НАБОР И СПОСОБ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МНОГОСЛОЙНЫХ АГАРОЗНЫХ БЛОКОВ НА ПОВЕРХНОСТИ МИНИ-СТЕКОЛ ДЛЯ МИКРОСКОПИИ Российский патент 2015 года по МПК C12M3/04 C12Q1/24 C12N11/04 

Изобретение относится к области медико-биологических и экологических исследований и касается метода измерения в индивидуальных непролиферирующих клетках повреждений ДНК, индуцированных действием техногенных физических, химических и биологических факторов окружающей среды, - метода "комета-тест" (электрофорез нуклеоидов индивидуальных клеток в геле агарозы, метод ДНК-комет, Comet assay).

Предупреждение контакта живых организмов с потенциальными факторами, способными оказывать генотоксическое действие, представляется наиболее конструктивным способом защиты от последствий индуцированного мутагенеза. Однако тотальная проверка потенциальных агентов на генотоксичность невозможна вследствие огромного объема исследований. Для удешевления и ускорения работ по генотоксическому скринингу проводятся исследования с помощью простых и быстровыполнимых методов с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов или культур клеток млекопитающих. Для оценки мутагенных свойств химических соединений к настоящему времени предложено множество различных тест-систем, многие из которых хорошо разработаны и нашли широкое применение. Однако до настоящего времени нет универсальной тест-системы, которая могла бы выявить все основные типы генетических повреждений и была бы свободна от ряда принципиальных недостатков.

Некоторые исследования требуют предварительного выделения ДНК из гомогената клеток, что лишает возможности индивидуального анализа клеточной суспензии. В неоднородной клеточной суспензии уровень повреждений может сильно отличаться, и возникает вероятность экранирования малой популяции сильно поврежденных клеток (способных инициировать канцерогенез и другие болезни) на фоне остальных слабо поврежденных. Ряд методов включает этапы интенсивных манипуляций с клетками, что зачастую приводит к значительному росту уровня дополнительных повреждений ДНК. Некоторые высокочувствительные методы для оценки степени репарации ДНК, например незапланированный синтез ДНК, не способны оценивать уровень прямых повреждений ДНК, какими являются однонитевые и двунитевые разрывы цепи ДНК. Методы определения хромосомных аберраций и сестринского хроматидного обмена являются альтернативными способами обнаружения повреждений ДНК, однако способны анализировать только клетки, находящиеся в метафазе, отличаются длительным временем анализа и трудоемкостью. Микроядерный тест широко применяется для анализа фрагментации ДНК в клетках костного мозга и имеет сильно ограниченное применение для многих других типов клеток. Методы масс-спектрометрии требует длительного времени для анализа и дорогостоящего оборудования, а иммуногистохимические исследования способны определить лишь двунитевые разрывы цепи ДНК.

Из имеющихся на сегодняшний день в арсенале генотоксикологии методов для решения указанных задач наиболее перспективным представляется метод "комета-тест" (электрофорез нуклеоидов индивидуальных клеток в геле агарозы или метод ДНК-комет). Метод предназначен для обнаружения прямых повреждений ДНК и оценки эффективности функционирования систем репарации в клетках тканей живых организмов и растений при действии широкого спектра повреждающих агентов химической, физической и биологической природы. Метод позволяет выявлять однонитевые и двунитевые разрывы цепи ДНК, щелочелабильные сайты, сшивки между ДНК и белками, а в сочетании с ферментативной обработкой препаратов окисленные пуриновые и пиримидиновые основания. Преимуществом метода являются простота, небольшое количество требуемого экспериментального материала, экономичность, быстрота получения результатов, высокая чувствительность и производительность.

Метод "комета-тест" впервые был предложен в 1984 г. Остлингом и Йохансоном для оценки индуцированных радиацией повреждений ДНК в клетках млекопитающих. Позднее Сингх с соавторами была предложена модификация метода с электрофорезом в щелочных условиях, которая вследствие высокой чувствительности получила наибольшее признание у исследователей. Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности ДНК исследуемых клеток.

Протокол выполнения исследований с помощью щелочного варианта "комета-теста" включает в себя следующие этапы: получение клеточной суспензии, приготовление препаратов (слайдов) с иммобилизованными в агарозу клетками, лизис клеток, щелочная денатурация ДНК, электрофорез нуклеоидов в щелочных условиях, нейтрализация щелочи, окрашивание ДНК флуоресцентным красителем, микроскопия препаратов с захватом изображений и цифровым анализом распределения ДНК, статистическая обработка и оценка степени повреждения ДНК исследуемого объекта. Одним из важнейших этапов является этап приготовления препаратов с иммобилизованными в агарозу клетками для проведения последующих процедур с этими клетками, от которого зависит продолжительность всего исследования и его качество.

Традиционно такие препараты с одним или двумя агарозными блоками готовят на обычных предметных стеклах для микроскопии (76×26 мм) или используют специально подготовленные предметные стекла. Приготовление агарозных блоков на стандартных стеклах для микроскопии производится путем нанесения капли расплавленной агарозы на поверхность стекла и наложения на нее покровного стекла стандартного размера (24×24 мм). Предметное стекло охлаждают до застывания агарозы и аккуратно удаляют покровное стекло. На образовавшийся гель наносят каплю смеси легкоплавкой агарозы с клетками. Снова накрывают покровным стеклом и помещают в холодильник до застывания агарозы. После формирования геля покровное стекло удаляется и на поверхности геля формируется следующий слой легкоплавкой агарозы аналогичным образом. Однако такой способ формирования агарозного блока имеет ряд недостатков.

Во-первых, на поверхности стандартного микроскопного стекла можно сформировать только два блока. Во-вторых, в результате действия сил поверхностного натяжения происходит прогиб покровного стекла, и агарозный слой с клетками имеет неидентичную толщину и неравномерное распределение клеток внутри геля.

Известны специализированные стекла фирмы Trivigen (США). Эти стекла представляют собой стандартные предметные стекла для микроскопии, покрытые специальным гидрофобным составом определенной толщины. На поверхности этих стекол имеются круговые области (окна), не покрытые таким составом (максимально три окна). Суспензия клеток в легкоплавкой агарозе раскапывается в такие окна и помещается в холодильник для застывания агарозы. Однако эти стекла можно использовать только однократно, что приводит к существенному удорожанию исследования.

Известно устройство, описанное в заявке на изобретение US 2012277118 A1, позволяющее готовить агарозный матрикс с клетками для последующих процедур с ними с целью анализа повреждений и репарации ДНК. Преимуществом изобретения является возможность иммобилизации в агарозу большого числа клеток в строгом заранее определенном порядке их размещения в матриксе и проведения последующих манипуляций со всем матриксом или с его частью, что ведет к увеличению производительности анализа. Однако трудоемкие и длительные процедуры при подготовке кассеты с клетками, включающие в себя подготовку агарозного матриксного материала с микроуглублениями для клеток, помещение клеток в углубления, покрытие клеток верхним слоем агарозы, не гарантируют сохранности клеток, их равномерного распределения внутри матрикса и могут привести к потере большой части биологического материала. Накладываются очень жесткие требования к геометрическим размерам углублений в матриксе, поскольку при их малой величине создаются трудности при помещении в них клеток, при их большой величине возникает большая вероятность попадания в углубление нескольких клеток, что неприемлемо для анализа. Учитывая различные размеры клеток даже в одной популяции (например, размеры клеток в общей фракции лейкоцитов цельной крови могут отличаться более чем в 5 раз), приготовление матрикса с клетками представляется достаточно сложной задачей, решение которой требует дополнительного времени (нескольких часов) и процедур. Все это приводит к существенному удорожанию анализа. В патенте не описаны специальные процедуры приготовления матрикса с клетками для обеспечения его плоскопараллельности и определенного фиксированного объема, также как и покрытия этого матрикса дополнительным слоем агарозы с теми же требуемыми свойствами. Процедуры обработки кассеты с клетками различными растворами не гарантируют максимально полного удаления предыдущего раствора и содержащихся в нем реагентов. В результате диффузии, которую авторы не принимают во внимание, может происходить контаминация реагентов в неизвестных концентрациях, что будет причиной возможных артефактов и искажений результатов анализа.

Известно устройство, описанное в заявке на изобретение GB 2466816 A, позволяющее распределять агарозный гель с иммобилизованными в нем клетками по типу многолуночного планшета с целью анализа повреждений ДНК. Преимуществом изобретения является возможность автоматизации ряда процедур метода ДНК-комет, что ведет к увеличению производительности анализа. Однако при формировании ячеек матриксной подложкой и прокладкой с серией каналов возникают дополнительные трудности в создании водонепроницаемого контакта, нарушение которого в процессе проведения процедур метода может привести к неравномерному распределению растворов по ячейкам и, следовательно, к нестандартной обработке клеток реагентами и в итоге большой вариабельности результатов анализа. При распределении смеси агарозы с клетками по сформированным ячейкам очень сложно добиться равномерного распределения суспензии по дну ячейки из-за образования мениска (например, заявляемый авторами объем суспензии для одной ячейки 96-луночных кювет составляет 20 мкл, в то время как рекомендованный минимальный объем должен быть не меньше 25 мкл), также возможно неконтролируемое образование воздушных пузырей в геле. Учитывая, что в процессе застывания агарозы клетки всплывают в ней, формируя насыщенный верхний слой, в результате получается высокая неоднородность распределения клеток в застывшей агарозе с максимальной концентрацией на поверхности раздела агароза-воздух. Последующие процедуры метода (лизис, денатурация и электрофорез) приведут к искажению формы нуклеоидов таких клеток и, как следствие, к искажению результатов анализа.

Известно устройство, описанное в заявке на изобретение US 2012058467 A1, позволяющее распределять агарозный гель с иммобилизованными в нем клетками в многолуночный планшет с размещенными в лунках электродами для проведения электрофореза с целью анализа повреждений ДНК. Преимуществом изобретения является возможность автоматизации ряда процедур метода ДНК-комет, что ведет к увеличению производительности анализа. Однако формирование плоскопараллельного агарозного слоя с клетками затруднительно из-за образования мениска при помещении суспензии в ячейки и всплывания клеток в агарозе. В результате искажения формы нуклеоидов, расположенных на границе раздела агароза-воздух, в процессе последующих процедур метода возникает высокая вероятность получения большой вариабельности и некорректных результатов анализа. Проведение процедуры электрофореза с помощью электродов, помещенных непосредственно в агарозный гель с клетками может приводить к дополнительным неконтролируемым повреждениям ДНК под действием вторичных окислительно-восстановительных процессов вблизи электродов при электрофорезе (активных форм кислорода и азота, гипохлоритов и др.), особенно в щелочных условиях.

Высокопроизводительные методики, предлагаемые авторами вышеупомянутых заявок, необходимы лишь для скрининговых исследований и являются избыточными и крайне дорогостоящими в большинстве случаев применения метода "комета-тест" в биомедицине.

Задачей предложенного изобретения является создание такого устройства, которое позволяет обеспечить формирование трехслойного агарозного блока площадью 10 × 10 мм и агарозными слоями калиброванной толщины на поверхности предметного стекла размером 25 × 10 мм.

Методика приготовления агарозных блоков (слайдов) с помощью предлагаемого устройства позволяет готовить калиброванные многослойные агарозные блоки, в которых агарозный слой клеток закрыт сверху дополнительным слоем агарозы, что препятствует выходу петель молекулы ДНК из геля, т.к. все они находятся в толще агарозы. Покрытие агарозного слоя с клетками верхним (третьим) слоем агарозы позволяет проводить анализ всех клеток, содержащихся на слайде, что снимает проблему "краевых эффектов". Методика позволяет готовить индивидуальные мини-препараты, дальнейшая работа с которыми может происходить как индивидуально, так и в большом количестве с применением специальных подложек, фиксирующих мини-стекла. Это позволяет производить необходимую обработку клеток реагентами на любом количестве мини-стекол одновременно и контролируемую смену растворов с реагентами. Калиброванная толщина слоев агарозы и, соответственно, калиброванный общий объем агарозных блоков позволяет точно рассчитать требуемую концентрацию реагента или дозу воздействия.

Технический результат, который может быть получен при реализации изобретения, заключается в создании трехслойных агарозных блоков с калиброванной толщиной слоев на поверхности мини-стекол, сокращении времени, требуемого для приготовления препаратов, существенном уменьшении расхода химических реактивов, использовании стандартного оборудования, снижении загрязнения окружающей среды химическими реагентами и увеличении производительности труда исследователя.

Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемое устройство обеспечивает приготовление серии слайдов с агарозными блоками фиксированного объема со стандартизованной толщиной слоев агарозы.

Устройство иллюстрируется рисунком, на котором показан общий вид устройства в сборе с двумя мини-стеклами (Рисунок 1). Устройство состоит из трех деталей, различающихся по конструкции, и мини-стекол, на поверхности которых и формируются трехслойные агарозные блоки.

Деталь 1 (Рисунок 2) представляет собой плоскопараллельную стеклянную пластину (1), на которой через равные промежутки закреплены разделительные блоки (2) заданной толщины. Высота блоков превышает толщину мини-стекол (3) на 50-100 мкм.

Деталь 2 (Рисунок 3) представляет собой плоскопараллельную стеклянную пластину (4), одна сторона которой представляет собой полированную поверхность, по краям которой приварены две боковые ножки в виде стеклянных блоков (5) толщиной 50±5 мкм.

Деталь 3 (Рисунок 4) аналогична детали 2, представляет собой плоскопараллельную стеклянную пластину (6), но толщина блоков (7) составляет 100±5 мкм.

Детали 1, 2 и 3 могут быть изготовлены как из стекла, так и из тефлона, металла или других материалов, обладающих устойчивостью к воздействию концентрированных растворов органических кислот и щелочей.

Устройство используется следующим образом.

Мини-стекла (3) закрепляются в деталь 1 между блоками (2) путем приклеивания их на каплю 1% нормальной агарозы. Затем поверх детали 1 помещается деталь 2 стороной, не содержащей блоков (5). В просвет, образовавшийся между мини-стеклами и деталью 2, вносится раствор агарозы (концентрацией от 0.5 до 1%) с помощью полуавтоматической пипетки. Заполнение просвета производится за счет сил поверхностного натяжения. После застывания агарозы деталь 2 снимается с детали 1 путем плоскопараллельного смещения детали 2 относительно детали 1. На сформированные таким способом гели наносится по 10 мкл суспензии исследуемых клеток в легкоплавкой агарозе на каждый гель. На деталь 1 помещается деталь 2 полированной стороной на раствор агарозы, содержащей клетки. Затем сборка помещается в холодильник (4-8°С) на 5-7 минут, для застывания агарозного геля. По истечении указанного времени сборка извлекается из холодильника и деталь 2 снимается с детали 1 путем плоскопараллельного смещения. На следующем этапе по 10 мкл раствора легкоплавкой агарозы наносится на поверхность сформированных гелей, и деталь 1 накрывается деталью 3, помещаемой на ножки (7). Сборка вновь помещается в холодильник на 5-7 мин. По истечении этого времени сборка извлекается из холодильника. Деталь 3 удаляется с детали 1 путем плоскопараллельного смещения. Мини-стекла со сформированными на их поверхности агарозными блоками извлекаются из детали 1.

Таким образом, заявляемое устройство позволяет производить приготовление мини-слайдов с трехслойными агарозными блоками на их поверхности, стандартизировать толщину агарозных слоев, получить равномерность распределения клеток в агарозном геле, существенно экономить расход химических реактивов и увеличить производительность труда исследователя.

Заявленная конструкция апробирована в модельных экспериментах на изолированных клетках лабораторных животных, а также при проведении генотоксических анализов крови здоровых доноров и пациентов, проходивших послеоперационную амбулаторную химиотерапию по поводу рака молочной железы, и показала свою высокую эффективность.

Пример 1.

Устройство использовалось в сравнительных экспериментах по выявлению причин межлабораторных различий в регистрируемом уровне повреждений ДНК в клетках костного мозга мышей. Использование устройства позволило проводить процедуру электрофореза в камерах меньшего размера. Например, для 24-х образцов, приготовленных с использованием стандартных предметных стекол, необходимо было

использовать электрофоретическую камеру типа Sub-Cell Model 192 (Bio-Rad, США) с объемом электрофоретического раствора 2,1 л. В то время как для 24 стекол, приготовленных с использованием заявляемого устройства, достаточно было камеры типа SE-1 (ООО "Хеликон", Россия) с объемом электрофоретического раствора всего 0,25 л. Из этого примера видно, что почти в 10 раз уменьшается расход электрофоретического раствора, тем самым снижается себестоимость проводимого анализа и снижается уровень загрязнения окружающей среды. Использование более дешевой электрофоретической камеры также приводит к уменьшению себестоимости проводимого анализа.

Пример 2.

Устройство использовалось для исследования повреждающего действия рентгеновского излучения на ДНК лейкоцитов цельной крови мыши. С помощью шести аналогичных экземпляров устройства были приготовлены 24 препарата (слайда) с иммобилизованными в агарозу лейкоцитами, при этом агароза смешивалась с разведенной в 6 раз цельной кровью и наносилась на слайды. Для исследования потребовалось 20 мкл цельной крови и 800 мкл легкоплавкой 0.5% агарозы. Общее время приготовления препаратов составило менее 30 мин. В результате проведенных исследований была определена дозовая зависимость повреждающего действия рентгеновского излучения (дозы 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 и 10 Гр) на ДНК лейкоцитов цельной крови выбранного лабораторного животного с использованием трех повторных препаратов (слайдов) на каждую экспериментальную точку, что позволило получить статистически достоверные результаты. Использование устройства позволило ускорить время приготовления препаратов и, следовательно, ускорить анализ, уменьшить количество необходимого для анализа биологического материала и сократить расход дорогостоящей химически модифицированной легкоплавкой агарозы.

Пример 3.

На препаратах, приготовленных с помощью заявляемого устройства и содержащих мышиные спленоциты, облученные рентгеновским излучением в дозе 8 Гр, была проведена оценка распределения нуклеоидов клеток по всей поверхности слайда. Регистрировали не только уровень повреждений ДНК, но и координаты индивидуальных нуклеоидов. Анализ полученных результатов показал равномерное распределение нуклеоидов по поверхности препарата при сканировании в одной оптической плоскости и отсутствие существенных различий в уровне повреждений ДНК между нуклеоидами, расположенными в центральной части препарата и на краях. Таким образом, использование устройства позволяет получать равномерное распределение нуклеоидов на слайде, позволяет проводить анализ всех клеток, содержащихся на слайде, и снимает проблему "краевых эффектов".

Группа изобретений относится к области биомедицины. Предложен набор и способ для приготовления многослойных агарозных блоков на поверхности мини-стекол. Набор состоит из первой детали, второй и третьей детали. Первая деталь представляет собой плоскопараллельную пластину, на которой через равные промежутки закреплены разделительные блоки с высотой, превышающей толщину мини-стекол. Мини-стекла установлены между блоков, на 50-100 мкм. Вторая деталь представляет собой плоскопараллельную пластину, одна сторона которой представляет собой полированную поверхность, по краям которой приварены две боковые ножки в виде блоков толщиной 50±5 мкм. Третья деталь представляет собой плоскопараллельную пластину, одна сторона которой представляет собой полированную поверхность, по краям которой приварены две боковые ножки в виде блоков толщиной 100±5 мкм. Способ приготовления многослойных агарозных блоков на поверхности мини-стекол осуществляют с использованием вышеуказанного набора. Изобретения обеспечивают приготовление серии слайдов с агарозными блоками фиксированного объёма со стандартной толщиной слоёв агарозы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

1. Набор для приготовления многослойных агарозных блоков на поверхности мини-стекол, состоящий из первой детали, представляющей собой плоскопараллельную пластину (1), на которой через равные промежутки закреплены разделительные блоки (2) с высотой, превышающей толщину мини-стекол (3), установленных между блоков (2), на 50-100 мкм; второй детали, представляющей собой плоскопараллельную пластину (4), одна сторона которой представляет собой полированную поверхность, по краям которой приварены две боковые ножки в виде блоков (5) толщиной 50±5 мкм; третьей детали, представляющей собой плоскопараллельную пластину (6), одна сторона которой представляет собой полированную поверхность, по краям которой приварены две боковые ножки в виде блоков (7) толщиной 100±5 мкм; первая, вторая и третья детали могут быть изготовлены из стекла, тефлона, металла или других материалов, обладающих устойчивостью к воздействию концентрированных растворов органических кислот и щелочей.

2. Способ приготовления многослойных агарозных блоков на поверхности мини-стекол с использованием набора по п. 1, характеризующийся тем, что мини-стекла (3) закрепляют в первой детали между блоками (2) путем приклеивания их на агарозу, при этом поверх первой детали помещают вторую деталь стороной, не содержащей блоков (5), а образовавшийся просвет между мини-стеклом и второй деталью заполняют раствором агарозы, после застывания агарозного геля осуществляют снятие второй детали с первой детали для нанесения на сформированные агарозные гели суспензии исследуемых клеток в легкоплавкой агарозе, после нанесения клеток вторую деталь полированной стороной помещают на первую деталь, содержащую раствор агарозы с исследуемыми клетками, после застывания агарозного геля вторую деталь снимают с первой детали и наносят раствор легкоплавкой агарозы на поверхность сформированных гелей, затем первую деталь накрывают помещаемой на ножки третьей деталью, после застывания агарозного геля осуществляют снятие с первой детали третьей детали и мини-стекол со сформированными на их поверхности агарозными блоками.