaccagaatccctttgcac и Vp-prochy-R: ttatcagatggccttagcaagacccac. Наличие ПЦР-фрагментов размером 1101 п.н. подтверждает присутствие синтетического гена прохимозина в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов. В качестве отрицательного контрольного образца используют хромосомную ДНК из штамма-реципиента K. phaffii GS115 ВКПМ Y-2837.

Исследования показывают, что стабильные трансформанты содержат ген прохимозина в хромосомной ДНК.

Отбирают 10 стабильных трансформантов, содержащих ген прохимозина в хромосомной ДНК.

Отбор трансформантов с наибольшей молокосвертывающей активностью осуществляют по результатам их культивирования в пробирках по следующей схеме:

- Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.

- Ферментацию проводят в питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 6 дней на качалке (250 об/мин) с температурой 30°С на стадии роста и 25°С на стадии индукции метанолом. Через 24 ч культивирования начинают индукцию метанолом, который добавляют в количестве 3 об. %, затем такое же количество метанола добавляют на 48 ч культивирования. В качестве контроля используют штамм-реципиент K. phaffii GS115 ВКПМ Y-2837. По окончании культивирования рН культуральной жидкости составляет 6.0.

Клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а супернатант (КЖ) используют для определения молокосвертывающей активности.

Молокосвертывающую активность определяют по времени, которое необходимо для видимого выпадения хлопьевидного осадка стандартного молочного субстрата, приготовленного из сухого молока низкотемпературного сгущения с низким содержанием жира в растворе хлорида кальция (CaCl₂) с концентрацией 0,5-1.5 г/л. рН раствора стандартного молочного субстрата 6.5. Время свертывания субстрата образцом молокосвертывающего фермента сравнивают с временем для эталонного стандарта, имеющего известную молокосвертывающую активность.

Молокосвертывающую активность (МА) рассчитывают по уравнению:

МА=МАст × Тст × Kобр/Kст × Тобр

где МАст - молокосвертывающая активность эталонного стандарта сычужного фермента;

Тст - продолжительность свертывания субстрата в реакции с образцом стандарта сычужного фермента, измеренная в секундах (сек);

Кобр - коэффициент разведения для образца;

Кст - коэффициент разведения для стандарта;

Тобр - продолжительность свертывания субстрата в реакции с образцом рекомбинантного фермента от добавления фермента до выпадения хлопьевидного осадка (сек).

Для определения используют сухой молочный субстрат Nonfat dried milk powder (PanReac, AppliChem, Barcelone, Испания). В день измерения готовят 11% раствор субстрата в 0.01М растворе СаСl₂, приготовленном на воде.

Активность исследуемых образцов определяют относительно контрольного образца сычужного фермента Clerici 9604, арт. 2729, активность: 65000 УЕ/г (Caglificio Clerici Spa, Италия). Это жидкий препарат, 1 мл которого весит 1,08±0.005 г. Готовят разведения стандарта в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5.5 с активностями от 50 УЕ/мл до 500 УЕ/мл с шагом 50 УЕ/мл.

Определение молокосвертывающей активности проводят при температуре 32°С в твердотельном термостате Гном (ДНК технология, Россия).

В пробирки на 1,5 мл добавляют 1 мл субстрата и выдерживают при 32°С в течение 10 мин. К субстрату добавляют 0,1 мл анализируемого образца или стандарта, быстро перемешивают и ставят в твердотельный термостат Гном при 32°С, одновременно включая секундомер. При появлении первых признаков коагуляции (появление хлопьев), которую фиксируют путем периодического переворачивания пробирок, регистрируют время свертывания по секундомеру. То же самое проводят с использованием разбавленных образцов стандарта с известной активностью. В качестве негативных контролей к субстрату добавляют буфер вместо фермента или КЖ штамма реципиента.

В табл.1 приведены результаты тестирования молокосвертывающей активности рекомбинантного фермента, содержавшегося в КЖ (приведены средние значения трех независимых измерений).

Среди проверенных трансформантов отбирают наиболее продуктивный трансформант K. phaffii N416, который при культивировании в пробирках продуцирует рекомбинантный химозин с активностью 150 УЕ/мл КЖ.

Пример 2. Получение трансформантов, несущих в составе хромосомы ген НАС1 из S. cerevisiae

В качестве источника гена ScHAC1 используют геномную ДНК штамма S. cerevisiae S288C ВКПМ Y-3315. Геном штамма S. cerevisiae S288C секвенирован [GENETICS, 2022, 220(4), iyab224. https://doi.org/10.1093/genetics/iyab224]. Синтезируют последовательность гена ScHAC1 без интрона методом "фьюжн-ПЦР'' [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.] с использованием пар праймеров:

- HAC1-fus1-F: 5'-caactatcaaagatccaaacgatggaaatgactgattttgaac-3' и НАС1-fus1-R: 5'-aattcaaacctgactgcgcttctggattacgccaattgtcaa-3';

- HAC1-fus2-F: 5'-ttgacaattggcgtaatccagaagcgcagtcaggtttgaatt-3' и HAC1-fus2-R: 5'-cgaattaattcgcggccgctcatgaagtgatgaagaaatcattc-3'.

Получают последовательность нуклеотидов гена ScHAC1 размером 717 п.н., идентичную последовательности NCBI Reference Sequence: NM_001179935.1, содержащую на флангах последовательности, необходимые для конструирования экспрессионной кассеты.

При конструировании экспрессионной кассеты 2 также используют метод "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.].

В отобранный штамм K. phaffii N416 трансформируют, как описано в примере 1 экспрессионную кассету 2 размером 4820 п.н., содержащую в своем составе следующие генетические элементы:

1. Ген ScHAC1, кодирующий транскрипционный фактор Hac1p из S. cerevisiae, под контролем промотора гена GAP, кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу;

2. Терминатор транскрипции tAOX1;

3. Дрожжевой селективный маркер KmMX, обеспечивающий устойчивость к генетицину (G418) клеткам дрожжей K. phaffii;

4. Область интеграции - 3' - фрагмент последовательности гена АОХ1.

Трансформанты отбирают на селективной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином в концентрации 200 мкг/мл.

Тестирование на стабильность наследования признака «устойчивость к генетицину» проводят следующим образом. Трансформант K. phaffii растят в неселективных условиях, в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %), в пробирках на качалке при 30°С в течение 24 ч, затем производят пять последовательных пересевов культуры из неселективных условий в пробирки со свежей средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %). Пробирки инкубируют на качалке при 30°С в течение 24 ч. Затем рассевают культуру до отдельных колоний на чашки Петри с агаризованной неселективной средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %). С помощью репликатора отбирают 100 независимых колоний и анализируют их на способность расти на селективной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином в концентрации 200 мкг/мл и контрольной среде - YP с глюкозой (2 мас. %). Отсутствие колоний, не растущих на селективной среде, указывает на то, что экспрессионная кассета содержится в клетках транс формантов в составе хромосомной ДНК.

Наличие целевого гена ScHAC1 в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПНР с использованием проверочных праймеров HAC1-F: 5'-atggaaatgactgattttgaactaacta-3' и НАС1-R: 5'-tcatgaagtgatgaagaaatcattcaattc-3'. Наличие ПЦР-фрагмента размером 717 п.н. подтверждает присутствие гена ScHAC1 в составе хромосомы полученных трансформантов. В качестве отрицательного контрольного образца используют хромосомную ДНК из штамма K. phaffii N416.

Исследования показывают, что трансформанты, устойчивые к генетицину, содержат ген ScHAC1 в хромосомной ДНК.

Пример 3. Оценка активности химозина при культивировании трансформантов, несущих в составе хромосомы ген ScHAC1 из S. cerevisiae

Произвольно отбирают 10 трансформантов, содержащих ген ScHAC1 в составе хромосомы. Для контрольной ферментации используют родительский штамм K. phaffii N416, который не несет в составе хромосомы ген ScHAC1. Ферментацию проводят при следующих условиях:

- Посевную культуру каждого трансформанта и контрольного штамма выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.

- Ферментацию проводят в питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 6 дней на качалке (250 об/мин) с температурой 30°С на стадии роста и 25°С на стадии индукции метанолом. Через 24 ч культивирования начинают индукцию метанолом, который добавляют в количестве 3 об. %, затем такое же количество метанола добавляют на 48 ч культивирования.

Клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а супернатант (КЖ) используют для определения молоко свертывающей активности.

Стандартный метод определения активности прохимозина в КЖ состоит из двух этапов. На первом этапе проводят аутокаталитическую активацию прохимозина в химозин путем титрования КЖ кислотой до рН 2.0-3.0, выдерживают образцы в кислой среде в течение 2 ч, затем проводят нейтрализацию до рН 6.0. На втором этапе определяют способность фермента в КЖ коагулировать молоко с низким содержанием жира.

С целью проверки наличия в КЖ активной формы фермента (химозина) до проведения кислотной активации в качестве сравнения было проведено исследование молокосвертывающей способности одних и тех же образцов КЖ, взятых непосредственно после культивирования (без подкисления) и после проведения кислотной активации.

Для аутокаталитической активации прохимозина в химозин к 0.15 мл КЖ в пластиковой пробирке на 1.5 мл, содержащей рекомбинантный фермент, вносят 0.015 мл 1М HCl, постоянно перемешивания. рН смеси при этом составляет 2.0. Инкубируют смесь при 25°С в течение 2 ч. По истечении времени инкубации доводят рН образца до 6.0, для этого к смеси добавляют 0.0066 мл раствора 2 М Tris (рН 12.0), перемешивают и выдерживают при 25°С в течение 1-2 ч. Коэффициент разведения КЖ составляет 1.144.

Молокосвертывающую активность в УЕ/мл определяют, как описано в примере 1, относительно эталонного стандарта сычужного фермента Clerici 9604 в образцах КЖ, взятых непосредственно после культивирования и после проведения кислотной активации. Соотношение «субстрат: фермент» при проведении реакции составляет 50: 1.

В табл. 2 представлены результаты определения молокосвертывающей активности контрольного штамма K. phaffii N416 и 10 трансформантов, несущих в составе хромосомы ген ScHAC1 из S. cerevisiae.

Из результатов измерений, представленных в табл. 2, следует, что молокосвертывающая активность рекомбинантного фермента в образцах КЖ одинакова до и после проведения кислотной активации. Это указывает, что рекомбинантный фермент изначально, до кислотной активации содержится в КЖ в активной форме, т.е. в виде зрелого химозина. Из результатов измерений, представленных в табл.2, также следует, что экспрессия гена ScHAC1 значительно (в 4 раза и более) повышает молокосвертывающую активность рекомбинантного химозина альпака V. pacos.

Среди проверенных трансформантов отбирают трансформант K. phaffii N509, несущий в составе хромосомной ДНК ген прохимозина из альпака V. pacos и ген ScHAC1 из S. cerevisiae, который при культивировании в пробирках продуцирует рекомбинантный химозин с активностью 800 УЕ/мл КЖ.

Отобранный трансформант K. phaffii N509 депонируют в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1) как штамм Komagataella phaffii N509 ВКПМ Y-5150

Штамм K. phaffii N509 ВКПМ Y-5150 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:

При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.

При росте в жидкой среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.

Физиолого-биохимические признаки:

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.

При культивировании в присутствии метанола штамм способен синтезировать рекомбинантный химозин - коагулянт молока.

Пример 4. Культивирование штамма K. phaffii N509 в 3 л ферментере

Из суточной биомассы штамма K. phaffii N509 с чашки Петри со средой YP с глюкозой (2 мас. %) готовят суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде для определения оптической плотности (OD₆₀₀). В качалочные колбы объемом 750 мл с рабочим объемом 110 мл жидкой посевной среды YP с глюкозой (2 мас. %) вносят приготовленную суспензию клеток до получения OD₆₀₀, равной 0.2 единиц. Колбы инкубируют при температуре 30°С на качалке при 220 об/мин. в течение 16 ч. Оптическая плотность посевной культуры равняется 10.2.

Основную ферментацию проводят в ферментере КФ-103 (ООО-фирма «Проинтех») объемом 3 л, содержащем 1 л среды следующего состава (табл. 3).

Раствор микроэлементов РТМ1 имеет состав (табл. 4).

Условия ферментации: объемная доля посевного материала 10%; температура 30°С на этапе роста, температура 25°С на этапе биосинтеза; начальное перемешивание: 500 об/мин., начальная аэрация: 1.0 л воздуха на каждый л начальной среды в мин. Уровень рН поддерживают на значении 4.6 путем титрования 25%-ным водным раствором аммиака, а значение pO₂ -на уровне 25.0% (от насыщения среды воздухом) путем использования каскадной регулировки скорости вращения мешалки.

В рабочий ферментер вносят культуру, выращенную на качалке в колбах до стартового значения оптической плотности, равной 2.6. Наращивание биомассы осуществляют в два этапа. На первом этапе (20 часов) рост биомассы производят на глюкозе, введенной в ферментер с начальной средой. На втором - наращивание биомассы обеспечивают путем подачи в ферментер глюкозной подпитки состава (мас. %): глюкоза - 28.6, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.1 (об./об.), биотин - 0.0004, вода - остальное. На момент окончания глюкозной подпитки концентрация сырой биомассы составляет 154 г/л.

Далее в ферментер подают раствор метанольной подпитки состава (мас. %): метанол - 95.9, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.4 об./об., биотин - 0.0004, вода - остальное со скоростью, обеспечивающей потребности штамма: с начальной скоростью 1.2 г/ч с постепенным увеличением до 7.2 г/л. На момент окончания культивирования (163 ч) концентрация сырой биомассы составляет 350 г/л.

В процессе культивирования заявляемого штамма периодически отбирают образцы КЖ для определения молокосвертывающей активности. Клетки осаждают центрифугированием, а супернатант (КЖ) используют для определения молокосвертывающей активности.

Аутокаталитическую активацию рекомбинантного фермента in vitro не проводят.

Молокосвертывающую активность определяют, как описано в примере 1. В качестве эталонного стандарта сычужного фермента используют Clerici 9604, арт.2729, активность 65000 УЕ/г, (Caglificio Clerici Spa, Италия). Молокосвертывающую активность выражают в условных единицах на 1 мл препарата (УЕ/мл). Соотношение «субстрат: фермент» при проведении реакции составляет 50: 1. Образцы КЖ, содержащие фермент, разводят водой в 10 и 20 раз перед проведением реакции.

Результаты приведены в табл. 5.

Рекомбинантный фермент секретируется штаммом-продуцентом в КЖ и содержится в ней в форме активного химозина, т.е. активация целевого фермента не требуется.

Заявляемый штамм K. phaffii N509 является перспективным продуцентом химозина. Молокосвертывающая активность полученного штамма составляет 18000 УЕ/мл КЖ (относительно стандарта Clerici 9604) через 163 ч культивирования.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Transformant Komagataella phaffii containing HAC1 gene,

producer of recombinant Vicugna pacos chymosin in active form.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-08-16">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>16-8.2023</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Национальный исследовательский

центр &quot;Курчатовский институт&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>National Research Centre &quot;Kurchatov

Institute&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Трансформант Komagataella phaffii,

содержащий ген HAC1, продуцент рекомбинантного химозина Vicugna pacos

в активной форме</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1101</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1101</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tctggtattaccagaatccctttgcacaaaggaaagactttgagaaaag

ctttgaaggagcatggacttttggaggactttttgcagagacaacagtatgctgtttcttctaagtactc

ctctttgggtaaggtggctagggaaccattgacctcttacttggattctcagtactttggtaagatctac

attggtactccacctcaggagttcactgttgtttttgacactggatcttctgacttgtgggtgccatcta

tctactgcagatctaacgtttgcaaaaaccaccacagatttgaccctagaaagtcttccactttcagaaa

cttgggtaagcctttgtctattcattacggaactggttctatggagggttttttgggatacgacactgtt

acggtttctaacattgttgaccctaaccaaactgttggattgtctactgagcaacctggagaggttttca

cctactccgaatttgacggtatcctggggctggcctacccctctttggcctccgaatactctgttccagt

ttttgacaatatgatggacagacacttggttgctcaagacttgttctctgtttacatggacagaaacggt

caaggatctatgttgactttgggtgctattgacccatcttactacaccggatctttgcactgggttccag

ttactgttcaacaatactggcaattcaccgtggactctgtcactatcaacggtgttgctgttgcctgtgt

tggtggatgtcaggctattttggacactggtacctctgttttgtttggaccatcttccgacattcttaaa

attcagaaggctattggtgctactgagaacagatatggagagtttgacgttaactgtggatctttgagat

ctatgcctactgttgtcttcgagatcaatggtagagactacccattgtccccatctgcctacacatctaa

ggaccaaggtttctgcacttctggatttcaaggtgacaacaattccgagctatggatccttggtgatgtc

ttcatcagagagtattactctgtctttgacagagctaacaatcgtgtgggtcttgctaaggccatctgat

aa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен трансформант дрожжей Komagataella phaffii, продуцирующих химозин Vicugna pacos в активной форме, содержащий в хромосомной ДНК оптимизированный синтетический ген прохимозина альпака Vicugna pacos, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, и ген ScHAC1 из Saccharomyces cerevisiae. Также предложен штамм Komagataella phaffii N509 ВКПМ Y-5150, являющийся продуцентом рекомбинантного химозина альпака Vicugna pacos в активной форме. Изобретение обеспечивает расширение арсенала дрожжевых рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих химозин альпака Vicugna pacos в активной форме. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Трансформант дрожжей Komagataella phaffii - продуцент химозина альпака Vicugna pacos в активной форме, содержащий в хромосомной ДНК оптимизированный синтетический ген прохимозина альпака Vicugna pacos, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, и ген ScHAC1 из Saccharomyces cerevisiae.

2. Штамм Komagataella phaffii N509 ВКПМ Y-5150 - продуцент рекомбинантного химозина альпака Vicugna pacos в активной форме.