Изобретение относится к ветеринарной микологии, в частности к получению штамма Тrichophyton mentagrophytes, используемого для изготовления вакцины против трихофитии животных.
Известен штамм Тrichophyton mentahgrophytes N 135/1963, используемый для изготовления вакцины против трихофитии животных, в частности пушных зверей.
Данный штамм выделен от больной трихофитией лисицы в 1963 г и используется длительно для изготовления вакцины Ментавак. Вследствие снижения иммуногенных свойств используемого штамма при производстве вакцины ее эффективность снизилась. Кроме того, вакцина предназначена только для пушных зверей и кроликов и не рекомендовано ее применение другим видам животных.
Целью изобретения является получение штамма гриба Тrichophyton mentagrophytes, обладающего высоким уровнем спорогенеза и иммуногенной активности, однородностью состава популяции и возможностью изготовления вакцины против трихофитии разных видов животных.
Штамм гриба Тrichophyton mentagrophytes получен из эпизоотического, выделенного от белой мыши, методом ступенчатого отбора по признаку спорообразования наиболее быстрорастущих колоний с активным накоплением микроконидий. Штамм Тrichophyton mentagrophytes депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный N 27.
Штамм Тrichophyton mentagrophytes ВГНКИ N 27 характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки. Мицелий не окрашен, ровный, ветвистый, септированный, может распадаться на фрагменты, терминальные гифы не всегда образуют спирали (обычно 3-5 завитков), диаметр мицелия 2,0-3,0 мкм. Микроконидии многочисленные, округлые, грушевидные, удлиненные, близкие к палочковидной форме, располагаются на поверхности мицелия гроздьями, чаще отдельно, размер 1,5-5,2 мкм. Макроконидии единичные, количество перегородок 1-5, чаще 1-2, размер 10-30 х 3-8 мкм. В культурах 20-30-дневного возраста могут наблюдаться хламидоспоры, округлой формы с двуконтурной оболочкой, всегда единичные, 3-5 мкм в диаметре. Артроспоры возникают на отдельных участках мицелия, тонкостенные, по форме напоминают овальные или палочковидные микроконидии, размером 3-9 мкм в диаметре.
Культуральные свойства. На сусло-агаре растет в виде плоской, белой, бархатистой колонии с незначительным возвышением в центре, растущий край ровный, реверс красновато-коричневый, диаметр колонии 50-90 мм (15-20-дневная культура).
На агаре Сабуро растет в виде плоской, белой, бархатистой с кремовым оттенком колонии с небольшим возвышением в центре, растущий край ровный, реверс бледно-желтый, иногда более темный в центре, диаметр колонии 50-90 мм (15-20-дневная культура). На среде Геннеберга растет в виде белой, бархатистой, радиально складчатой колонии, растущий край паутинистый, реверс красновато-фиолетовый. Спорообразование: максимальный уровень спорогенеза на сусло-агаре 198,4-259,2 млн/см3.
Вирулентные свойства. При внутримышечном введении культуры штамма Тrichophyton mentagrophytes N 27 у морских свинок, кроликов, овец, коз, телят, спустя 2-3 недели на месте инъекции развивается специфический локализованный поверхностный трихофитийный очажок диаметром 2,0-2,5 см, который самопроизвольно излечивается в течение 15-20 дней. Микологически выделить возбудитель не удается. При нанесении культуры штамма неиммунным животным на скарифицированную кожу в дозе 0,25 млн/см3 микроконидий на месте аппликации развивается в течение 10-20 дней типичный трихофитийный очаг, при этом у животных отмечают повышение температуры на месте введения, припухлость и общее повышение температуры тела. Выделенный из патологического материала штамм по своим свойствам соответствует исходному.
Антигенные свойства. На введение культуры штамма в организме телят, овец, кроликов образуются специфические агглютинины в титрах 1: 40-1: 1280.
Иммуногенные свойства. Введение вакцины против трихофитии животных из штамма Тrichophyton mentagrophytes N 27 крупному рогатому скоту, овцам, козам, кроликам индуцирует у 98-100% животных спустя 20-30 дней образование стойкого напряженного иммунитета. Продолжительность иммунитета не менее 5 лет (срок наблюдения).
П р и м е р 1. Штамм Тrichophyton mentagrophytes N 27 ВГНКИ используют для изготовления вакцины против трихофитии животных. Для этого берут приготовленную 12-20-дневную взвесь культуры штамма гриба Тr. mentagrophytes ВГНКИ N 27, которой засевают матрицы с сусло-агаром и культивируют в термостате при 26-28оС в течение 12-20 дней. Грибную массу снимают с поверхности питательной среды специальными скребками в банки, соблюдая условия стерильности. Полученную массу гомогенизируют в коллоидной мельнице, добавляя стерильную воду и антибиотики из расчета 100 ЕД на 1 см3. После проверки грибной суспензии на чистоту (при наличии посторонней микрофлоры автоклавируют) тщательно смешивают с равным количеством сахарозо-желатинового стабилизатора, разливают во флаконы и лиофильно высушивают. Готовый препарат представляет собой высушенную пористую массу в виде серой таблетки, сохраняющей свои иммуногенные свойства в течение от 12 до 18 месяцев. Вакцина высокоэффективна против трихофитии сельскохозяйственных животных, предохраняет от заражения и проявления клинических признаков заболевания.
П р и м е р 2. Приготовленную по примеру 1 вакцину против трихофитии животных из штамма Тr. mentagrophytes ВГНКИ N 27 (ТМ-27) используют для иммунизации кроликов. Кроликов вакцинируют вакциной с концентрацией микроконидий 5-20 млн/см3, которую вводят внутримышечно двукратно в объеме 1 см. В качестве контроля для вакцинации кроликов используют известную вакцину из штамма Тrichophyton mentagophytes N 135 (ТМ-135). Через 30 дней кроликов заражают накожно вирулентными культурами штаммов Тr. mentagrophytes ТМ-251 и ТМ-18. В течение 25 дней учитывают результаты заражения.
Результаты экспериментального заражения представлены в табл. 1.
Из табл. 1 видно, что вакцина из штамма Тr. mentagrophytes ВГНКИ N 27 превосходит по иммуногенной активности известную из штамма Тr. mentagrophytes N 135 и создает у кроликов при концентрации микроконидий 10-20 млн/см3 напряженный иммунитет. Все контрольные кролики, неиммунизированные, заболели.
П р и м е р 3. Приготовленную по примеру 1 вакцину против трихофитии животных из штамма Тr. mentagrophytes ВГНКИ N 27 (ТМ-27) с концентрацией микроконидий 20 млн/см3 используют для иммунизации телят. Вакцину животным 1-2-месячного возраста применяют внутримышечно двукратно в дозе 2 см3. В качестве контроля испытывают аналогично известную вакцину из штамма Тr. mentagrophytes N 135 (ТМ-135). Через 35 дней после второй иммунизации телят заражают вирулентными культурами. Тr. mentagrophytes N 251 (ТМ-251) и Тr. sarkisovii N 724 (ТС-724).
Результаты экспериментального заражения телят представлены в табл. 2.
Из табл. 2 следует что вакцина из штамма Тr. mentagrophytes ВГНКИ N 27 индуцирует у телят образование надежного иммунитета.
П р и м е р 4. Для иммунизации телят 1-2-месячного возраста используют вакцину из штамма Тr. mentagrophytes ВГНКИ N 27 с концентрацией микроконидий 10 млн/см3, которую вводят животным внутримышечно двукратно в дозе 2 см3. Аналогично примеру 3 проводят заражение животных культурами вирулентных штаммов. Через 3, 6, 9 и 12 месяцев после иммунизации все животные не заболели, что говорит об эффективности используемой дозы при концентрации микроконидий 10 млн/см3. Проведенные испытания показали, что полученный штамм Тrichophyton mentagrophytes ВГНКИ N 27 обладает высокоиммуногенной активностью, стабильностью, низкой остаточной вирулентностью, что позволяет рекомендовать его для изготовления эффективного биопрепарата против трихофитии животных.
Экономический эффект от использования штамма для получения вакцины против трихофитии животных будет складываться за счет повышения эффективности вакцины, снижения затрат на проведение профилактических мероприятий.
Использование: биотехнология, штамм Trichophyton mentagrophytes, вакцина против трихофитии животных. Сущность изобретения: получен новый штамм Trichophyton mentagrophytes N 27, обладающий высоким уровнем спорогенеза, однородностью состава популяции, низкой остаточной вирулентностью и тем самым повышающий иммуногенную активность биопрепарата против трихофитии животных. Штамм Tr. mentagrophytes депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветеринарных препаратов под N 27. Вакцина, изготовленная из шт. Tr. mentagrophytes N 27 обеспечивает крупно рогатому скоту, овцам, козам и кроликам образование стойкого напряженного иммунитета спустя 20 - 30 дн. после применения. Продолжительность иммунитета не менее 5 лет. 2 табл.
Штамм гриба Trichophyton mentagrophytes ВГНКИ N 27-ДЕП, используемый для изготовления вакцины против трихофитии животных.
