Способ выращивания голубики узколистной (Vaccinium angustifolium Ait.) Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, лесного хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного биологического получения оздоровленного посадочного материала путем микроклонального размножения с целью биологического сохранения редких видов и последующей закладки ягодных плантаций.

Голубика узколистная (Vaccinium angustifolium Ait.) относится к группе низкорослых культивируемых голубик, которая успешно возделывается в Северной Америке и за счет своей зимостойкости (до -33 С) более пригодна для выращивания в условиях Нечерноземной зоны европейской части России по сравнению с голубикой высокорослой (Витковский В.Л. Плодовые растения мира. СПб: Лань, 2003. 592 с). Известны классические способы получения посадочного материала голубики узколистной: ее возможно размножать как семенами, так и вегетативно - одревесневшими и зелеными стеблевыми черенками, отрезками корневища, корневищными черенками, парциальными кустами. Недостатками этих способов являются: маленький выход посадочного материала, сезонность в работе (ограниченные сроки заготовки материала), необходимость поддержания в течение 4 недель высокой влажности для адаптации черенков, что приводит к увеличению затрат на получение большого объема посадочного материала и удорожанию технологии (Морозов О.В., Гордей Д.В. Биолого-технологические аспекты выращивания посадочного материала голубики узколистной (Vaccinium angustifolium Ait.) семенного происхождения в рулонах // Труды БГТУ. Минск, 2010. Вып. XVIII. С.96-100; Морозов О.В., Гордей Д.В. Способность голубики узколистной (Vaccinium angustifolium Ait.) к вегетативному и генеративному размножению при выращивании посадочного материала // Устойчивое управление лесами и рациональное использование: мат-лы Междунар. науч.-практ.конф. Минск: БГТУ, 2010. Кн. 2. С.440-443; Тяк Г.В., Курлович Л.Е, Макаров С.С. Размножение гибридных форм голубики узколистной одревесневшими черенками // Лесохозяйственная информация. 2022. №3. с. 95-104).

Однако для получения чистосортного и здорового посадочного материала, освобожденного от вирусной и грибной инфекции используется метод клонального микроразмножения растений в культуре in vitro, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество жизнеспособных растений, предназначенных как для садоводов, так и для промышленного выращивания (Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наукова думка, 1992. 232 с; Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-Пресс, 1999. 160 с; Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология и биоинженерия: учеб. М.: URSS, 2015. 715 с).

Известны питательные среды для клонального микроразмножения голубики высокорослой (патент BY 1533 C1, А01Н 4/00, 16.12.1996. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н., Трухан Н.В., Филипеня В.Л. Способ клонального микроразмножения Vaccinium corymbosum L.; патент BY 18431 C1, A01H 4/00, 30.08.2014. Кудряшова O.A., Волотович А.А., Герасимович Т.В. [и др.]. Способ введения сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. в культуру in vitro; патент BY 18521 C1, A01H 4/00, 30.08.2014. Кудряшова O.A., Волотович A.A., Герасимович Т.В. [и др.]. Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. с повышенным содержанием антоциановых пигментов; патент BY 18710 C1, А01Н 4/00, 30.10.2014. Кудряшова О.А., Волотович А.А., Герасимович Т.В. [и др.]. Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L.), черники обыкновенной (патент RU 2709175 C1, C12N 5/04, 16.12.2019. Березина Е.В., Агеева М.Н., Брилкина А.А. Способ культивирования каллусной ткани Vaccinium myrtillus L.), в состав которых в качестве стимуляторов для образования побегов и корней входят регуляторы роста цитокининовой, ауксиновой и фенольной природы. Однако в некоторых случаях наблюдается сильное каллусообразование, торможение процессов формирования и роста побегов и корней, а иногда - отмирание надземной системы. Также часто имеет место специфическая реакция растения на введение в состав среды тех или иных регуляторов роста в зависимости от вида и сорта, что приводит к наличию положительного эффекта только на какой-либо одной культуре или сорте. В свою очередь это способствует снижению ценности разработки и приводит к потере ее универсальности для других культур. При этом важным фактором являются морфогенетические особенности среди видов внутри рода Vaccinium при их размножении.

Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ клонального микроразмножения голубики узколистной с использованием модифицированной среды Woody Plant Medium (1980) с добавлением тидиазурона (Kaldmae Н., Starast М., Кагр К., Paal Т. Effect of Donor Plant Physiological Condition on In Vitro Establishment of Vaccinium angustifolium Shoot Explants // Acta Hortic. 2006 Vol.715. P. 433-438), однако к недостатку данного способа можно отнести недостаточно высокий коэффициент размножения на этапе пролиферации побегов. Кроме того, не создано способов повышения уровня укореняемости и развития корневой и надземной систем растений на этапе укоренения в культуре in vitro, а также адаптации растений-регенерантов после пересадки в условия ex vitro. Это приводит к снижению выхода посадочного материала и увеличению цепочки технологического цикла его производства.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы: повышение коэффициента размножения и процента укоренения микропобегов; снижение затрат на получение стандартного посадочного материала; увеличение урожайности.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении коэффициента размножения растений голубики узколистной при снижении трудозатрат на выращивание саженцев.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата: В способе выращивания голубики узколистной, включающем посадку экспланта на питательную среду, введение в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, в соответствии с предложенным техническим решением:

- экспланты стерилизуют в растворе дезинфицирующего средства Сульфохлорантин-Д 5% в течение 10 мин;

- в качестве источника углеводов в питательной среде используют сахар в количестве 25,0 г/л питательной среды;

- на этапе собственно микроразмножения в питательную среду WPM добавляют 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и гиббереллиновую кислоту в концентрации 0,1 мг/л;

- на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют индолилуксусную кислоту 0,5 мг/л и березовый уголь 8,0 г/л;

- на этапе адаптации растений in vitro к почвенным условиям ex vitro используют субстрат из смеси торфа верхового типа и сосновой коры с размером фракции 0,5-1,0 см в соотношении 3:1.

Преимущества предложенного способа, поясняющими сущность изобретения, представлены в таблицах 1-5.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа. Примеры конкретного выполнения.

Стерилизация растительного материала. Для стерилизации стеблей, почек, и других фрагментов растений, предназначенных для вычленения экспланта, применяют различные стерилизующие растворы: 5% перекиси водорода, 0,2% нитрата серебра, 5% дезинфицирующего средства Сульфохлорантин-Д, дезинфицирующего средства Белизна в разведении 1:3. Перед тем, как приступить к стерилизации стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, промывают бидистиллированной водой и отпускают на 5 секунд в абсолютный спирт, а затем на 5-15 минут -в основной стерилизующий раствор.

Этап введения в культуру in vitro. Свободный от вирусов посадочной материал для клонального микроразмножения растений можно получить методом культуры изолированных апикальных меристем, которые являются наиболее здоровой, свободной от вирусов частью растений и представляют собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мкр) и шириной 0,25 мм. На этапе введения в культуру эксплант помещают на модфицицрованную питательную среду Woody Plant Medium (WPM) (табл.1) с добавлением цитокинина 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л. Полученные из апикальных меристем растения-регенеранты размножают методом микрочеренкования.

В результате исследований выявлено, что на этапе введения в культуру in vitro голубики узколистной наиболее эффективными основным стерилизующим агентом оказалось дезинфицирующее средство Сульфохлорантин-Д 5% при экспозиции 10 минут, где выявлена максимальная жизнеспособность эксплантов (75%). Достаточно высокая жизнеспособность эксплантов голубики узколистной также выявлена при использовании нитрата серебра 0,2% при той же экспозиции (70%) (табл.2).

Клональное микроразмножение путем черенкования. При культивировании микрорастений на питательной среде с добавлением цитокинина 6-БАП происходит снятие апикального доминирования, что приводит к активации развития пазушных меристем, которые в дальнейшем развиваются в микропобеги. Полученные адвентивные микропобеги отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на новой питательной среде. Для увеличения коэффициента размножения применяют микрочеренкование - деление побегов на черенки, содержащих одну или две пазушные почки.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения голубики узколистной на микрочеренки с 2-3 междоузлиями и пересадить на питательную среду 1/2 WPM с добавлением цитокинина 6-БАП 0,5-1,0 мг/л, а также для лучшего побегообразования - гиббереллиновую кислоту (ГКЗ). Уровень рНкс1 среды должен быть 4,7…5,3. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, 16-часовой фотопериод, температура +25°С и влажность воздуха 70%. Культивирование проводят в течение 25-30 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Установлено, что на этапе собственно микроразмножения наибольшие значения суммарной длины микропобегов голубики узколистной (в среднем 45,3 см) выявлены на питательной среде WPM с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и гиббереллиновой кислоты 0,1 мг/л. и березового угля в количестве 8,0 г/л (табл.3).

Процесс корнеобразования in vitro. На данном этапе необходимо создать наиболее благоприятный состав питательной среды, обеспечивающий получение высокого процента укорененных микропобегов. Для этого на последнем этапе клонального микроразмножения уменьшают концентрацию минеральных солей, сахарозы, а также исключают из состава питательной среды цитокинины. Основным регуляторным фактором корнеобразования является присутствие в составе питательной среды ауксинов. Наиболее часто для этого используют ИМК или ИУК в концентрациях от 1,0 до 5,0 мг/л. Выбор гормона и его концентрации зависит от видовых и сортовых особенностей исследуемых растений. Укоренившиеся микропобеги высаживают в условия грунта для адаптации.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения на микрочеренки длиной 1,0-1,5 см с двумя междоузлиями, удаляя нижние листочки и пересадить их на питательную среду, содержащую ауксины ИМК или ИУК в концентрации 0,5-1,0 мг/л. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, фотопериод 16/8 ч, температура +25°С и относительная влажность воздуха 80%. Культивирование проводят в течение 30-50 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Отмечено, что на этапе укоренения микропобегов in vitro голубики узколистной наибольшие значения суммарной длины корней (17,6 см) отмечены на питательной среде WPM с добавлением ИУК в концентрации 0,5 мг/л (табл.4).

Адаптация растений in vitro к нестерильным условиям ex vitro. Для адаптации пробирочных растений в почвогрунт самым благоприятным временем года считается период со 2-й декады апреля. Тогда растения с хорошо развитой корневой системой с 2-3 листьями способны адаптироваться к условиям ex vitro. Почвенный субстрат предварительно проливают 5% раствором перманганата калия и оставляют на 14 суток в темном месте. Для лесных ягодных культур в качестве субстрата используют верховой или переходный торф и песок (3:1) и мульчируют сверху мхом сфагнумом, так как мох является хорошим антисептиком и влагоудержителем. Приготовленный субстрат раскладывают в кассеты или микропарники, в которые пересаживают растения in vitro. Температура должна быть +25°С, влажность - 80…90%. Для успешного и 100% приживаемости целесообразно использовать туманообразующую установку (как правило, используется в производственных масштабах). Для небольших партий растений целесообразно применять микропарники или использовать индивидуальное закрытие растений полиэтиленовыми стаканчиками на 14-20 суток, которые потом убирают. По мере роста растений, их пересаживают в более объемные емкости со свежим субстратом. Дальнейшее их выращивание проходит по принятой агротехнике для данного вида растения.

Растения in vitro с хорошо развитой корневой системой вынимают из пробирки пинцетом. Корни промывают в 1% раствором перманганата калия (слабо-розовый цвет) для того, чтобы впоследствии не развивалась патогенная микрофлора. Растения пересадить в кассеты с почвогрунтом, прижать почву и полить водой. После чего кассеты поставить в условия освещения (5000 лк). Каждый день необходимо опрыскивать растения водой в течение 1 недели. Через 10 суток провести первую ревизию растений.

Выявлено, что состав субстрата по-разному влиял на процент приживаемости, длину побегов и количество листьев голубики узколистной. Наилучший показатель приживаемости (100%) растений составил в варианте использования смеси торфа и сосновой коры (размер фракций - 0,5-1,0 см) в соотношении 3:1, тогда как на верховом торфе - 80% (табл.5).

Технико-экономические преимущества или иная эффективность изобретения по сравнению с прототипом. Данная технология получения посадочного материала голубики узколистной (Vaccinium angustifolium Ait.) может быть использована при массовом получении оздоровленного посадочного материала с последующей закладкой маточников, питомников и сортоучастков. Предложенный способ предусматривает использование в качестве эксплантов меристемы растений, которые пересаживаются на модифицированную питательную среду с добавлением сахара, березового угля, а также 6-БАП, ИУК и гиббереллиновой кислоты. Данный способ позволяет повысить коэффициент размножения растений голубики узколистной в 5 и более раз, ее адаптацию в нестерильных условиях с применением субстрата из смеси торфа и сосновой коры (3:1) - до 100%, а также снизить в 2 раза трудозатраты при выращивании саженцев голубики.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выращивания голубики узколистной. Способ включает посадку экспланта на питательную среду, введение экспланта в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, согласно изобретению экспланты стерилизуют в растворе дезинфицирующего средства Сульфохлорантин-Д 5% в течение 10 мин, в качестве источника углеводов в питательной среде используют сахар в количестве 25,0 г/л питательной среды, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и гиббереллиновую кислоту в концентрации 0,1 мг/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют индолилуксусную кислоту в концентрации 0,5 мг/л и березовый уголь в количестве 8,0 г/л, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси верхового торфа и сосновой коры в соотношении 3:1. Изобретение обеспечит повышение коэффициента размножения растений голубики узколистной при снижении трудозатрат на получение саженцев. 5 табл.

Способ выращивания голубики узколистной, включающий посадку экспланта на питательную среду, введение в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, отличающийся тем, что экспланты стерилизуют в растворе дезинфицирующего средства Сульфохлорантин-Д 5% в течение 10 мин, в качестве источника углеводов в питательной среде используют сахар в количестве 25,0 г/л питательной среды, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и гиббереллиновую кислоту в концентрации 0,1 мг/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют индолилуксусную кислоту в концентрации 0,5 мг/л и березовый уголь в количестве 8,0 г/л, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси верхового торфа и сосновой коры в соотношении 3:1.