ШТАММ ГРИБА TRICHOPHYTON VERRUCOSUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ДЕРМАТОФИТОЗОВ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/14 A61K39/00 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к ветеринарной микологии, в частности к получению штамма Trichophyton verrucosum, используемого для изготовления вакцин против дерматофитозов животных.

Известен штамм гриба Trichophyton verrucosum ТФ-130 Л, используемый для изготовления вакцины против трихофитоза крупного рогатого скота. Для данного штамма характерны присущие ему культурально-морфологические, спорообразующие признаки, вирулентные и антигенно-иммуногенные свойства (Авт. св. СССР N 955571, кл. А 61 К 39.00, C 12 N 1/14, 1980).

В результате длительного использования у данного штамма понизился уровень спорообразования, возросла степень диссоциации в сторону увеличения в его популяции содержания слабоспорулирующих морфологических типов, вследствие чего снизилась эффективность вакцины и возросли издержки при ее производстве.

Целью изобретения является получение штамма гриба Trichophyton verrucosum, обладающего высоким уровнем иммуногенной активностии спорогенеза, гомогенным составом популяции, а также возможностью изготовления вакцин для профилактики и терапии дерматофитозов у других видов животных.

в соответствии с классификацией Георга возбудитель трихофитоза животных имеет основное название Trichophyton verrucosum Bodin, 1902 (syn: T.album Sabouraud, 1908; T.ochraceum Sabouraud, 1909; T.discoides Sabouraud, 1909; T.faviforme-med.ac). Лещенко В.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний, М. Медицина, 1982, стр. 34).

Новый штамм гриба Trichophyton verrucosum получен из популяции штамма гриба T.verrucosum ТФ-130 Л (T.verrucosum ТФ-130 Л) методом ступенчатого отбора по признаку спорообразования наиболее быстро растущих колоний в популяции, обладающих опpеделенными культурально-морфологическими признаками и интенсивным образованием стабильных иммуногенных клеток микроконидий (алейрий).

Штамм гриба Trichophyton verrucosum депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер ТВ-201.

Штамм гриба T.verrucosum ТВ-201 ВГНКИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки. Мицелий не окрашен, септированный ветвящийся. Гифы ровные или извитые, диаметр 1,5-5,0 мкм, микроконидии (алейрии) сферические, овальные, грушевидные, иногда палочковидные размером 2,0х2,0 - 2,0х5,0 мкм. Макроконидии тонкостенные, как правило, с тупой вершиной, с 1-2 перегородками, размер 4,0-5,0х8,0-10,0 мкм. В стареющих культурах встречаются артроспоры, а также терминальные и интеркалярные хламидоспоры.

Культуральные признаки.

на сусло-агаре растет в виде плоской или слабо выпуклой, с белой или светло кремовой, бархатистой или бархатисто-пушистойколонки с пуговчатым возвышением в центре, с выраженной зональностью роста в виде концентрических колец (обычно 2-5), с образованием интенсивной бородавчатости по периферии, растущий край ровный или зубчатый, паутинистый, реверс не окрашен или желтый, диаметр колонии 40-50 мм (20-25 дневная культура).

На морковно-картофельном агаре растет в виде плоской, ровной белой, бархатистой колонии со средней степенью развития воздушного мицелия и с выраженной концентрической зональностью (до 5 колец), растущий край ровный или зубчатый, слабо паутинистый, реверс не окрашен или светло желтый, более темный в центре, диаметр колонии 35-40 мм (20-25 дневная культура).

На агаре Сабуро растет в виде плоской, с пуговчатым возвышением в центре, белой с кремовым оттенком колонии, паутинисто-порошистой, реверс светло желтый, более темный в центре, диаметр колонии 40-60 мм (20-25 дневная культура).

На агаре Григораки растет в виде сильно радиально складчатой, кремовой с более интенсивной окраской в центре, бархатисто-порошистой, ближе к краю пушистой колонии, растущий край ровный или зубчатый, реверс светло желтый, с широкой зоной (10-12 мм) осветления среды вокруг колонии, диаметр 40-60 мм (20-25 дневная культура).

Биохимические свойства.

Скорость разрушения эмульсионного слоя фотопленки фильтратом культуральной жидкости 125 мин.

Спорообразование.

Максимальный уровень спорообразования на сусло-агаре 169,2-211,9 млн/см³.

Вирулентные свойства.

При аппликации культуры гриба в дозе 10-25 млн/см³ микроконидий на предварительно эпиллированный и скарифицированный участок кожи у животных ранее не болевших дерматофитозом и неиммунизированных, на 6-10 день развивается специфический дерматофитозный очаг, наблюдается гиперемия кожи, экссудативно воспалительный процесс, образование шелушащегося струпа, но клиника экспериментального дерматофитоза стертая. Срок переболевания животных (в зависимости от вида) 15-30 дней. Выделенный из патологического материала штамм гриба по своим признакам и свойствам соответствует исходному.

Антигенные свойства.

На введение культуры штамма гриба в организме животных (телята, кролики и др.) образуется специфические агглютинины (РА) в титрах 1:80-1:640.

Иммуногенные свойства.

При двукратной иммунизации телят вакциной, изготовленной из данного штамма в дозе, содержащей не менее 20 млн/см³ живых микроконидий, у 98-100% животных формируется стойкий напряженный иммунитет к последующему заражению патогенным грибом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Изучают изменчивость состава популяции культуры штамма гриба Т.verrucosum ТФ-130 Л и штамма гриба Т.verrucosum ТВ-201 ВГНКИ, Суспензии выращенных культур засевают на поверхность сусло-агара в чашках Петри и после инкубирования в термостате подсчитывают общее количество колоний и определяют процентное соотношение в популяции колоний различающихся по форме, морфологии и пигментации.

При изучении культур штаммов грибов устанавливают 3 вида колоний:
I тип колония плоская или слабо выпуклая, белая или светло-кремовая, бархатистая или бархатисто-пушистая, с пуговчатым возвышением в центре, с выраженной зональностью роста в виде концентрическихколец (обычно 2-5), с образованием интенсивной бородавчатости по периферии, растущий край ровный или зубчатый, паутинистый, реверс не окрашен или желтый.

II тип колония выпуклая, белая или кремовая, бархатистая, нескладчатая, концентрическая зональность отсутствует, периферия плоская, растущий край ровный или зубчатый, реверс не окрашен или с желтым оттенком.

III тип колония выпуклая, полусферическая, белая, бархатистая, пушистая, на 30 день роста может быть радиально складчатой, растущий край ровный, реверс не окрашен.

Эти морфологические типы колоний обладают различной способностью к спорообразованию. Максимальный уровень спорообразования наблюдается у I типа.

Соотношение морфологических типов в популяции штаммов ТФ-130Л и ТВ-201 ВГНКИ приведено в табл. 1.

Как видно из таблицы, преобладающим морфологическим типом у штамма ТВ-201 ВГНКИ является I, в то время как у штамма ТФ-130 Л II.

П р и м е р 2. Изучают влияние популяционных пересевов (генераций) на спорообразование культур штамма гриба Т.verrucosum ТФ-130 Л и штамма гриба Т. verrucosum ТВ-201 ВГНКИ. С этой целью засевают суспензиями обеих культур на сусло-агар в пробирках, выращивают посевы в термостате, подсчитывают концентрацию микроконидий и пересевают затем на новые пробирки, повторяя пересевы до наблюдения значительного спада спороообразования.

Влияние популяционных пересевов на уровень спорообразования представлено в табл. 2.

как видно из таблицы, культура штамма Т.verrucosum ТВ-201ВГНКИ в процессе 7-9 пересевов (генераций) сохраняет способность к спорообразованию на достаточно высоком уровне. Максимальное спорообразование наблюдается на 3-5 пересеве.

П р и м е р 3. Для получения вакцины 15-20 дневную культуру штамма гриба Т. verrucosum ТВ-201 ВГНКИ выращивают в матрацных колбах на сусло-агаре (рН 6,8-7,0) при температуре 26-28^oC в течение 12-20 дней.

Выращенную культуру в условиях асептики снимают с поверхности питательной среды специальными скребками и помещают в стерильные банки. Грибную массу штамма ТВ-201 ВГНКИ гомогенизируют в миксерах, либо в блендерах, либо в коллоидных мельницах, а затем с помощью стерильной воды полученный гомогенат ресуспензируют в присутствии пенициллина и стрептомицина (по 100 ЕД/см³) до концентрации микроконидий не менее 300 млн/см³.

При размоле грибной массы, полученной из культур с 3 матрацев получают гомогенат из штамма ТВ-201 с концентрацией микроконидий 400-600 млн/см³, из штамма ТФ-130 Л 200-300 млн/см³. К полученной суспензии грибной массы, после контроля на чистоту добавляют равное количество сахарозо-желатинового стабилизатора, тщательно перемешивают, разливают в стерильные флаконы и лиофильно высушивают.

Готовая вакцина представляет собой однородную пористую сухую массу в виде таблетки серого цвета. Вакцина сохраняет свои биологические свойства в течение 12 месяцев при условии хранения в закрытых, сухих, темных помещениях при температуре 2-10^oC. К вакцине прилагаются флаконы со стерильным разбавителем.

П р и м е р 4. Изучают антигенную и иммуногенную активность вакцины против трихофитоза животных из штамма ТВ-201 ВГНКИ, приготовленной по примеру 3, в сравнении с известной вакциной из штамма ТФ-130 Л.Вакцины применяют двум группам кроликов, породы шиншилла, живой массой 2,5-3,0 кг, вводя внутримышечно с внутренней стороны бедра, двукратно с интервалом 7 дней в дозе 0,6 см³ (содержание в прививочной дозе 10 млн жизнеспособных микроконидий).

Контрольную группу кроликов не вакцинируют. У кроликов берут кровь до вакцинации и начиная с 7 дня после нее, через каждый 7 дней до 42 дня, а также на 63 и 98 день эксперимента. Получают сыворотки крови, в которых определяют уровень антител в РА.

Динамика антител у кроликов, иммунизированных вакцинами на основе антигенов из штаммов грибов ТВ-201 ВГНКИ и ТФ-130 Л представлены в табл. 3.

Из таблицы видно, что вакцина из штамма гриба ТВ-201 ВГНКИ по сравнению с вакциной из штамма ТФ-130 Л вызывает у кроликов образование более напpяженного и продолжительного иммунитета.

П р и м е р 5. Приготовленную по примеру 3 вакцину против трихофитоза животных используют для вакцинации телят 4-45 дневного возраста. Телят вакцинируют двукратно в ягодичную мышцу в дозе 1 см³ по 20 млн жизнеспособных микроконидий. Вакцину, приготовленную из культуры штамма ТВ-201 ВГНКИ вводят с интервалом 10-14 дней. Изучение поствакцинального иммунитета в этом случае проводят в течение 3 лет. Через 45-60 дней после 1 иммунизации часть телят заражают общепринятым накожным методом вирулентной культурой гриба Т.verrucosum 153 в дозе 5,0 млн микроконидий на 1 см² кожи. Одновременно в каждом случае заражают 3-5 неиммунизированных, ранее не болевших трихофитией телят (контроль).

Результаты по изучению поствакцинального иммунитета к трихофитозу у телят представлены в табл. 4.

Из таблицы следует, что вакцина на основе антигена из штамма гриба ТВ-201 ВГНКИ, вырабатывает иммунитет против трихофитии при экспериментальном заражении. Телята ранее не иммунизированные и не болевшие трихофитией восприимчивы к экспериментальному заражению вирулентной культурой возбудителя.

Проведенные испытания показали, что новый штамм гриба Т.verrucosum ТВ-201 ВГНКИ обладает высокой иммуногенной активностью, вызывая у животных выработку напряженного и продолжительного иммунитета, что позволяет рекомендовать его для изготовления эффективного биопрепарата (вакцины) против трихофитии животных.

Вакцина против трихофитии животных, изготовленная на основе антигена из штамма гриба Т.verrucosum ТВ-201 ВГНКИ может заменить существующую вакцину, изготовляемую на основе антигена из штамма гриба Т.verrucosum ТФ-130 Л, как более высокоиммуногенная.

Биопрепарат готов к использованию.

Использование: биотехнология, микология, вакцина против дерматофитозов животных. Сущность изобретения: предложен штамм Trichophyton verrucosum ВГНКИ N ТВ-201, обладающий высоким уровнем спорогенеза и иммуногенной активности. Вакцина, изготовленная на основе антигена из штамма, индуцирует у крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов выработку стойкого напряженного иммунитета спустя 20-30 дней после применения. 4 табл.

Штамм гриба Trichophyton verrucosum ВГНКИ N ТВ-201 ВГНКИ-ДЕП, используемый для изготовления вакцин против дерматофитозов животных.