СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОГИПОКСИЧЕСКОЙ, АКТОПРОТЕКТОРНОЙ, НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЯМИ И ВЛИЯЮЩЕЕ НА ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБНОСТЬ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/4188 A61K31/4184 A61P39/02 A61P7/06 

Изобретение относится к фармакологии, а именно к биологически активным веществам, обладающим противогипоксической, актопротекторной, ноотропной активностями и положительным влиянием на физическую работоспособность, которые могут быть использованы при создании лекарственных препаратов для лечения гипоксических состояний различного генеза, повышения работоспособности, лечения когнитивных расстройств.

Гипоксия - типовой патологический процесс, осложняющий течение различных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы [И.В.Коваль, Н.В.Вдовенко и др. Современные подходы к фармакологической коррекции гипоксических состояний // Спортивная медицина. - 2008. - №1. - С.36-41]. Несмотря на различие инициирующих механизмов развития гипоксии при тех или иных формах патологии, приводящих к расстройствам системной гемодинамики, регионарного кровотока, микроциркуляции, изменениям качественного и количественного состава крови, активности ферментов тканевого дыхания, результирующим метаболическим сдвигом при гипоксии является недостаточность окислительно-восстановительных процессов и энергообеспечения тканей [Л.Д.Лукьянова. Сигнальная функция митохондрий при гипоксии и адаптации // Патогенез. - 2008. - №3. - С.4-12].

Как известно, характерными особенностями гипоксического синдрома являются чрезмерное накопление промежуточных метаболитов гликолиза, липолиза, протеолиза, развитие метаболического ацидоза с последующими вторичными неспецифическими метаболическими и функциональными нарушениями, усугубляющими течение основного заболевания. Под влиянием избытка ионов водорода в условиях гипоксии возникает повышение проницаемости лизосомальных мембран и, соответственно, развитие деструктивных процессов в тканях под влиянием лизосомальных гидролаз. Последние инициируют образование эйкозаноидов и простаноидов, в процессе взаимного превращения которых возникают свободные радикалы (СР) [М.Н.Бизенкова, М.Г.Романцов, Н.П.Чеснокова. Метаболические эффекты антиоксидантов в условиях острой гипоксической гипоксии. // Фундаментальные исследования. - 2006. - №1. - С.17-21]

Причиной избыточного образования СР при гипоксии может являться блокада конечного звена дыхательной цепи в митохондриях, утечка электронов по пути следования к цитохромоксидазе, что приводит к одноэлектронному восстановлению кислорода с образованием его активных форм. Как известно, в условиях гипоксии усиливается трансформация ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу, инициирующую образование супероксидного анион-радикала. В то же время активация симпатоадреналовой системы, наблюдающаяся при гипоксии различного генеза, также сопровождается усилением образования активных форм кислорода (АФК) при аутоокислении адреналина [Н.П.Чеснокова, М.Г.Романцов и др.. Активация процессов липопероксидации - эфферентное звено дезинтеграции клеточных структур при острой гипоксической гипоксии // Успехи современного естествознания. - 2007. - №7. - С.42-45].

Для коррекции гипоксических состояний используются антигипоксанты, такие как гутимин [И.В.Зарубина, П.Д.Шабанов Молекулярная фармакология антигипоксантов. // СПБ.:ООО «Изд-во Н-Л», 2004. - 368 с.] Вместе с тем, являясь одним из эталонных антигипоксантов в эксперименте, гутимин не нашел широкого клинического применения.

Таким образом, одним из главных звеньев системных функциональных и метаболических расстройств при гипоксических состояниях является активация свободно-радикальных процессов (СРП) и, в частности, перекисное окисление липидов. В связи с этим, очевидна значимость применения антиоксидантных средств при гипоксических повреждениях [В.В.Абрамченко, Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве (оксидативный стресс в акушерстве и его терапия антиоксидантами и антигипоксантами) - СПб.: Деан, 2001. - 400 с.].

Проблема повышения работоспособности стала особенно актуальной в последнее время в связи с быстрым научно-техническим прогрессом. Наряду с физическими тренировками, психическим аутотренингом, медитацией, физиотерапевтическими методами перспективным является разработка лекарственных препаратов, повышающих работоспособность человека [Бобков Ю.Г., Виноградов В.М., Катков В.Ф., Лосев С.С., Смирнов А.В. Фармакологическая коррекция утомления // М. - Медицина. - 1984. - 208 с.; Смирнов А.В. Психомоторные стимуляторы как средства повышения работоспособности. // Фармакол. и токсикол. - 1990. - №4. - С.72-77; Морозов И.С. Новые направления создания лекарственных средств повышения работоспособности человека в экстремальных условиях среды обитания и деятельности // Росс. научн. конф.: Антигипоксанты и актопротекторы: Итоги и перспективы. - Санкт-Петербург, 1994. - Вып.III. - С.196].

В настоящее время проблемы создания и применения лекарственных препаратов для повышения работоспособности человека разрабатываются в основном в рамках фармакологии здорового человека и особый интерес представляют для спортивной, военной и космической медицины [Р.Д.Сейфулла. Применение лекарственных средств здоровым человеком. Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1994. - №3. - С.3-7]. При этом не предполагается лечения больных, а применение фармакологических средств носит скорее профилактический характер, помогая преодолеть явления переутомления и перенапряжения центральной и периферической нервной системы, функций двигательного аппарата, систем и органов.

Кроме того, данная проблема имеет и чисто клинический аспект. Он заключается в том, что в современной клинической медицине все большее значение придается реабилитационным направлениям. Вернуть больному трудоспособность, повысить у него работоспособность, хотя бы с целью самообслуживания, очень важная задача, стоящая перед врачами в реабилитационном периоде после инфаркта миокарда, инсультов, тяжелых инфекционных заболеваний или хирургических вмешательств [Е.И.Чазов. Очаговые дистрофии и некрозы миокарда (инфаркт миокарда) // Руководство по кардиологии в 4-х томах. - М.: Медицина. - 1982. - Т.3. - С.49-107; Карлов В.А. Терапия нервных болезней: (Руководство для врачей) - М.:Медицина. - 1987. - 512 с.]. Неоднократно отмечалось, что повышение работоспособности больного, выражающееся в увеличении объемов физических нагрузок является ключевым моментом в его психологической и социальной реабилитации [Г.И.Косицкий. Преодоление гипокинезии. // В кн. Превентивная кардиология: Руководство. - М.:Медицина. - 1987. - С.401-415]. Несомненно применение в этом направлении лекарственных средств, повышающих работоспособность, имеет достаточно большие перспективы. Одним из известных актопротекторов является производное бензимидазола - бемитил [И.В.Зарубина, П.Д.Шабанов. Молекулярная фармакология антигипоксантов. // СПБ.:ООО «Изд-во Н-Л», 2004. - 368 с.].

Для повышения работоспособности часто применяют актопротекторы, наиболее известным из них является производное бензимидазола - препарат бемитил. Актопротекторы не только повышают работоспособность, но и представляют собой группу лекарственных препаратов, обладающих свойством нормализовать и улучшать нарушенные функции организма, вызванные патологическими процессами и стрессорными воздействиями.

Разработка современных актопротекторов базируется на представлениях о лимитирующих работоспособность звеньях метаболизма. Очевидным является то, что основными пусковыми негативными факторами, приводящими к снижению работоспособности и развитию утомления, являются кислородная недостаточность (рабочая гипоксия), сочетающаяся с недостаточностью таких энергетических субстратов, как креатинфосфат, гликоген, и накоплением недоокисленных продуктов (лактат), приводящих к развитию ацидоза [Thal L.J., Grundman М., Berg J., Ernstrom K. et al. Idebenone treatment fails to slow cognitive decline in Alzheimer's disease. // Neurology. 2003 Dec 9; 61(11): 1498-502; Vollestad N., Blom P., Effect of varying exercise intensity on glycogen depletion in human muscle fibres // Acta Phisiol. Scand. - 1985. - V.125. - №3. - P.395-405]. Стресс на фоне кислородной недостаточности приводит к резкой активации свободнорадикальных процессов, которые приводят к изменению биофизических свойств мембран, а следовательно к снижению активности мембраносвязанных ферментов, что проявляется нарушением энергообеспечения и, в конечном итоге, лимитирует работоспособность. Эта гипотеза подводит фундаментальный базис под сравнительно успешное использование антиоксидантов в спортивной медицине [Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца // М., Медицина, 1984. - 272 с.; Сейфулла Р.Д., Борисов И.Г. Поблемы фармакологии антиоксидантов. // Фармакология и токсикология. - 1990. - Т.53. - №6. - С.3-10]. При этом собственная антиоксидантная антирадикальная активность существующих актопротекторов, таких как бемитил, выражена слабо [Плотников М.Б., Кобзева Е.А., Плотникова Т.М. Антиокислительные эффекты антигипоксантов при ишемии мозга // Бюл. эксп. Биол. Мед. - 1992. - Т.113, №5. - С.504-506].

Все вышесказанное делает актуальными исследования влияния новых антиоксидантных веществ, проявляющих актопротекторные свойства, на физическую работоспособность и ее восстановление.

Нарушения памяти и способности к обучению сопровождают целый ряд заболеваний и травм ЦНС, но наиболее часто встречается при деменции различной этиологии. Обычно под термином деменция понимают не болезнь, а синдром, представляющий собой совокупность симптомов, которые могут стать причиной когнитивных расстройств и нарушения памяти. К ним относят нарушения ориентации, расстройство внимания, затруднение речи и замедление реакций. Деменция влечет за собой прогрессирующее снижение когнитивных способностей, выходящее за рамки обычных возрастных изменений [Уатмер Р. Болезнь Альцгеймера, деменция и диабет - где связь? Diabetes Voice, 2008, 53 (3), S 19-22]. Причинами развития деменции наряду с нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями могут быть алкогольная и наркотическая зависимости, эндокринные заболевания, инфекции, поражающие ткань головного мозга, энцефалопатии различного генеза [Леманн-Хорн Ф., А.Лудольф. Лечение заболеваний нервной системы. М.: МЕДпресс-информ, 2009. - 528 с.]. Доказана роль стресса в развитии ментальных нарушений [Each Т., Stefano G.B., Fricchione G.L., Benson H. The role of stress in neurodegenerative diseases and mental disorders. Neuro Endocrinol Latt. 2002 23 (3), 199-208]. Среди факторов риска, ассоциированных с развитием деменции, отмечают наличие абдоминального ожирения уже в зрелом возрасте (40-45 лет), снижение физической активности и недостаток в рационе питания ненасыщенных жиров, витаминов С, Е, В₆, B₁₂ и фолиевой кислоты [Р.Уатмер, 2008]. В 2005 г в мире насчитывалось 24,3 млн лиц, страдающих деменцией и ежегодно регистрируется еще 4,6 млн новых случаев [И.В.Колыхалов, Г.А.Рассадина, С.И.Гаврилова. Холинергическая терапия болезни Альцгеймера и ее влияние на здоровье и качество жизни ухаживающих за больными лиц. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. - 2010. - T.110. - №5. - С.33-38].

В целом население всего мира начало стареть быстрее, подсчеты позволяют предположить увеличение общего количества людей с когнитивными расстройствами в течение последующих 25 лет. Традиционно внимание неврологов уделяется двигательным чувствительным и зрительным нарушениям как наиболее явным и инвалидизирующим, а исследованию нейропсихологического статуса отводится второстепенная роль [К.С.Мешкова, И.В.Дамулин. Нарушение памяти при рассеянном склерозе. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова, 2010. - T.110. - №9. - С.8-13]. Несмотря на это нарушение когнитивных функций является серьезной проблемой, т.к. влечет за собой потерю профессиональной пригодности, социально-бытовую и психологическую дезадаптацию больных, ухудшает их качество жизни [А.Ю.Яблонская, Н.В.Федорова, М.Э.Бельгушева. Влияние сульфата амантадина на когнитивные нарушения у пациентов с болезнью Паркинсона. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. - 2010. - Т.110, №7. - С.24-30].

Деменция является проблемой не только самих больных, но членов их семей, осуществляющих уход за пациентами. Рост численности таких больных будет в ближайшие годы становится еще большей нагрузкой и для служб общественного здравоохранения [Колыхалов И.В., 2010]. В силу вышеизложенных фактов поиск средств, обладающих возможностью нивелировать дефицит памяти, восстанавливать способность к обучению, мышлению и повышать интеллектуальные способности при различных заболеваниях, а также у здоровых лиц, является, безусловно, актуальным. Традиционно, с этой целью назначаются препараты, обладающие ноотропной активностью. По определению Всемирной Организации Здравоохранения к группе ноотропных препаратов относятся лекарственные средства, способные оказывать прямое активирующее влияние на процессы обучения, улучшать память и умственную деятельность, а также повышать устойчивость мозга к агрессивным воздействиям.

О чрезвычайной важности препаратов с ноотропной активностью свидетельствуют данные о широком распространении их применения. По статистике ВОЗ, треть взрослого населения Европы и Японии применяют ноотропы, и их с полным основанием можно отнести к группе жизненно важных препаратов [В.И.Охапкина, Т.А.Воронина. Спектр фармакологических эффектов Фенотропила // Фарматека, 2005. - №13 (108). - С.19-25]. На сегодняшний момент выделяют несколько групп препаратов с ноотропной активностью, среди которых моноаминергические стимуляторы, холинопозитивные вещества, глютаматергические препараты, нейропептиды, вещества, влияющие на систему возбуждающих аминокислот и др. [Островская Р.У. Современные стратегии когнитивных нарушений. // Материалы V-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». Москва. - 2010. - С.6]. Известно, что среди группы препаратов, обладающих возможностью влиять на когнитивные функции, и нейропротекторов, находится группа антиоксидантных средств, представленная таким препаратом, как, например, мексидол [В.А.Крайнева. Особенности и механизм нейропротекторного действия Мексидола при геморрагическом инсульте в эксперименте. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006, приложение 1.; Н.И.Нечипуренко, Л.А.Василевская, Т.В.Грибоедова, Н.Ю.Щербина, Ю.И.Мусиенко. Эффективность применения мексидола при экспериментальной ишемии головного мозга. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006, приложение 1.; В.П.Михин, Н.В.Болдина, М.А.Чернятина. Эффективность кардиопротектора мексикор в составе комплексной терапии больных с острой церебральной дисциркуляцией на фоне артериальной гипертонии. // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. - Т.14, №4. - С.43-48]. При этом, антиоксидантная активность мексидола по полученным ранее данным [В.А.Косолапов, А.А.Спасов, В.А.Анисимова. Изучение антирадикальной активности новых соединений методами хемилюминесценции // Биомедицинская химия. - 2005. - Т.51, №3. - С.287-294] незначительна, что делает актуальным поиск новых веществ с ноотропными и антиоксидантными свойствами.

Техническим результатом изобретения является повышение противогипоксической, актопротекторной, ноотропной активностей и положительного влияния на физическую работоспособность.

Технический результат достигается применением дигидробромида 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диоксифенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I

в качестве средства, обладающего противогипоксической, актопротекторной, ноотропной активностями и положительным влиянием на физическую работоспособность.

Технический результат достигается также композицией, содержащей в качестве действующего начала дигидробромид 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диоксифенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I:

взятый в эффективном количестве.

Дигидробромид 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диоксифенил)имидазо-[1,2-а]бензимидазола формулы I известен как биологически активное соединение, проявляющее антиоксидантные свойства (Косолапов В.А., Спасов А.А., Анисимова В.А. Изучение антирадикальной активности новых соединений методами хемилюминесценции. Биомедицинская химия, 2005, т.51, №3, с.287-294; Анисимова В.А., Спасов А.А., Косолапов В.А. и др. Синтез и биологическая активность 9-диалкиламиноэтил-2-окси(диокси)-фенилимидазо[1,2-а] бензимидазолов. Хим.-фарм.журнал, 2006, т.40, №10, с.3-10).

Соединение I проявляет также церебропротекторное действие при радиационных поражениях (Верещагин В.К., Спасов А.А., Анисимова В.А., Сеньчуков И.Д. Производное имидазо[1,2-а]бензимидазола - средство, оказывающее церебропротекторное действие при радиационных поражениях. Пат. РФ №2238938 (2004)).

У соединения I выявлены также противоишемические, гемореологические и антирадикальные свойства (Анисимова В.А., Косолапов В.А., Минкин В.И. и др. Дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола и фармацевтическая композиция на его основе. Патент РФ №2391979 (2010)).

В ряду солей 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диоксифенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола не известны соединения, обладающие противогипоксической, актопротекторной, ноотропной активностями и положительным влиянием на физическую работоспособность.

Способы получения дигидробромида 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтил-аминоэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола I описаны в вышеуказанных статьях и патентах и заключаются в конденсации 1-диэтиламиноэтил-2-аминобензимидазола с 3,4-диметоксифенацилбромидом или 3,4-диоксифенацилхлоридом, последующей циклизации образующихся в результате конденсации галогенидов 1-диэтиламиноэтил-3-(3,4-диметокси(3,4-дигидрокси)фенацил)-2-аминобензимидазолия в 48%-ной бромисто-водородной кислоте (т.кип.127°С), в результате чего образуется искомый продукт I.

Ниже приведены материалы, методы и результаты исследований соединения I.

Опыты выполнены на 416 белых неинбредных мышах обоего пола массой 18-22 г. и 138 белых нелинейных крысах-самцах массой 170-300 г. Животные содержались на стандартном пищевом рационе в условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 40-50%) на стандартной диете с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). На момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было.

1. Противогипоксическая активность

Противогипоксическую активность изучали на моделях гипоксий различного генеза: острой гипобарической и гистотоксической гипоксии. В качестве препарата сравнения был выбран антигипоксант гутимин [Л.В.Пастушенков. Основные методы оценки протекторного действия антигипоксантов в эксперименте и особенности их влияния на обменные процессы в клетке. Фарм. коррекция гипоксических состояний: Сб. науч. тр., НИИ фармакологии РАМН, М., 1989, с.118-124]. Изучаемые средства вводили внутрижелудочно за 1 час до начала эксперимента. Контрольная группа получала растворитель в аналогичном объеме.

Моделирование острой гипобарической гипоксии (ОГБГ), в основе которой лежит снижение рО₂ во вдыхаемом воздухе при уменьшении общего парциального давления, проводили на неинбредных мышах в проточной барокамере при температуре 20-22°С (Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств: Метод. / Под ред. Л.Д.Лукьяновой. - М., 1990. - 18 с.). Тестирование выполняли при разрежении атмосферы, вызывающей гибель животных, которое для мышей составляло 170-186 мм рт.ст., что примерно соответствует высоте 11000 метров. Фиксировали время жизни (Т_ж, мин) на «смертельной площадке» от момента подъема на «площадку» до появления второго агонального вдоха либо летального исхода. Эффективность антигипоксических свойств оценивали по коэффициенту защиты (К_з), вычисляемому по изменению Т_ж опытных животных на «высоте» относительно Т_ж контрольных:

Для моделирования острой гистотоксической гипоксии (ОГТГ), которая является следствием инактивации цитохромоксидазы - фермента терминального участка дыхательной цепи, использовали цианид калия в дозе 9 мг/кг (ЛД₁₀₀) [М.В.Кораблев, П.И.Лукиенко. Противогипоксические средства. // Минск.: Беларусь, 1976, 128 с.], который вводили неинбредным мышам однократно внутрибрюшинно. Расчеты эффективности действия препаратов производили по выживаемости (В_ж, %).

Соединение I на модели гипобарической гипоксии продемонстрировало выраженный защитный эффект, превосходя в дозе 5 мг/кг препарат сравнения гутимин по активности (Таблица 1), увеличивая продолжительность жизни мышей.

Таблица 1 Влияние изучаемых веществ на время жизни животных при острой гипобарической гипоксии, (М±m)^♣ Группа животных Доза, мг/кг Время жизни (Тж), сек (М±m) Коэффициент защиты Контроль - 60,0±3,1 - Соединение I 5,0 82,5±3,2^∗ 1,38   10,0 71,2±3,8 1,19 Контроль - 46,6±2,4 - Гутимин 10,0 60,0±1,8⁺ 1,29 ^♣ - число мышей в каждой группе=10 ^∗ - различия значимы (q') по сравнению с контролем (р≤0,05) ⁺ - препарат вводился трехкратно профилактически

На модели гистотоксической гипоксии соединение I начинало действовать уже в дозе 0,5 мг/кг и при увеличении дозы до 5 мг/кг защитный эффект составил 100% (Таблица 2). Препарат сравнения гутимин проявил умеренную активность, уступая соединению I во всем диапазоне изученных концентраций. Такая высокая активность соединения I на модели тканевой гипоксии может оказаться полезной при заболеваниях, сопровождающихся локальной дезорганизацией или блокадой дыхательной цепи.

Таблица 2 Влияние изучаемых веществ на выживаемость животных при острой гистотоксической гипоксии, (М±m)^♣ Группа животных Доза, мг/кг Количество выживших Выживаемость, % Контроль - 0 - РУ-185 0,5 4 40,0^∗   1,0 8 80,0^∗∗   5,0 10 100,0^∗∗ Контроль - 0 - Гутимин 10,0 0 0,0   20,0 3 30,0   50,0 2 20,0 ^♣ - число мышей в каждой группе=10 В_ж - выживаемость мышей ^∗ - различия значимы (метод Фишера) по сравнению с контролем (р≤0,01) ^∗∗ - различия значимы (метод Фишера) по сравнению с контролем (р≤0,001)

2. Влияния на физическую работоспособность и актопротекторная активность

Влияние соединения I на физическую работоспособность было изучено в следующих сериях исследований:

- влияние веществ при однократном внутрижелудочном введении на физическую работоспособность мышей в тесте плавания до предела с грузом 5% от массы тела;

- влияние веществ при однократном внутрижелудочном введении на физическую работоспособность мышей в тесте скоростного плавания.

Актопротекторную активность изучали на модели плавания в антиортостатическом положении в условиях гипоксии.

Препаратом сравнения служил актопротектор бемитил.

В эксперимент брали животных, не проявивших в предварительном тесте - 15-минутное плавание с грузом 5% от массы тела - явных признаков утомления. Физическую работоспособность животных изучали в плавательном тесте по методу [М.Л.Рылова. Методы исследования хронического действия вредных факторов среды в эксперименте. Л., 1964]. Плавание животных осуществлялось в сосуде диаметром 1,5 м, заполненном водой (температура воды 28-32°С) до уровня 60 см. Груз отягощения составлял 5% от массы тела животных. Показателем физического утомления животного являлось его нахождение под водой свыше 10 сек. Эффективность веществ оценивали по увеличению длительности плавания опытных групп животных по сравнению с контрольными группами.

Влияние веществ на скорость развития утомления изучали по методу Kiplinger (G.L. Kiplinger. The Effects of Drugs on the Rate of Development on Fatigue in mice. Texas Rep. Biol. Med., 1967, vol.25, p.531-540). Этот тест имеет определенные преимущества при исследовании влияния веществ на работоспособность перед другими плавательными методиками (Ю.Г.Бобков, В.М.Виноградов, В.Ф.Катков, С.С.Лосев, А.В.Смирнов. Фармакологическая коррекция утомления // М.: Медицина, 1984, 208 с.).

Опыты выполнялись на мышах в металлическом сосуде размером 180х60х30 см. Предварительно мышей тренировали: за 48 и 24 ч. до опыта мыши проплывали фиксированные расстояния в 150 см по 5 заплывов 3 раза с 30-минутными перерывами между группами заплывов. При этом у мышей выработался стойкий условный рефлекс плавания в нужном направлении, чтобы выбраться из воды по трапу. В день опыта мыши совершали 18 непрерывных заплывов, по времени которых и рассчитывали скорость развития утомления. В том случае, если мышь преодолевала это расстояние за 60 сек и более, ее исключали из дальнейших заплывов, а время ее дальнейших попыток принимали равным 60 сек. Результаты опыта обрабатывали с помощью линейного регрессионного анализа. Эффективность препарата характеризуется величиной tg α угла наклона линии регрессии, которая меньше у препаратов, эффективно предупреждающих развитие утомления.

Исследуемые вещества вводили в диапазоне доз 1-50 мг/кг двумя способами - внутрижелудочно и внутрибрюшинно. Вещества вводили, как правило, когда не ставилась задача выяснения динамики эффекта во времени, за 1 час до эксперимента. Для инъекций использовали водные растворы соединения I и бемитила.

Работоспособность в антиортостатическом положении исследовали по методике (О.М.Авакян., Э.А.Ширинян. Новая модель динамической работы мелких лабораторных животных. Бюл. эксп. биол. мед.. - 1977. - №9. - С.557-559) в модификации Г.В.Ковалева с сотр. (Г.В.Ковалев, А.А.Спасов, О.В.Островский, А.В.Цибанев. Влияние фармакологических веществ на работоспособность в условиях умеренной гипоксии. Итоги науки и техники, Сер.Фармакология, Химиотерапевтические средства, т.27, Антигипоксанты, М.: ВИНИТИ.. - 1991. - С.120-127). Крыс фиксировали за хвост к планке с помощью вакуумного шланга так, что голова и шея животных были погружены в воду. Это положение вынуждало животных удерживать голову над поверхностью воды с помощью динамической (гребковые движения передних лап) и статической (напряжение мышц туловища). Интенсивность и длительность работы крыс регулировали с помощью груза (8% от массы тела), фиксируемого на шее животных. Влияние веществ на работоспособность изучали как в нормоксических, так и в гипобарических гипоксических условиях [Ковалев и др., 1991], которые моделировали в проточной барокамере, атмосферное давление составляло 462 мм рт.ст., PО₂=97 мм рт.ст., что соответствовало высоте 4000 м над уровнем моря. Как следует из приведенных данных (Таблица 3), соединение I оказывало актопротекторное действие в плавательном тесте, повышая работоспособность животных. Для него было характерно появление эффекта в дозе 1 мг/кг, затем в дозе 5 мг/кг - максимальный эффект и в дальнейшем снижение эффекта с увеличением дозы. Препарат сравнения бемитил на этой модели оказался неэффективным.

При исследовании эффективности веществ в тесте на скорость развития утомления [Kiplinger, 1967] было установлено, что соединение I в дозах 10 и 25 мг/кг достоверно уменьшало признаки развития утомления у мышей (Таблица 4). Максимальный эффект вещество проявило в дозе 25 мг/кг. На этой модели весьма эффективным проявил себя препарат сравнения бемитил, что согласуется с литературными данными [Бобков и др., 1984]. Он уменьшал коэффициент при х (tgα) в 3 раза. При этом соединение I, уменьшая признаки утомления у мышей в большей степени, чем бемитил, оказывало еще более выраженное действие.

Сопоставляя данные о работоспособности в нормоксических и гипоксических условиях (Таблица 5), следует отметить, что эффект соединения I в обоих случаях был примерно одинаковым. В отличие от них эффективность препарата сравнения бемитила значительно снижалась при гипобарии. Так, бемитил совершенно не изменял время плавания крыс на “высоте” 4000 м.

Таблица 3 Влияние соединений I и бемитила при внутрижелудочном введении за 1 час до эксперимента на физическую работоспособность мышей (n=10) (плавание с грузом 5% от массы тела) Группа животных Доза, мг/кг Длительность плавания животных в минутах (M±m) Δ% к контролю Контроль - 23,5±1,1 - Соединение I 1 29,1±0,9 23,8   5 42,1±1,9^∗ 79,1   10 30,8±2,9^∗ 31,0   20 34,5±2,5^∗ 46,8   50 24,8±2,6 5,5 Контроль   25,1±1,0 - Бемитил 1 26,1±2,4 3,2   10 22,8±3,6 -10,2   20 24,5±3,4 -3,4   50 24,8±4,0 2,2 ^∗ - различия статистически значимы по отношению к контролю (Р≤0,05) n - количество животных

Таблица 4 Влияние соединения I и бемитила на скорость развития утомления мышей (n=10) в тесте скоростного плавания Группа животных Доза, мг/кг Уравнение линейной регрессии ^∗ контроль +вещество Соединение I 5 у=0,19х+14,6 у=0,14х+10,1^∗∗ 10 у=0,19х+14,6 у=0,12х+7,3^∗∗ 25 у=0,05х+10,9 у=0,02х+10,8^∗∗ Бемитил 5 у=0,19х+14,6 у=0,16х+13,9 10 у=0,19х+14,6 у=0,11х+9,0^∗∗ 25 у=0,19х+14,6 у=0,06х+9,9^{∗∗ ∗} - у - среднее время проплыва в мин х100 х - квадрат средней попытки ^∗∗ - различия достоверны (р<0,05) по данным двухфакторного дисперсионного анализа

Таблица 5 Влияние изучаемых веществ при внутрижелудочном введении на физическую работоспособность крыс (n=12) в условиях нормального и пониженного содержания кислорода (97 мм рт.ст.) при плавании в антиортостатическом положении с грузом 8% от массы тела   Доза, мг/кг Длительность плавания в нормоксических условиях (мин) Длительность плавания в гипоксических условиях (мин) Вещество   Контроль (М±m) Опыт (М±m) Контроль (М±m) Опыт (М±m) Соединение I 10 10,5±1,5 15,8±1,7^∗ 6,5±0,4 6,6±0,3 20 10,5±1,5 17,3±1,3^∗ 6,5±0,4 9,1±0,4^∗ 50 10,5±1,5 17,5±2,0^∗ 6,5±0,4 9,0±0,4^∗ Бемитил 50 10,5±0,2 14,5±0,4∗ 6,5±0,2 6,7±0,4 ^∗ - данные статистически значимы (р<0,05) по отношению к контролю n - количество животных

3. Ноотропные свойства

Ноотропную активность изучали по влиянию веществ на формирование и воспроизведение памятного следа с использованием методики условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [Я.Буреш, О.Бурешова, Д.П.Хьюстон. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. Пер. с англ. Е.Н.Живописцевой. М.: Высшая школа, 1991, 399 с.].

Методика условного рефлекса пассивного избегания основана на подавлении врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов. Экспериментальная установка представляет из себя камеру, состоящую из двух отсеков: большого - освещенного и малого - темного. Животное помещается в светлый отсек и вскоре (через 10-20 сек), в силу врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, переходит в малый отсек, после чего дверка, соединяющая оба отсека, перекрывается и на пол темного отсека, состоящего из параллельных чередующихся электродов, подается электрический ток импульсами продолжительностью 50 мс, частотой 5 Гц и амплитудой 50 мА. Через 10 сек дверку открывают и животное может выскочить в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у животных вырабатывается условный рефлекс избегания темного пространства. При проверке воспроизводимости рефлекса животных помещают в светлый отсек в угол противоположный от входа в темный отсек и наблюдают в течение 180 сек. Регистрируется во всех случаях при воспроизведении УРПИ латентное время первого захода в опасный, темный отсек и общее время нахождения в светлом и темном отсеках за определенный интервал времени. Выработанным рефлекс считался, если в течение всех 180 сек наблюдения животное ни разу не посетило темный отсек.

Для исследования влияния веществ на фазы памяти соединение вводили в различные стадии формирования памятного следа. С целью получения данных о влиянии вещества на процесс ввода и первоначальной обработки информации соединение назначали за 1 час до процедуры обучения [А.А.Спасов, Л.А.Смирнова, А.А.Озеров, С.А.Сергеева, И.Н.Иежица. Фармакокинетика некоторых производных бензимидазола. Вопросы мед. химии, 2002, №3, с.233-258]. Для изучения способности к консолидации информации, изучаемое вещество животные получали непосредственно после процедуры обучения. Для получения данных о влиянии вещества на процессы воспроизведения информации соединение вводили через 24 часа после обучения. С целью оценки влияния предполагаемого ноотропного препарата на процессы забывания тестирование осуществляли спустя 24 часа, 1, 2, 3 и 4 недели. Перед проведением эксперимента животные были разделены на 7 групп: 1 группа - интактные животные, которым назначали внутрижелудочно 0,9% физиологический раствор, 2-я группа - животные, которым вводили соль I за 1 час перед процедурой обучения, 3-я группа - животные, которые получали соединение I сразу после процедуры обучения, и 4-я группа - животные, которым назначался препарат I через 24 часа после обучения. Все животные получали это соединение в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно [А.А.Спасов, О.В.Островский, В.А.Анисимова, В.А.Косолапов, И.В.Ивахненко. Влияние соединений с антиоксидантными свойствами на функциональную активность тромбоцитов. Экспериментальная и клиническая фармакология, 1999, №1, с.38-40; В.А.Косолапов, И.В.Ивахненко, А.А.Спасов. Применение антиоксидантных средств для коррекции ДВС-синдрома. Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области, 2005, №2, с.24-27]. Аналогичные три (5, 6, 7) группы были сформированы и с препаратом сравнения мексидолом, который вводили в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно [К.М.Дюмаев, Т.А.Воронина, Л.Д.Смирнов. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.: Изд. Института биомедицинской химии РАМН, 1991, 272 с.]

Статистическую значимость полученных результатов оценивали с использованием Т-критерия Стьюдента, критерия Даннета (q') при сравнении нескольких групп с контрольной, выживаемость животных оценивали с применением непараметрического двухстороннего точного метода Фишера в программе Statistica 6.0 (StatSoft, США).

Было установлено, что латентное время в контрольной группе интактных животных через 24 часа после обучения увеличилось в 5,3 раза (Таблица 6), через 7 суток после обучения в 6,8 раз, на 14, 21 и 28 сутки в 9,4, 11,07 и 12,12 раза соответственно, по сравнению с исходными значениями (

Таблица 7, Таблица 8. В группах, где проводили изучение влияния веществ на оценку ввода и обработки первоначальной информации не наблюдали настолько значительного увеличения латентного времени. Так, в группе, где вводили вещество I латентное время увеличивалось в 4,1 раза через 24 часа после обучения, а на 7, 14, 21 и 28 сутки в 4,1; 3,76; 6,0; 5,05 и 5,16 раза соответственно, по сравнению с исходными значениями. У животных, которым вводили мексидол, наблюдали еще более низкое нарастание латентного времени, что составило 2,15 раза через сутки после обучения, 2,06 раза через 7 суток, в 2 раза на 14 сутки и в 2,08 и 2,1 раза на 21 и 28 сутки соответственно.

В группах, где проводили оценку влияния веществ на способность к консолидации информации, наиболее выраженный эффект наблюдали у препарата I. Так, латентное время увеличилось в 5,3 раза по сравнению с исходным показателем через 24 часа после обучения, что было статистически значимо. На 7 сутки воспроизведения памятного следа латентное время увеличилось в 7,06 раза, а со второй недели и до конца исследований 100% животных не заходили в темную камеру. В группе животных, которым вводили мексидол, не регистрировался столь значительный эффект. Так, через сутки после обучения латентное время увеличивалось в 3,78 раза, что было статистически значимо; через 1 и 2 недели в 3,53 раза и в 3,55 и 3,56 раза на 21 и 28 сутки, соответственно. В группах, где проводили оценку влияния веществ на воспроизведение информации максимальный эффект наблюдали у мексидола, причем как по сравнению с группой РУ-185а, так и по сравнению с контрольной группой.

Так, латентное время в группе, где вводили препарат I, через 24 часа увеличивалось в 8,85 раз, через неделю в 5,16 раз, через две недели в 7,13 раз, через 21 сутки в 7,33 раза и через 28 дней в 7,44 раза. В группе, где вводили мексидол, латентное время через 24 часа статистически значимо увеличивалось в 12,5 раз, после чего 100% животных на всем протяжении исследований не заходили в темный отсек.

Анализ такого показателя, как время нахождения в темной камере, свидетельствует о том, насколько быстро животное вспоминает, что нахождение в данном отсеке опасно. Так, в контрольной группе данный показатель через 24 часа снижался в 3,6 раза, на 7 сутки исследования в 1,4 раза, на 14 сутки в 1,91 раз и на 21 и 28 сутки в 2,02 и 13,23 раза соответственно. В группах, где изучаемые вещества вводили с целью оценки на ввод и обработку информации, наблюдали разнонаправленные эффекты. Так, в группе, где вводили соединение I, время нахождения в темной камере постоянно снижалось. Максимальное снижение наблюдалось через 24 часа в 5,17 раза, через неделю показатель снизился в 2,79 раз, а на 14 сутки крысы не заходили в темный отсек. На 21 сутки время нахождения в темном отсеке снизилось в 2,43 раза, а на 28 сутки только в 1,39 раз по сравнению с исходными значениями. В группе, где вводили мексидол, снижение этого показателя наблюдали только при воспроизведении рефлекса через 24 часа в 8,34 раза. В остальных случаях данный показатель возрастал в 8,54; 8,49; 8,15 и 7,34 раза на 7, 14, 21 и 28 сутки соответственно, что свидетельствует о дефиците восстановления памятного следа, причем данная тенденция прослеживается и в группе, где оценивалась способность к консолидации информации. Так, время нахождения в темном отсеке снижалось только при воспроизведении рефлекса через 24 часа в 18,34 раза. При исследовании на 7, 14, 21 и 28 сутки показатель повышался в 3,18; 2,27; 3,09 и 3,05 раза соответственно. В аналогичной группе, где вводили соль I, время нахождения в темном отсеке снижалось через 24 часа в 4,4 раза и на 7 сутки в 1,72 раза. На 14, 21 и 28 сутки животные не заходили в темный отсек. В группах, где производили оценку способности веществ влиять на воспроизведение информации наблюдали противоположный эффект. У животных, которым вводили соединение I снижалось время нахождения в темном отсеке только через 24 часа при воспроизведении УРПИ. В остальных случаях этот показатель повышался в 4, 15; 2,9; 1,35; и 2,8 раза на 7, 14, 21, и 28 сутки соответственно, по сравнению с исходными значениями. В группе, где вводили мексидол, время нахождения в темном отсеке снижалось в 14,34 раза через 24 часа после обучения. На 7, 14, 21 и 28 сутки 100% животных не заходили темный отсек. При оценке времени нахождения в светлой камере установлено, что данный показатель снижался во всех исследуемых группах, что свидетельствует о сохранении воспоминания нанесения аверсивного раздражителя в темной камере. Так, в группе интактных животных к концу проведения эксперимента (28 день) данный показатель снизился в 12,63 раза, тогда как во всех группах, где вводили вещества, к 28 дню этот показатель был равен нулю.

Таблица 6 Влияние соединения I и мексидола на формирование памятного следа у крыс через 24 ч после обучения Группы УРПИ, обучение УРПИ, проверка через 24 ч Латентное время, с Темная камера, с Светлая. камера, с Латентное время, с Темная камера, с Светлая камера, с К1 13,7±3,50 57,3±30/78 109,5±32,30 72,70±37,70 16,00±10,20 92,30±33,80 Э1 30,0±11,13 35,0±16,73 115,0±24,50 123.17±39,40 6,83±4,74 50,00±34,67 Э2 21,83±9,40 44,33±29,70 113,83±26,0 115.5±33,98^∗ 10,33±6,49 54,17±28,09 Э3 17,17±9,78 19,83±9,12 143,0±18,40 97,17±40,8 8.67±4,20 77,5±36,52 М1 70,83±38,09 4,17±1,68 98,33±34,54 152,0±30.67 0,5±0,55 27,5±30,12 М2 42,67±30,5 9,17±2,20 128,17±28,67 161,17±20,63^∗ 0,5±0,55 18,33±20,08^∗ М3 12,0±5,44 7,17±1,56 160,83±5,70 150,17±32,7^∗ 0,5±0,55 29,33±32,13

К1 - контрольная группа интактных животных;

Э1 - группа животных, получавших соединение I за 1 час до обучения УРПИ;

Э2 - группа животных, которым вводили соединение I непосредственно после обучения УРПИ;

Э3 - группа животных, которым назначали соединение I через 24 часа после обучения УРПИ;

M1 - группа животных, получавших мексидол за 1 час до обучения УРПИ;

М2 - группа животных, которым вводилси мексидол непосредственно после обучения УРПИ;

М3 - группа животных, которым назначали мексидол через 24 часа после обучения УРПИ;

^∗ - данные статистически значимы по сравнению с контролем К1 (р<0,05).

Таблица 7 Влияние соединения I и мексидола на формирование памятного следа у крыс через 7 и 14 суток после обучения Группы УРПИ, 7 сутки УРПИ, проверка через 14 сутки Латентное время, с Темная камера, с Светлая. камера, с Латентное время, с Темная камера, с Светлая камера, с К1 93,67±42,3 39,17±30,98 47,17±33,53 129,0±35,42 30,0±27,19 17,67±17,25 Э1 112,83±38,86 12,67±11,36 54,5±31,52 180,0±0,00 - - Э2 154,17±28,3 25,83±28,3 - 180,0±0,00 - - Э3 88,67±40,18 82,33±35,96 9,0±6,43 122,5±39,84 57,5±39,84 - М1 144,4±39,80 35,6±39,80 - 144,6±39,58 35,4±39,58 - М2 150,83±31,95 29,17±31,95 - 159,17±22,8 20,83±22,82 - М3 180,0±0,0 - - 180,0±0,00 - -

К1 - контрольная группа интактных животных;

Э1 - группа животных, получавших соединение I за 1 час до обучения УРПИ;

Э2 - группа животных, которым вводили соединение I непосредственно после обучения УРПИ;

Э3 - группа животных, которым назначали соединение I через 24 часа после обучения УРПИ;

M1 - группа животных, получавших мексидол за 1 час до обучения УРПИ;

М2 - группа животных, которым вводили мексидол непосредственно после обучения УРПИ;

М3 - группа животных, которым назначали мексидол через 24 часа после обучения УРПИ.

Таблица 8 Влияние соединения I и мексидола на формирование памятного следа у крыс через 21 и 28 суток после обучения Группы УРПИ, через 21 сутки УРПИ, проверка через 28 суток Латентное время, с Темная камера, с Светлая. камера, с Латентное время, с Темная камера, с Светлая камера, с К1 151,67±31,04 28,33±31,04 - 167,0±10,89 4,33±3,30 8,67±9,49 Э1 151.67±37,04 14,50±15,89 13,83±15,15 154,67±27,75 25,33±27,75 - Э2 180.0±0,00 - - 180,0±0,00 - - Э3 125,83±37,69 26.67±27,08 27,5±25,05 127,83±36,14 55,5±38,45 - М1 146,00±38.01 34,00±38,01 - 149,4±34,21 30,6±34,21 - М2 151,67±31,04 28,33±31,04 - 152,0±30,67 28,0±30,67 - М3 180,0±0,00 - - 180,0±0,00 - -

К1 - контрольная группа интактных животных;

Э1 - группа животных, получавших соединение I за 1 час до обучения УРПИ;

Э2 - группа животных, которым вводили соединение I непосредственно после обучения УРПИ;

Э3 - группа животных, которым назначали соединение I через 24 часа после обучения УРПИ;

M1 - группа животных, получавших мексидол за 1 час до обучения УРПИ;

М2 - группа животных, которым вводили мексидол непосредственно после обучения УРПИ;

М3 - группа животных, которым назначали мексидол через 24 часа после обучения УРПИ.

Заключение

1. Антиоксидантное соединение I проявило высокую противогипоксическую активность на моделях острой гипоксии, сравнимую с активностью эталонного препарата гутимин, действуя при этом в значительно меньших дозах. Следует отметить широкий спектр противогипоксической активности нового соединения на моделях гипоксии различного генеза, что позволяет говорить об универсальности их противогипоксического действия.

2. Соединение I достаточно выраженно повышают работоспособность у животных на моделях, связанных как с предельными нагрузками (плавание до отказа), так и со скоростью развития утомления. По сравнению с эталонным актопротекторным средством бемитил соединение I проявило большую выраженность эффекта, который реализовался в меньших, чем у бемитила, дозах. При плавании животных в осложненных антиортостатических условиях соединение I отчетливо превосходило препарат сравнения бемитил по актопротекторным свойствам.

3. Была показана способность антиоксидантного соединения I влиять на когнитивные и высшие интегративные показатели животных. Было установлено, что оно преимущественно улучшало способность к консолидации информации, а препарат сравнения мексидол в основном влиял на способность животных к воспроизведению информации. Полученные данные свидетельствуют о наличии у соединения I ноотропной активности.

Изобретение относится к фармакологии и медицине и касается применения дигидробромида 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диоксифенил)имидазо[1,2-а)бензимидазола формулы I в качестве биологически активного соединения, обладающего повышенной противогипоксической, актопротекторной, ноотропной активностью и оказывающего положительное влияние на физическую работоспособность, и фармацевтической композиции на его основе. 2 н.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.

1. Применение дигидробромида 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диокси-фенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I

в качестве биологически активного соединения, обладающего противогипоксической, актопротекторной, ноотропной активностями и положительным влиянием на физическую работоспособность.

2. Фармацевтическая композиция противогипоксического, актопротекторного, ноотропного действия и положительного влияния на физическую работоспособность, содержащая в качестве действующего начала дигидробромид 9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диоксифенил)-имидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I

взятый в эффективном количестве.