ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2014 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лечению и профилактике трихофитии крупного рогатого скота.

Среди микозов сельскохозяйственных животных наиболее широкое распространение получили болезни, вызываемые дерматофитами. На протяжении многих лет борьба с дерматомикозами животных, в частности трихофитией крупного рогатого скота, в основном ведется с использованием живых вакцин (SU 955571 A1, 28.03.1980; RU 2207877 C1, 10.07.2003; RU 2018321 C1, 30.08.1994; RU 2093178 C1, 20.10.1997).

Эти вакцины хорошо зарекомендовали себя на практике. Их применение позволило в значительной мере снизить возникновение эпизоотических вспышек микозов в хозяйствах. Однако использование живой вакцины не позволяет полностью освободить хозяйство от возбудителя инфекции. Микотические очаги, образующиеся на месте введения живой вакцины, содержат живые клетки ретрокультуры аттенуированного вакцинного штамма, который фактически пассируется через животное при помощи иммунизации. Эти клетки в свою очередь по ряду различных причин из микотических очагов попадают во внешнюю среду, обсеменяя подстилку, предметы ухода и содержания за животными, спецодежду обслуживающего персонала и др., что делает возможным рециркуляцию вакцинного штамма в хозяйстве и заражение животных.

В таких условиях малоэффективными будут такие санитарные мероприятия как дезинфекция и дератизация помещений. Поэтому достигнуть освобождения хозяйства от этой инфекции с помощью живых вакцин становится практически невозможным.

Живые вакцины против трихофитии крупного рогатого скота выпускаются в сухом виде - лиофилизированном. Для того чтобы сухую вакцину ввести в организм животного, ее надо предварительно растворить в специальном растворителе, который также производится заводом-изготовителем данной вакцины. Такая манипуляция (разведение сухой вакцины) является дополнительной нагрузкой для ветеринарных специалистов, проводящих вакцинацию. Работа с живыми вакцинами должна проводиться с соблюдением определенных правил осторожности, и после вакцинации необходимо проводить утилизацию шприцов и флаконов только после их автоклавирования. Тогда как при работе с инактивированной вакциной все эти мероприятия не применяются и по закону не прописываются в НТД и инструкции по применению убитой вакцины. Также за счет дополнительных затрат на проведение лиофилизации живой вакцины, дополнительного использования фасовочной тары для комплектации вакцины специальным растворителем и увеличивающихся объемов транспортируемого материала себестоимость конечного продукта и конечная стоимость препарата существенно увеличивается. С учетом того что в убитой вакцине присутствует инактиватор и одновременно консервант - формалин, вакцина может храниться после вскрытия флакона значительно дольше, чем вскрытый флакон с разведенной живой вакциной, так как при изготовлении живых вакцин не допускается использование консервантов и инактиваторов.

Использование убитой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота в комплексе с другими мерами борьбы и профилактики предоставляет возможность создания животноводческих хозяйств, свободных от инфекций.

Таким образом, актуальной задачей является разработка инактивированной вакцины для профилактики и лечения трихофитии крупного рогатого скота.

В практической ветеринарии используются инактивированные ассоциированные вакцины, применяемые для борьбы с трихофитией и микроспорией одновременно нескольких видов животных, включая крупный рогатый скот. В состав таких вакцин входят несколько антигенов из различных культур дерматофитов, в том числе и из культуры гриба Trichophyton verrucosum. Известна ассоциированная инактивированная вакцина для борьбы с дерматомикозами животных - собак, кошек, пушных зверей и кроликов (RU 2192885 C2, 20.11.2002). Известна вакцина Поливак-ТМ - ассоциированная инактивированная вакцина против дерматомикозов животных, которая включает грибы из рода Трихофитон (стригущий лишай) и Микроспорум.

Однако крупный рогатый скот в естественных условиях не болеет микроспорией и трихофитией, вызываемыми другими видами возбудителей дерматофитозов, кроме Trichophyton verrucosum. Следовательно, для лечения и профилактики трихофитии у крупного рогатого скота вполне достаточно изготавливать вакцину только лишь из культуры гриба Trichophyton verrucosum, и нет никакой необходимости перегружать организм животного, в частности его иммунную систему, антигенами против болезней, которыми он не заболеет.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является живая ассоциированная вакцина против трихофитии рогатого скота и других парнокопытных, содержащая антигены двух штаммов гриба Trichophyton verrucosum. Длительность иммунитета 2 года. Срок хранения 14 месяцев. Вакцину можно готовить в сухом виде. (RU 2093178 C1, 20.10.1997) - прототип.

Недостатками ближайшего аналога являются возможность рециркуляции вакцинного штамма в хозяйстве и заражение животных, недостаточная длительность иммунитета и срока хранения, дополнительная нагрузка на иммунную систему животных из-за использования двух штаммов Trichophyton verrucosum. При изготовлении известной вакцины в сухом виде - сложность применения и повышение себестоимости изготовления и применения из-за необходимости использования растворителя.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение длительности иммунитета до 30 месяцев, повышение стабильности вакцины и срока хранения вакцины до 18 месяцев, возможность полного освобождения хозяйств от возбудителя трихофитии крупного рогатого скота, а также упрощение применения вакцины, снижение себестоимости ее производства и использования, снижение нагрузки на иммунную систему животных.

Инактивированная вакцина для профилактики и лечения трихофитии у крупного рогатого скота характеризуется тем, что содержит элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры; формалин и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов в 1 мл:

элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты   мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры 80-120 млн формалин 0,003 мл физиологический раствор до 1 мл

Этой вакцине присвоено название Вакдерм-ТФ.

Вакцина Вакдерм-ТФ может быть изготовлена из любого штамма гриба Trichophyton verrucosum, выделенного от больного теленка или больной трихофитией взрослой коровы, быка, а также известных штаммов гриба Trichophyton verrucosum, применяемых в производстве вакцин против трихофитии крупного рогатого скота.

Способ изготовления вакцины Вакдерм-ТФ заключается в следующем:

- выращивание культуры гриба Trichophyton verrucosum в матрасных колбах на стандартной твердой среде сусло-агар (сусло пивное, неохмеленное, плотностью 14-17% по Баллингу, вода очищенная водопроводная, агар-агар 2,5%) при температуре 26-28°C в течение 20-25 суток;

- съем выращенной культуры специальными металлическими скребками и последующая гомогенизация культуры в блендерах, обеспечивающих достаточное размалывание и разъединение элементов гриба друг от друга;

- добавление стерильного физиологического раствора;

- определение концентрации всех элементов гриба в полученном гомогенате;

- добавление в гомогенат формалина из расчета содержания его в вакцине 0,3% (или 0,003 мл в 1 мл вакцины), доведение количества элементов гриба в готовой вакцине до 80-120 млн в 1 мл.

Увеличение концентрации элементов гриба в 1 мл свыше 120 млн ведет к повышению реактогенности вакцины, а уменьшение концентрации менее 80 млн элементов гриба в 1 мл значительно снижает ее иммуногенность, поэтому оптимальной является концентрация элементов гриба 80-120 млн в 1 мл вакцины.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выращивали культуру гриба Trichophyton verrucosum в матрасных колбах на стандартной твердой среде сусло-агар (сусло пивное неохмеленное, плотностью 14-17% по Баллингу, вода очищенная водопроводная, агар-агар 2,5%) при температуре 26-28°C в течение 20-25 суток. Снимали выращенную культуру специальными металлическими скребками и затем гомогенизировали ее культуры в блендерах, обеспечивающих достаточное размалывание и разъединение элементов гриба друг от друга. Добавляли стерильный физиологический раствор. Определяли концентрацию всех элементов гриба (фрагменты мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры) в полученном гомогенате. Далее подтитровывали концентрацию элементов гриба в гомогенате до концентраций клеток гриба 80-120 млн в 1 мл. К полученной суспензии добавляют официнальный раствор (40%) формалина из расчета содержания его в вакцине 0,3% (или 0,003 мл в 1 мл вакцины). Полученную таким образом вакцину проверяли на наличие бактериальной и грибной обсемененности, высевая пробы на МПА, МПБ, агар Сабуро, среду Китт-Тароци. Затем определяли безвредность и реактогенность путем внутримышечного введения животным 0,5-1,0 мл вакцины. Введение вакцины не вызывает отрицательной реакции со стороны организма и вызывает выработку иммунитета на срок не менее 30 месяцев.

Пример 2. Провели изучение стабильности вакцины Вакдерм-ТФ с концентрацией клеток гриба 80-120 млн/мл при температуре хранении 2°C и 10°C в течение 6, 12 и 18-ти месяцев. В исследованиях использовали две опытно-лабораторные серии вакцины Вакдерм-ТФ (№№01 и 02) и одну опытно-промышленную серию вакцины №03:

Качество вакцины оценивали по следующим показателям:

- внешний вид;

- наличие механических примесей и других посторонних включений;

- стерильность;

- количество элементов гриба в 1 мл;

- безвредность;

- иммуногенная активность.

Исследования показателей качества вакцины проводили до закладки ее на длительное хранение (выходной контроль качества вакцины после завершения цикла производства), через 6 месяцев, 12 месяцев и 18 месяцев в условиях хранения при t 2°C и 10°C согласно требованиям НТД.

Полученные результаты исследований свидетельствуют о высокой стабильности вакцины Вакдерм-ТФ. Все показатели контроля качества опытно-лабораторных серий №№01, 02 и опытно-промышленной серии №03 после их изготовления оставались в допустимых пределах. Также эти показатели были в норме при хранении испытуемых серий вакцины в течение 6, 12 и 18 месяцев при t° 2°C и 10°C.

Пример 3. В последующем комиссионном опыте, с целью подтверждения полученных выше результатов, проверяли иммуногенную активность вакцины Вакдерм-ТФ опытных серий №02 и №03, изготовленных 15.10.08 г. и 01.11.08 г., соответственно. В качестве лабораторных животных использовали кроликов живым весом 2,5 кг, в количестве 15 голов. Иммунизацию животных проводили согласно отработанной схеме вакцинации: двукратно, внутримышечно, с интервалом 7-10 суток, в дозе 1,0 мл с содержанием 80-120 млн элементов гриба T.verrucosum в 1 мл. Контроль качества иммуногенной активности оценивали методом прямого заражения вакцинированных кроликов и кроликов контрольной группы, не привитых вакциной Вакдерм-ТФ. Результаты комиссионного опыта, так же, как и в предыдущих экспериментах, показали, что опытные серии вакцины Вакдерм-ТФ №№02 и 03 обладали высокими иммуногенными свойствами. Все вакцинированные кролики не заболели трихофитией после экспериментального заражения вирулентными культурами гриба T.verrucosum.

Доклинические испытания опытной вакцины Вакдерм-ТФ на лабораторных животных показали, что данная вакцина обладает выраженными протективными свойствами против трихофитии, вызываемой грибом T.verrucosum. Все животные, иммунизированные опытной вакциной в дозах 50-200 млн клеток, были устойчивыми к экспериментальному заражению вирулентной культурой возбудителя. Оптимальной дозой для иммунизации кроликов была установлена доза 80-120 млн клеток в 1 мл вакцины. При введении таких доз в организме животных вырабатывался достаточно напряженный иммунитет против трихофитии, и практически отсутствовала поствакцинальная реакция. Также отрицательной была поствакцинальная реакция у телят, которая исследовалась в опыте по определению воздействия различных доз вакцины на организм подопытных животных.

Пример 4. Исследования по изучению действия различных доз вакцины Вакдерм-ТФ на организм телят. С этой целью было отобрано 20 телят 1,5-2-месячного возраста голштинской породы. Критерием отбора послужило удовлетворительное клиническое состояние животных (нормальная температура тела, хорошая упитанность, наличие хорошего аппетита, отсутствие каких-либо признаков различных заболеваний и, в частности, - дерматомикозов). Все поголовье телят разделили на четыре группы по 5 голов в каждой (одна контрольная и три подопытные группы). Телят опытных групп прививали вакциной Вакдерм-ТФ, серия 03, контроль 03, изготовленной 01.11.08 г. ЗАО «Фирма НПВ и ЗЦ Ветзвероцентр». Всем подопытным животным вакцину вводили двукратно внутримышечно, в область крупа, предварительно выстригая место инъекции и обрабатывая его 70% этиловым спиртом. Первое введение вакцины было проведено 1 апреля 2009 г. в левую часть крупа, а второе - 11 апреля 2009 г. в правую. Животным первой группы вводили вакцину в дозе 1 мл, животным второй группы в дозе 3 мл, животным третьей группы в дозе 5 мл. Животным четвертой группы (контроль) вакцину не вводили.

В период проведения эксперимента за всеми животными вели ежедневное наблюдение, обеспечивали всех подопытных телят одинаковыми условиями содержания и одинаковым полноценным рационом кормления, проводили тщательный клинический осмотр (оценивали общее состояние животных, состояние видимых слизистых оболочек, наличие аппетита, обследовали весь кожно-волосяной покров животных, места введения вакцины, при необходимости проводили измерение температуры тела животных, пульса и частоты дыхания). Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 №№ групп Кол-во жив. в группе(гол). Индивид № жив. Привиты вакциной Вакдерм-ТФ в дозе (мл) Отрицательная поствакцинальная реакция (уплотнения и болезненность на месте инъекции) 1-ая вакцинация 2-ая вакцинация После 1-й вакцинации После 2-й вакцинации 1 5 17736 1,0 1,0 Отсутствует Отсутствует 23597 1,0 1,0 Отсутствует Отсутствует 17703 1,0 1,0 Отсутствует Отсутствует 17693 1,0 1,0 Отсутствует Отсутствует 23359 1,0 1,0 Отсутствует Отсутствует 2 5 38051 3,0 3,0 Отсутствует Отсутствует 23852 3,0 3,0 Отсутствует Отсутствует 10401 3,0 3,0 Отсутствует Отсутствует 23878 3,0 3,0 Отсутствует Отсутствует 10378 3,0 3,0 Отсутствует Отсутствует

              3 5 27582 5,0 5,0 Отсутствует Отсутствует 23879 5,0 5,0 Отсутствует Отсутствует 38056 5,0 5,0 Отсутствует Отсутствует 23881 5,0 5,0 Отсутствует Отсутствует 17684 5,0 5.0 Отсутствует Отсутствует 4 5 23882 Не привиты вакциной Не привиты вакциной - - 17590 - - 17887 - - 17582 - - 17297 - -

Из результатов эксперимента, представленных в таблице 1 видно, что у всех вакцинированных животных поствакцинальная реакция (уплотнение и болезненность на месте инъекции) отсутствовала. Общее клиническое состояние подопытных животных было удовлетворительным, признаков повышения температуры тела животных отмечено не было, все видимые слизистые оболочки были в норме, поедаемость кормов хорошая. У животных контрольной группы все физиологические показатели также были в норме.

Таким образом, было установлено, что вакцина Вакдерм-ТФ в дозе 1,0; 3,0 и 5,0 мл не вызывает в организме телят отрицательных последствий ни после первого и ни после второго введения вакцины.

Пример 5. Для проведения более широких испытаний инактивированной вакцины Вакдерм-ТФ иммунизацию телят проводили в животноводческом комплексе. С апреля по октябрь 2011 г. вакциной серии №01, контроль 01 было привито 370 телят и серии №02, контроль 02 - 760 телят. В течение всего срока применения вакцины за привитыми животными, с момента начала вакцинации и до 13 октября 2011 г. включительно, проводилось клиническое наблюдение. В результате обследования привитого поголовья животных, больных дерматомикозами, в частности трихофитией, выявлено не было.

Одновременно с проведением этого опыта мы также проводили обследование поголовья крупного рогатого скота, привитого ранее в 2008-2010 годах опытной вакциной Вакдерм-ТФ. Всего было обследовано 970 голов из 1267 нами вакцинированных животных. Результаты обследования вакцинированного поголовья крупного рогатого скота и результаты лабораторных микологических исследований показали отсутствие дерматомикозов у всех обследованных животных. Жидкая инактивированная вакцина Вакдерм-ТФ при введении в организм животных формирует напряженный, продолжительный иммунитет против трихофитии, обеспечивая устойчивость животных к заболеванию трихофитией в течение не менее 30 месяцев (срок наблюдения) с момента вакцинации.

Пример 6. Вакцинацию животных с лечебной и профилактической целью проводили вакциной Вакдерм-ТФ. В процессе проведения эксперимента за всеми животными вели регулярное наблюдение. Учитывали общее состояние животных, аппетит, состояние кожного покрова, наличие локальной реакции в месте введения вакцины.

Предварительное обследование поголовья показало, что у 27 голов наблюдали проявление явно выраженных клинических признаков трихофитии, характеризующихся образованием множественных микотических очагов, локализующихся в области головы, конечностей, реже других частях тела. Микологические исследования отобранного с пораженных участков материала показали наличие возбудителя трихофитии гриба T.verrucosum. Общее клиническое состояние обследованных животных на время осмотра было удовлетворительным.

Перед вакцинацией место инъекции в области крупа выстригали и обрабатывали 70% этиловым спиртом. Вакцину вводили двукратно внутримышечно с лечебной целью по 2 мл, с интервалом между введениями 10 суток. Первая вакцинация была проведена 01.04.2009 г., вторая вакцинация - 11.04.2009 г.

Выздоровление больных животных наступало на 20-30-е сутки после второго введения вакцины и характеризовалось отторжением корок и чешуек с микотических очагов и началом отрастания нового волоса. Иногда в участках поражения после отторжения корок и чешуек мы наблюдали изменение пигментации кожи и вновь отросших волос. На момент последнего обследования телят хозяйства 02.06.2009 г. клинически больных трихофитией телят обнаружено не было.

За время проводимых работ по иммунизации животных, в хозяйство непрерывно поступали телята 1-1,5 месячного возраста, которые размещались в том же закрытом помещении, но в разных секциях, разделенных между собой решетчатыми перегородками. Вновь поступившие телята также были вакцинированы с профилактической целью вакциной Вакдерм-ТФ. Так, 58 телят были вакцинированы 26.04.2009 г., 136 телят - 20.05.2009 г., 157 телят - 07.07.2009 г. и 76 телят 20.08.2009 г.

Перед вакцинацией место инъекции в области крупа выстригали и обрабатывали 70% этиловым спиртом. Вакцину вводили двукратно внутримышечно с профилактической целью по 1 мл, с интервалом между введениями 10 суток.

В результате регулярного обследования вакцинированного поголовья телят, за весь период наблюдения, было отмечено быстрое выздоровление больных животных и прекращение появления новых случаев трихофитии у всех привитых животных.

Данные исследований профилактической и терапевтической эффективности вакцины Вакдерм-ТФ показывают, что производственные испытания показали ее высокую профилактическую и лечебную эффективность. Жидкая инактивированная вакцина для профилактики и лечения трихофитии крупного рогатого скота Вакдерм-ТФ при введении в организм животных формирует напряженный, продолжительный иммунитет против трихофитии, обеспечивая устойчивость животных к заболеванию трихофитией в течение не менее 30 месяцев (срок наблюдения) с момента вакцинации.

Источники информации:

SU 955571 A1, 28.03.1980

RU 2207877 C1, 10.07.2003

RU 2018321 C1, 30.08.1994

RU 2093178 C1, 20.10.1997

RU 2192885 C2, 20.11.2002.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к профилактике и лечению трихофитии крупного рогатого скота. Инактивированная вакцина для профилактики и лечения трихофитии крупного рогатого скота содержит элементы гриба Trichophyton verrucosum - клетки и фрагменты мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры; формалин и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов в 1 мл:

элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты   мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры 80-120 млн формалин 0,003 мл физиологический раствор до 1 мл

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение длительности иммунитета до 30 месяцев, повышение стабильности вакцины и срока хранения вакцины до 18 месяцев, возможность полного освобождения хозяйств от возбудителя трихофитии крупного рогатого скота, а также упрощение применения вакцины, снижение себестоимости ее производства и использования, снижение нагрузки на иммунную систему животных. 6 пр., 1 табл.

Инактивированная вакцина для профилактики и лечения трихофитии крупного рогатого скота, характеризующаяся тем, что содержит элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры; формалин и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов в 1 мл:
элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты   мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры 80-120 млн формалин 0,003 мл физиологический раствор до 1 мл.