CПОСОБ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В ИНДИВИДУАЛЬНЫХ НЕДЕЛИМЫХ ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТКАХ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к молекулярной биологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для диагностики злокачественных новообразований, индивидуального подбора лекарственных препаратов и геронтопротекторов, при тактике радио-, химио- и озонотерапии, также для выявления групп риска различных заболеваний у населения (скрининг).

Преамбула: повреждение ДНК необходимо для индивидуальной оценки репарационной системы клетки.

В настоящее время известен способ для создания индуцированных повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.

Данный способ является наиболее близким по совокупности существенных признаков и достигаемому техническому результату к предлагаемому способу и выбран авторами в качестве прототипа (1).

Данный способ включает: приготовление слайдов, состоящих из 3-х слоев агарозы, средний из которых содержит индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки, повреждение ДНК иммобилизованных в агарозу клеток рентгеновским излучением в дозе 3 Гр со средней мощностью 1 Гр/мин, разрушение (лизис) клеток при pH=10 с целью удаления мембран клеток и большинства белков, денатурацию (расплетение=раскручивание=выпрямление) ДНК путем помещения слайдов в щелочной раствор (pH>13) для формирования однонитевых участков в молекулах ДНК, соединенных с ядерным матриксом, которые участвуют в образовании хвоста «кометы», проведение электрофореза поврежденных ДНК в щелочном растворе (pH>13) при напряжении 27 В, силе тока 260-270 мА, напряженности поля 2,0 В/см, за счет подвижности в постоянном электрическом поле поврежденных ДНК разрушенных (лизированных) клеток, заключенных в агарозу, при этом поврежденные ДНК мигрируют к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК, затем осуществляют окрашивание ДНК флуоресцентным красителем для их визуализации, далее изображения ДНК («комет») фотографируют с помощью фотоаппарата, соединенного с флуоресцентным микроскопом, главным образом, в центральной части слайдов, где «кометы» располагаются примерно в одной плоскости, после чего полученные изображения обрабатывают с помощью специализированного программного обеспечения, разработанного для регистрации и специализированного программного обеспечения, разработанного для регистрации и анализа отображений, реализующего алгоритмы расчета 13-ти стандартных параметров «комет» (2), при этом программное обеспечение позволяет определить общее количество ДНК и количество поврежденных ДНК и вычислить отношение количества поврежденных ДНК к общему количеству ДНК в процентах и на основании полученных данных делают заключение об индуцированных повреждениях ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.

Данный способ эффективен и информативен при малом количестве требуемого экспериментального материала.

Однако данный способ является затратным за счет использования дорогостоящей рентгеновской установки для создания индуцированных повреждений ДНК в клетке и работы на ней специально обученного персонала, а также специальной защиты для обслуживающего персонала и требования к помещению из-за рентгеновского излучения. Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа создания индуцированных повреждений ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках, безопасного при реализации и не требующего дорогостоящего стационарного оборудования, специально обученного персонала и специально оборудованного помещения.

Поставленная задача решается предлагаемым способом создания индуцированных повреждений ДНК индивидуальных неделимых ядросодержащих клеток, включающий подготовку слайдов, состоящих из нескольких слоев агарозы, один из которых содержит индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки, повреждение ДНК клеток, разрушение (лизис) клеток при pH=10, денатурацию поврежденных ДНК в разрушенных клетках щелочным раствором при pH>13, проведение электрофореза ДНК клеток в щелочных растворах при pH>13, последующее окрашивание флуоресцентным красителем поврежденных ДНК, регистрацию интенсивности флуоресценции изображения ДНК «комет» и обработку полученного изображения ДНК с помощью программного обеспечения, позволяющую определить величину отношения интенсивности флуоресценции поврежденных ДНК к интенсивности флуоресценции общего количества ДНК в клетке в процентах, и по полученной величине отношения делают заключение, согласно изобретения, повреждение ДНК клеток осуществляют обработкой слайда фосфатно-солевым буфером с pH 7,4-7,5, через который предварительно пропускают озон - кислородную смесь при концентрации озона в смеси 500-1000 мкг/л в течение 5 мин, и при величине отношения более 10% делают заключение о создании индуцированных повреждений ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.

Техническим результатом предлагаемого способа является безопасность и снижение материальных затрат на его реализацию, так как осуществление предлагаемого способа не требует стационарного дорогостоящего оборудования, специально обученного персонала и специально оборудованного помещения.

Данный технический результат обусловлен тем, что для создания индуцированных повреждений ДНК индивидуальных неделимых ядросодержащих клеток в качестве предлагаемого средства берут озон - кислородную смесь, для этого обрабатывают слайд, один из слоев которого содержит индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки, фосфатно-солевым буфером с pH 7,4-7,5, через который предварительно пропускают озон - кислородную смесь при концентрации озона в смеси 500-1000 мкг/л в течение 5 мин, и при величине отношения более 10% делают заключение о создании индуцированных повреждений ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом

Предварительно готовят слайды, состоящие из нескольких слоев агарозы, в частности из 2-х слоев, один из которых содержит индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки, затем создают повреждения ДНК клеток, находящихся в одном из слоев слайда, фосфатно-солевым буфером с pH 7,4-7,5, через который предварительно пропускают озон - кислородную смесь при концентрации озона в смеси 500-1000 мкг/л в течение 5 мин, в качестве образца индивидуальных неделимых ядросодержащих клеток может быть взят образец крови, после чего проводят разрушение (лизис) клеток при pH=10 с целью удаления мембран клеток и большинства белков, денатурацию (расплетение=раскручивание=выпрямление) ДНК, помещая слайды в щелочной раствор при pH>13, для формирования однонитевых участков в молекулах ДНК, соединенных с ядерным матриксом, которые участвуют в образовании хвоста «кометы», и проведение электрофореза поврежденных ДНК разрушенных (лизированных) клеток в щелочном растворе pH>13 при напряжении 27 В, силе тока 260-270 мА, напряженности поля 2,0 В/см, за счет подвижности в постоянном электрическом поле поврежденных ДНК разрушенных (лизированных) клеток, заключенных в агарозу, при этом поврежденные ДНК мигрируют к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост «кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК, для визуализации поврежденных ДНК осуществляют их окрашивание флуоресцентным красителем, изображения окрашенных флуоресцентным красителем поврежденных ДНК («комет») регистрируют путем фотографирования с помощью фотоаппарата, соединенного с флуоресцентным микроскопом, главным образом, в центральной части слайдов, где «кометы» располагаются примерно в одной плоскости, и полученные изображения обрабатывают с помощью специализированного программного обеспечения, разработанного для регистрации и анализа отображений, реализующего алгоритмы расчета 4-х стандартных параметра «комет», при этом программное обеспечение позволяет определить как общее количество ДНК, так и количество поврежденных ДНК, и вычисляют величину отношения количества поврежденных ДНК и общему количеству ДНК в процентах и на основании полученной величины отношения более 10% делают заключение об индуцированных повреждениях ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример 1.

Предварительно подготовили 2-слойный слайд путем нанесения на стекло первого слоя из раствора агарозы, после высушивания первого слоя на него нанесли из раствора агарозы второй слой, который содержал индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки, для этого в 1% раствор легкоплавкой агарозы ввели кровь самца белых беспородных интактных крыс весом 180 г, возрастом 5-ти месяцев, разведенную в фосфатном буфере, далее осуществили создание повреждений ДНК клеток, находящихся во втором слое слайда, фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, через который предварительно пропустили озон - кислородную смесь при концентрации озона в смеси 500 мкг/л в течение 5 мин, затем провели разрушение (лизис) клеток при pH=10 с целью удаления мембран клеток и большинства белков и денатурацию (расплетение=раскручивание=выпрямление) ДНК, помещая слайды в щелочной раствор при pH=13,2 для формирования однонитевых участков в молекулах ДНК, соединенных с ядерным матриксом, которые участвуют в образовании хвоста «кометы», после чего провели электрофорез поврежденных ДНК разрушенных (лизированных) клеток в щелочном растворе pH=13,2 при напряжении 27 В, силе тока 260 мА, напряженности поля 2,0 В/см, за счет подвижности в постоянном электрическом поле поврежденных ДНК разрушенных (лизированных) клеток, заключенных в агарозу, при этом поврежденные ДНК мигрируют к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост «кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК, для визуализации поврежденных ДНК осуществили их окрашивание флуоресцентным красителем, полученные изображения окрашенных флуоресцентным красителем поврежденных ДНК («комет») зарегистрировали путем фотографирования с помощью фотоаппарата, соединенного с флуоресцентным микроскопом, главным образом, в центральной части слайдов, где «кометы» располагаются примерно в одной плоскости, и зарегистрированные изображения обработали с помощью специализированного программного обеспечения, разработанного для регистрации и анализа отображений (4), реализующего алгоритмы расчета 4-х стандартных параметров «комет», при этом программное обеспечение позволило определить как общее количество ДНК, так и количество поврежденных ДНК, и вычислить величину отношения количества поврежденных ДНК и общему количеству ДНК в процентах, которая составила 10,87%, и на основании полученной величины отношения сделали заключение о создании индуцированных повреждениях ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.

Пример 2.

Предварительно подготовили 2-слойный слайд путем нанесения на стекло первого слоя из раствора агарозы, после высушивания первого слоя на него наносили из раствора агарозы второй слой, который содержал индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки, для этого в 1% раствор легкоплавкой агарозы ввели кровь самца белых беспородных интактных крыс весом 198 г, возрастом 5-ти месяцев, разведенную в фосфатном буфере, осуществили повреждение ДНК клеток, находящихся во втором слое слайда, фосфатно-солевым буфером с pH 7,5, через который предварительно пропустили озон - кислородную смесь при концентрации озона в смеси 1000 мкг/л в течение 5 мин, затем провели разрушение (лизис) клеток при pH=10 с целью удаления мембран клеток и большинства белков и денатурацию (расплетение=раскручивание=выпрямление) ДНК, помещая слайды в щелочной раствор при pH=13,5 для формирования однонитевых участков в молекулах ДНК, соединенных с ядерным матриксом, которые участвуют в образовании хвоста «кометы», после чего провели электрофорез поврежденных ДНК разрушенных (лизированных) клеток в щелочном растворе pH=13,5 при напряжении 27 В, силе тока 270 мА, напряженности поля 2,0 В/см, за счет подвижности в постоянном электрическом поле поврежденных ДНК разрушенных (лизированных) клеток, заключенных в агарозу, при этом поврежденные ДНК мигрируют к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост «кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК, для визуализации поврежденных ДНК осуществили их окрашивание флуоресцентным красителем, полученные изображения окрашенных флуоресцентным красителем поврежденных ДНК («комет») зарегистрировали путем фотографирования с помощью фотоаппарата, соединенного с флуоресцентным микроскопом, главным образом, в центральной части слайдов, где «кометы» располагаются примерно в одной плоскости, и зарегистрированные изображения обработали с помощью специализированного программного обеспечения, разработанного для регистрации и анализа отображений (3), реализующего алгоритмы расчета 4-х стандартных параметров «комет», при этом программное обеспечение позволило определить как общее количество ДНК, так и количество поврежденных ДНК, и вычислить величину отношения количества поврежденных ДНК и общему количеству ДНК в процентах, которая составила 11,00%, и на основании полученной величины отношения сделали заключение об индуцированных повреждениях ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.

Как видно из полученных результатов, предлагаемый способ является эффективным и безопасным, не требующим значительных материальных затрат на оборудование, подготовку специалистов для работы на нем и подготовку специально оборудованного помещения.

Источники информации

1. Прототип. Сирота Н.П., Кузнецова Е.А. Применение метода «комета-тест» в радиобиологических исследованиях. Радиационная биология. Радиоэкология, 2010, т.50, №3, с.329.

2. Chemeris N.К., Gapeyev А.В., Sirota N.P. et al. DNA damage in frog erythrocytes after in vitro exposure to a high peak-power pulsed electromagnetic field. Mutat Res. 2004, V.558, №1, 2, p.27.

3. Степанов B.H. Методы и программные средства автоматизации анализа изображений медико-биологических микрообъектов. Автореферат диссертации кандидата технических наук. М., 2005, с.23.

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики злокачественных новообразований. Из образца клеток крови готовят слайды из нескольких слоев агарозы, один из которых содержит индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки. Осуществляют повреждения ДНК клеток фосфатно-солевым буфером с pH 7,4-7,5, через который предварительно пропускают озон -кислородную смесь при концентрации озона в смеси 500-1000 мкг/л в течение 5 мин. Проводят разрушение клеток при pH=10, денатурацию ДНК, помещая слайды в щелочной раствор при pH>13, электрофорез поврежденных ДНК разрушенных клеток в растворе pH>13 при напряжении 27 В, силе тока 260-270 мА, напряженности поля 2,0 В/см. Окрашенные флуоресцентным красителем поврежденные ДНК регистрируют путем фотографирования, обрабатывают с помощью программного обеспечения, вычисляют величину отношения количества поврежденных ДНК к их общему количеству в процентах и при величине отношения более 10% делают заключение об индуцированных повреждениях ДНК. Способ позволяет диагностировать злокачественные новообразования, в т.ч. скрининг, осуществлять подбор лекарственных препаратов и геронтопротекторов при радио-, химио- и озонотерапии. 2 пр.

Способ создания индуцированных повреждений ДНК индивидуальных неделимых ядросодержащих клеток, включающий подготовку слайдов, состоящих из нескольких слоев агарозы, один из которых содержит индивидуальные неделимые ядросодержащие клетки, повреждение ДНК клеток, разрушение (лизис) клеток при pH=10, денатурацию поврежденных ДНК в разрушенных клетках щелочным раствором при pH>13, проведение электрофореза ДНК клеток в щелочных растворах при pH>13, последующее окрашивание флуоресцентным красителем поврежденных ДНК, регистрацию интенсивности флуоресценции изображения ДНК «комет» и обработку полученного изображения ДНК с помощью программного обеспечения, позволяющую определить величину отношения интенсивности флуоресценции поврежденных ДНК к интенсивности флуоресценции общего количества ДНК в клетке в процентах, и по полученной величине отношения делают заключение, характеризующийся тем, что повреждение ДНК клеток осуществляют обработкой слайда фосфатно-солевым буфером с pH 7,4-7,5, через который предварительно пропускают озон - кислородную смесь при концентрации озона в смеси 500-1000 мкг/л в течение 5 мин, и при величине отношения более 10% делают заключение об индуцированных повреждениях ДНК в индивидуальных неделимых ядросодержащих клетках.