СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ДЕРМАТОФИТОЗОВ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2020 года по МПК A61K9/10 A61K36/06 A61P17/00 A61P31/10 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к способам изготовления вакцин против дерматофитозов животных.

Изобретение касается ветеринарной микологии, в частности профилактики и лечения дерматофитозов животных, хотя опосредовано способствует предупреждению распространения их среди человека, так как дерматофитозы принадлежат к группе зооантропонозных инфекций, поражающих как животных, так и человека. Дерматофитозы широко распространены на всех континентах и имеют огромное социальное значение, поэтому изыскание способов получения недорогих, эффективных и безопасных для человека и животных вакцин против этих инфекций актуально.

На данный момент из уровня техники известны способы изготовления вакцин против дерматофитозов животных.

Известен способ изготовления вакцины против микроспории восприимчивых животных, включающий посев и выращивание культуры гриба штамма Microsporum canis ВИЭВ 473 и приготовление гомогената с концентрацией 20-50 млн микроконидий в 1 мл, 4-6%-ного солевого раствора натрий хлор с последующим добавлением гидроокиси алюминия из расчета 0,5 мл на каждые 100 мл вакцины (RU 2084241 С1,20.07.1997).

Известен также способ изготовления вакцины для профилактики дерматофитозов домашних и лабораторных животных, включающий использование в качестве штаммов вирулентных культур грибов вида Т. mentagrophytes, M. canis, М. qypseum, раздельное выращивание культур, получение гомогенатов и смешивание их в равных объемах, дополнительное инактивирование полученной смеси 0,5-0,6-ным раствором формалина в течение 3-4 дней при температуре 37-38°С и добавление 0,8-0,9%-ного раствора иммуномодулятора нуклеината натрия в количестве 1:1, расфасовку, замораживание в течение 10-15 часов, высушивание в сублимационной установке в течение 32-36 часов.

Для профилактической цели используют вакцину против дерматофитов, ресуспензированную в 1,9-2,1 мл физиологического раствора, которую вводят лабораторным животным - собакам и кошкам, независимо от возраста в области бедренной группы мышц двукратно с интервалом 10-14 дней в дозах - 0,9-1,2 мл (200-250 млн микроконидий) (SU 1734762 А1, 23.05.1992).

Известен способ изготовления вакцины для профилактики и лечения дерматофитозов домашних и лабораторных животных (патент RU 2192885, 2001) - ближайший аналог. Указанный способ включает посев и раздельное выращивание культур грибов Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes, приготовление гомогенатов и смешивание их в соотношении 1: 1: 2, добавление иммуномодулятора Риботан и инактиватора-формалина, а учет результатов проводят по количеству элементов грибов: мицелия, макроконидий, артроспор, хламидоспор, микроконидий и вакцину считают иммуногенной при общем содержании 25-50 млн элементов грибов в 1 мл. (RU 2192885 С2, 20.11.2002). Вакцина, полученная указанным способом, вызывает гиперреакцию у ряда вакцинированных животных.

Целью заявленного изобретения является разработка способа изготовления инактивированной вакцины против дерматофитозов животных с высокой иммуногенностью и низкой реактогенностью, пониженным содержанием концентрации грибных клеток в 1 мл вакцины, стабильными физико-химическими и биологическими свойствами, и не нагруженной посторонними компонентами, в частности иммуномодулирующими веществами.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение иммуногенности и снижение реактогенности инактивированной вакцины против дерматофитозов животных, полученной заявленным способом, обладающей стабильными физико-химическими и биологическими свойствами, пониженным содержанием концентрации грибных клеток в 1 мл вакцины, ненагруженной посторонними компанентами, в частности иммуномодулирующими веществами.

Предложенный способ изготовления инактивированной вакцины против дерматофитозов животных, заключается в следующем.

Осуществляют посев и раздельное выращивание в течение 21-23 суток культур грибов Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes на полужидкой питательной среде сусло-агаре с содержанием агара от 0,5 до 1,5%, при температуре 26-28°С. Затем готовят суспензии из выращенных культур в стабильном забуференном физиологическом растворе с рН 7,0-7,6, добавляют в каждую полученную суспензию клеток гриба 0,5% официнального 40%-ного раствора формалина, определяют количество элементов гриба - микроконидий, макроконидий, фрагментов мицелия и других клеток дерматофитов, подтитровывают забуференным физиологическим раствором концентрацию элементов гриба в каждой суспензии до 20-50 млн в 1 мл, смешивают суспензии Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes в соотношении 2:1:2, соответственно, с концентрацией 0,5% официнального 40%-ного раствора формалина, подсчитывают количество элементов грибов - микроконидий, макроконидий, мицелия, артроспор, хламидоспор в 1 мл суспензии. После этого двукратно отмывают в двух объемах забуференного физиологического раствора с рН 7,0-7,6 с содержанием 0,2% официнального 40%-ного раствора формалина. Вакцину считают иммуногенной при общем содержании 20-50 млн элементов грибов в 1 мл.

Способ обеспечивает получение иммуногенной вакцины, со стабильными физико-химическими и биологическими свойствами в течение всего срока годности препарата, низкой реактогенностью и сниженной концентрацией грибных клеток в 1 мл вакцины. При правильном использовании, согласно инструкции по применению, вакцина не вызывает отрицательной реакции со стороны организма и вырабатывает иммунитет на срок не менее 12 месяцев.

Заявленная совокупность существенных признаков обеспечивает достижение неожиданного технического результата. Срок сохранения высокой иммуногенной активности вакцины вакдерм, полученной заявленным способом, неожиданно увеличился по сравнению с ближайшим аналогом с 12 до 18 месяцев, что позволяет применять ее для иммунизации животных на 6 месяцев дольше. Срок годности вакцины, полученной заявленным способом, расфасованной во флаконы в асептических условиях и герметично укупоренной составляет не менее 18-месяцев.

Пример 1. Культуры штаммов Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes раздельно выращивают в течение 21-23 суток на полужидкой среде - сусло-сусло-агаре с содержанием агара от 0,5 до 1,5%, при температуре 26-28°С. Затем скребком снимают грибную массу с поверхности питательной среды, раздельно размалывают в гомогенизаторах и добавляют по 300-500 мл стерильного забуференного физиологического раствора (рН 7,0-7,6) из расчета размола 4-7 матрасов в 1 гомогенизаторе с рабочим объемом стакана не менее 1,5-2,0 литра.

Затем в каждую полученную суспензию клеток гриба добавляют 0,5% официнального 40% раствора формалина, определяют количество элементов гриба (микроконидии, макроконидии, фрагменты мицелия и других клеток дерматофитов). Далее забуференным физиологическим раствором подтитровывают концентрацию элементов гриба в каждой суспензии до концентраций клеток гриба 50 млн в 1 мл, затем смешивают в соотношении: - 2 часть M. canis - 1 часть M. qypseum - 2 части T. mentagrophytes. Затем двукратно отмывают в двух объемах забуференного физиологического раствора с рН 7,0-7,6 с содержанием 0,2% официнального 40% раствора формалина. В полученной таким образом вакцине вакдерм проверяют внешний вид, наличие посторонних механических примесей и других посторонних включений, стерильность, количество грибных элементов в 1 мл, безвредность и реактогенность на кроликах и/или собаках, иммуногенную активность путем внутримышечного введения животным 0,5-1,0 мл вакцины, что не вызывает отрицательной реакции со стороны организма и вырабатывает иммунитет не менее 12 месяцев.

Пример 2. Для изготовления 1 л вакцины берут 375 мл суспензии культуры M. canis с содержанием 50 млн элементов гриба в 1 мл и 0,2% официнального 40% раствора формалина. Далее берут 250 мл суспензии культуры M. qypseum с содержанием 50 млн элементов гриба в 1 мл и добавляют 0,2% формалина. Затем берут 375 мл суспензии культуры T. mentagrophytes с содержанием 50 млн элементов гриба в 1 мл и добавляют 0,2% официнального 40% раствора формалина. Далее двукратно в двух объемах забуференного физиологического раствора с рН 7,0-7,6 отмывают вакцину.

В полученной таким образом вакцине проверяют внешний вид, наличие посторонних механических примесей и других посторонних включений, стерильность, количество грибных элементов в 1 см3, безвредность и реактогенность на кроликах или собаках, иммуногенную активность путем внутримышечного введения животным 0,5-1,0 мл вакцины, что не вызывает отрицательной реакции со стороны организма и вырабатывает иммунитет не менее 12 месяцев.

Пример 3. На 1 л вакцины берут 250 мл суспензии культуры M. canis с добавлением 0,3% официнального 40% раствора формалина с концентрацией клеток 50 млн в 1 мл, добавляют 250 мл суспензии культуры M. qypseum с 0,3% официнального 40% раствора формалина с концентрацией элементов гриба 50 млн в 1 мл и далее берут 500 мл суспензии культуры Т. mentagrophytes с добавлением 0,3% официнального 40% раствора формалина. После смешивания суспензий между собой и отмывки ее в забуференном физиологическом растворе у полученной вакцины, аналогично вышеописанному Примеру 1, проверяли внешний вид, наличие посторонних механических примесей и других посторонних включений, стерильность, количество грибных элементов в 1 см3, безвредность и реактогенность на кроликах или собаках, иммуногенную активность путем внутримышечного введения животным 0,5-1,0 мл вакцины, что не вызывает отрицательной реакции со стороны организма и вырабатывает иммунитет не менее 12 месяцев.

Пример 4. На 1 л вакцины брали по 250 мл. суспензии культур M.canis и M.qypseum с концентрацией в каждой из них по 20 млн элементов гриба в 1 мл с 0,2% официнального 40% раствора формалина и добавляли к ним 500 мл. суспензии культуры Т. mentagrophytes с концентрацией 20 млн/мл элементов гриба, с предварительным добавлением в него 0,2% официнального 40% раствора формалина и отмывкой ее в забуференном физиологическом растворе.

Пример 5. На 1 л вакцины брали суспензии культур Microsporum canis 400 мл, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes в соотношении 2:1:2 (200 мл и 400 мл) с концентрацией в них по 20 млн элементов гриба в 1 мл и добавляли 0,3% официнального 40% раствора формалина.

Пример 6. На 1 л вакцины суспензии культур Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes брали в соотношении 2:1:2 с концентрацией в них по 35 млн элементов гриба в 1 мл и с добавлением 0,25% официнального 40% раствора формалина.

Во всех примерах в образцах полученных вакцин проверяют внешний вид, наличие посторонних механических примесей и других посторонних включений, стерильность, количество грибных элементов в 1 мл, безвредность и реактогенность на кроликах и/или собаках, иммуногенную активность путем внутримышечного введения животным 0,5-1,0 мл вакцины, как описано в Примере 1.

Увеличение концентрации элементов гриба в 1 мл свыше 50 млн ведет к появлению реактогенности вакцины, а уменьшение концентрации менее 20 млн элементов гриба в 1 мл снижает ее иммуногенность, поэтому оптимальными иммуногенными дозами вакцины является концентрация элементов гриба 20-50 млн в 1 мл.

С профилактической целью вакцину вакдерм вводят внутримышечно, двукратно с интервалом 10-14 суток в дозах 0,5-0,6 (10-25 млн элементов грибов) собакам весом до 5 кг, котятам от 1 до 3 месячного возраста, щенкам пушных зверей и кроликам от 1 до 2-месячного возраста и 1,0-1,2 мл (20,0 млн - 50,0 млн элементов грибов) собакам весом более 5 кг, кошкам, старше 3 месячного возраста, пушным зверям и кроликам старше 2-месячного возраста.

При заболевании дерматофитозами (микроспорией или трихофитией) вакцины применяют внутримышечно трехкратно с интервалом 10-14 суток между введениями в тех же дозах, что и для профилактики - 0,5-0,6 -1,0-1,2 мл.

Пример 7. 5 собак весом до 5 кг, 3 котенка 1-3 месячного возраста, 12 щенков пушных зверей (5 щенков лисы и 7 щенков песца) и 7 кроликов 30-дневного возраста прививали двукратно, внутримышечно с интервалом 10 суток, в дозе 0,5 мл, с содержанием элементов гриба в 0,5 мл вакцины 10 млн. Иммунологическую перестройку организма определяли при исследовании сыворотки крови в РМА спустя 21 день после 2-й вакцинации. Полученные титры антител (AT) и AT JgG, выраженные в логарифмах, составляли 6,47 и 5,32 соответственно, тогда как у тех же животных до иммунизации эти показатели составляли AT - 2,54 и AT JgG - 0,92.

Напряженность иммунитета определяли методом прямого заражения иммунных (опытная группа) и интактных (контрольная группа) животных вирулентными штаммами грибов М. canis, M. qypseum и T. mentagrophytes. Заражение проводили через 30 дней после второй иммунизации. После инфицирования за животными опытной и контрольной групп вели ежедневное наблюдение. При наблюдении за опытными животными (вакцинированными) клинических признаков заболевания не обнаружено, что подтверждено микологическими исследованиями проб материала с места заражения.

3 собаки, 2 котенка и 6 щенков пушных зверей (3 лисицы и 3 песца) и 3 кролика, не вакцинированные против дерматофитозов (контрольная группа), зараженными вирулентными культурами M. canis, M. qypseum, T. mentagrophytes идентичными заражающими дозах, заболели как микроспорией, так и трихофитией с проявлением ярко-выраженных клинических признаков дерматофитозов.

Пример 8. 6 собак весом более 5 кг, 4 кошки старше 3-х месячного возраста, 9 голов пушных зверей и 7 кроликов старше 3-месячного возраста двукратно вакцинировали вакциной вакдерм, полученной заявленным способом, с профилактической целью в дозе 1,0 мл с содержанием элементов гриба 50 млн в 1 мл. Исследование сыворотки крови через 21 день после второй вакцинации в РМА показало наличие титра AT - 7,62 и AT JgG - 5,55. Накожное заражения иммунизированных животных (опытная группа) вирулентными культурами грибов М. canis, M. gypseum, T. mentagrophytes показало высокую степень защиты организма иммунных животных. Клинические признаки дерматофитозов у таких животных отсутствовали.

Животные же контрольной группы (не вакцинированные против дерматофитозов) и зараженные вирулентными культурами М. canis, M. qypseum и T. mentagrophytes заболели дерматофитозами с характерными признаками классической экспериментальной микроспории и трихофитии.

Пример 9. Лечебный эффект вакцины вакдерм, полученной заявленным способом, проверяли на 5 щенках лисицы, 7 щенках песца, 5 кроликах и 4 собаках весом до 5 кг, 7 котятах 3-8-месячного возраста больных дерматофитозами. С этой целью животных вакцинировали вакциной трехкратно, внутримышечно, в дозах 0,6-0,8 мл с содержанием 10-12,5 млн элементов грибов. При обследовании всех животных на 10-12 сутки после последней вакцинации животные были здоровыми. На месте образования микотических участков, характеризующих специфичность поражений, где ранее были сформированы корки и чешуйки, наблюдали гладкую ровную поверхность без признаков микотического воспаления и активный рост молодого волоса. Микологические анализы проб материала с участков инфицирования были отрицательны. В контрольной группе животных 3 щенка лисицы, 4 щенка песца, 3 кролика, 4 котенка и 3 собаки, больные дерматофитозами и не подвергавшиеся вакцинотерапии, продолжали болеть. Микологические анализы проб материала с участков инфицирования во всех случаях были положительными.

Пример 10. Проводя лечение 5 лисиц, 2 песцов, 3 кроликов старше 4-месячного возраста, кошек 1-3-х летнего возраста и 5 собак весом более 5 кг против дерматофитозов, вакцину вводили трехкратно внутримышечно с интервалом 10-14 суток в дозе 1,0 мл с содержанием 50 млн элементов гриба. Спустя 7-10 суток после третьей вакцинации все животные выздоровели. К этому моменту у всех животных, подвергавшихся лечению, клинические признаки заболевания уже отсутствовали, наблюдали активный рост молодого волоса.

Животные контрольной группы (3 лисы, 2 песца, 3 кролика, 4 собаки, 2 кошки) больные дерматофитозами и не подвергавшиеся вакцинотерапии, к этому времени продолжали болеть.

Пример 11. 3 собаки весом до 5 кг, 2 котенка 1-3 месячного возраста, 4 щенка пушных зверей (2 щенка лисы и 2 щенка песца) и 3 кролика 30-дневного возраста прививали вакциной вакдерм двукратно, внутримышечно с интервалом 12 суток, в дозе 0,5 мл, с содержанием 10 млн элементов грибов в 0,5 мл вакцины. Для иммунизации использовали вакцину, хранившуюся в условиях холодильника 18 месяцев. Напряженность иммунитета определяли методом накожного заражения иммунных (опытная группа) и интактных (контрольная группа) животных вирулентными штаммами грибов М. canis, M. qypseum и T. mentagrophytes. После второй иммунизации, через 30 суток, провели заражение животных опытной и контрольной групп. После инфицирования за всеми животными, находящимися в опыте, вели ежедневное наблюдение. Клинических признаков экспериментальных дерматофитозов у вакцинированных животных обнаружено не было, что подтверждено микологическими исследованиями проб материала с места заражения.

2 собаки, 3 котенка и 5 щенков пушных зверей (2 лисицы и 3 песца) и 2 кролика, ранее не вакцинированные против дерматофитозов (контрольная группа животных), зараженные вирулентными культурами M. canis, M. qypseum, T. mentagrophytes, в тех же дозах, что и животные опытной группы, заболели и микроспорией, и трихофитией с проявлением характерных клинических признаков дерматофитозов. Диагноз был подтвержден микологическими методами исследования. Из образцов проб патологического материала были выделены ретрокультуры заражающих штаммов.

Пример 12. 3 собаки весом более 5 кг, 2 кошки старше 3-х месячного возраста, 5 голов пушных зверей (2 лисицы, 3 песца) и 3 кролика старше 3-месячного возраста двукратно вакцинировали вакциной, полученной заявленным способом и хранившейся 18 месяцев в условиях холодильника, с профилактической целью в дозе 1,0 мл с содержанием элементов гриба 20 млн в 1 мл. Накожное заражения иммунизированных животных опытной группы вирулентными культурами грибов М. canis, M. gypseum, T. mentagrophytes показало достаточную степень защиты организма иммунных животных. После контрольного заражения вакцинированных животных, клинических признаков микроспории и трихофитии у них обнаружено не было. Животные же контрольной группы (не вакцинированные вакциной) и зараженные вирулентными культурами М. canis, M. qypseum и T. mentagrophytes заболели дерматофитозами с явными признаками микроспории и трихофитии. Диагноз был подтвержден методами микологического исследования проб, отобранных с микотических очагов.

Пример 13. Терапевтическую эффективность вакцины, хранившейся в течение 18 месяцев в условиях холодильника, проверяли на пушных зверях (3 лисицы, 3 песца), 3 кроликах, 4 кошках и 3 собаках. Для этого животных опытной группы, больных микроспорией и трихофитией, с лечебной целью 3 кратно вакцинировали вакциной внутримышечно с интервалом между инъекциями 13 суток, в дозах 0,6-0,8 и 1.0-1.2 мл с содержанием элементов гриба 10-12,5 и 20-50 млн, соответственно. По истечении 10-25 суток после последней лечебной иммунизации проводили клиническое обследование всех подопытных животных, в результате чего установлено, что все животные выздоровели. Результаты микологических исследований были отрицательными.

Полученная предложенным способом инактивированная вакцина вакдерм против дерматофитозов животных при введении в организм формирует напряженный продолжительный иммунитет против дерматофитозов. Срок годности вакцины увеличен до 18 месяцев. Вакцина, полученная предложенным способом, апробирована с положительным результатом в широкой производственной практике и в ряде хозяйств, она найдет применение в пушном звероводстве, собаководстве и частном секторе для борьбы с дерматофитозами кошек, собак и других видов восприимчивых животных.

Изобретение относится к области ветеринарии и фармацевтики, а именно к способу изготовления инактивированной вакцины против дерматофитозов животных, согласно которому осуществляют посев и раздельное выращивание культур грибов Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes, готовят суспензии из выращенных культур, подтитровывают концентрацию элементов гриба в каждой суспензии до 20-50 млн в 1 мл, получая суспензии с одинаковым содержанием элементов грибов, смешивают суспензии Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes в объемном соотношении 2:1:2, двукратно отмывают, вакцину считают иммуногенной при общем содержании 20-50 млн элементов грибов в 1 мл. Технический результат заключается в стабильности и повышении иммуногенности инактивированной вакцины против дерматофитозов животных, полученной заявленным способом без использования дополнительных компонентов, таких как иммуномодулирующие вещества. 13 пр.

Способ изготовления инактивированной вакцины против дерматофитозов животных, характеризующийся тем, что осуществляют посев и раздельное выращивание в течение 21-23 суток культур грибов Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes на полужидкой питательной среде сусло-агаре с содержанием агара от 0,5 до 1,5%, при температуре 26-28°С, готовят суспензии из выращенных культур в стабильном забуференном физиологическом растворе с рН 7,0-7,6, добавляют в каждую полученную суспензию клеток гриба 0,5% официнального 40%-ного раствора формалина, определяют количество элементов гриба - микроконидий, макроконидий, фрагментов мицелия и других клеток дерматофитов, подтитровывают забуференным физиологическим раствором концентрацию элементов гриба в каждой суспензии до 20-50 млн в 1 мл, получая суспензии с одинаковым содержанием элементов грибов, смешивают суспензии Microsporum canis, Microsporum qypseum, Trichophyton mentagrophytes в объемном соотношении 2:1:2 соответственно, подсчитывают количество элементов грибов - микроконидий, макроконидий, мицелия, артроспор, хламидоспор в 1 мл суспензии, двукратно отмывают в двух объемах забуференного физиологического раствора с рН 7,0-7,6 с содержанием 0,2% официнального 40%-ного раствора формалина, вакцину считают иммуногенной при общем содержании 20-50 млн элементов грибов в 1 мл.