СПОСОБ ОЦЕНКИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИСКУССТВЕННОГО СВЕТА НА СОСТОЯНИЕ ФАКТОРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2015 года по МПК A61B5/145 G01N33/49 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к оценке влияния искусственного освещения на состояние и функциональную активность факторов периферической крови, нейтрофилов и мононуклеаров половозрелых морских свинок, чувствительных к спектральным характеристикам, генерируемым люминесцентными и светодиодными лампами с цветовой температурой 4500 К в диапазоне длин волн 360-460 нм за различные временные промежутки и может быть использовано для оценки влияния искусственного света оптического диапазона, генерируемого светодиодами и люминесцентными лампами на ряд важнейших параметров системы гомеостаза чувствительных лабораторных животных, а именно на функциональную активность фагоцитов и мононуклеаров периферической крови с помощью модели лабораторных животных, поскольку при действии искусственного света с цветовой температурой 4500 К в диапазоне длин волн 360-460 нм, генерируемых люминесцентными лампами у лабораторных животных in vivo регистрируется изменение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и число мононуклеаров, в том числе отмечается повышение биоцидных возможностей нейтрофилов, регистрируемые в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) на 26%, увеличение количества мононуклеаров в периферической крови лабораторных животных на 20%. При действии светодиодных источников с аналогичными спектральными характеристиками не отмечается изменения функциональной активности факторов периферической крови морских свинок.

На сегодняшний момент для оценки влияния света, генерируемого искусственными источниками используется анализ функций зрительного анализатора, использование которого позволяет предложить решение ряда проблем гигиенического нормирования, связанных с использованием энергоэффективных осветительных приборов [Гусельников М.Э., 2008; Кучма В.Р. и соавт, 2013]. С обнаружением нового типа фоторецепторов в глазу и фотоакцепторов у нейтрофилов появилось понимание невизуального биологического влияния света на организм, происходящее с участием гормонов-меланина и меланопсина [Махмутхджаев А.Ш., 1999; Брейнард Г.К. и соавт, 2008]. При попадании света в клетки-рецепторы начинается химическая реакция с участием фотопигмента меланопсина, результатом которой является продукция электрических импульсов. В сетчатке глаза световые волны определенной длины волны превращаются в энергию нервного импульса, которая передается по зрительному нерву в верхнюю часть спинного и в затылочную долю головного мозга, влияя на основные центры управления организмом, расположенные в головном мозге, в том числе на деятельность врожденных иммунных механизмов регуляции, осуществляемых нейтрофилами - клетками, имеющими рецепторы к мелатонину и специфичными к восприятию кванта света [Беленичев И.Ф. и соавт, 2006; Долгушин И.И., 2001; Гизингер О.А. и соавт, 2013]. Предложенный в 2013 году способ оценки воздействия света, генерируемого светодиодными источниками на функции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови может быть использован для оценки влияния света, генерируемого светодиодными и иными искусственными источниками на клеточные факторы врожденного иммунитета [Гизингер О.А. и соавт, 2013]. Предлагаемый метод имеет некоторые недостатки, связанные с узким спектральным коридором чувствительности нейтрофилов, трудоемкостью технологий их выделения и поддержанию клеточных культур, требующих наличие реактивов импортного производства. Кроме того, нейтрофильные гранулоциты составляют не всю популяцию клеток крови, причем на долю мононуклеаров приходится 30-40% форменных элементов, что делает изучение их численности и динамики актуальным при рассмотрении возможных биологических эффектов действия искусственного света.

Используемый на сегодняшний день в качестве монометода способ оценки действия света на организм по оценке ответной реакции зрительного анализатора у человека имеет ряд недостатков [Кучма В.Р. и соавт., 2013]. В частности, главный недостаток метода -использование различных возрастных групп человеческой популяции, особенно детей в возрасте от 5 до 7 лет в качестве объектов исследования, сложности в получении добровольного информированного согласия от всех участников эксперимента, включая несовершеннолетних участников, решения, возможный дискомфорт участников исследования младших возрастных групп от действия искусственного света, генерируемого светодиодными и люминесцентными лампами, и его субъективная оценка у обследуемых при проведении эксперимента приводит к снижению валидности, сходимости и воспроизводимости получаемых результатов.

В.Н. Анисимовым предложена оценка действия искусственного света путем анализа биохимических показателей, позволяющая выявлять эндокринные нарушения, возникающие вследствие длительного воздействия искусственного света [Анисимов В.Н., 2008]. Недостаток метода - низкая чувствительность и специфичность метода, возникающая из-за возможных колебаний биохимических показателей вследствие действия не только экзогенных световых, но и возможных эндогенных реакций самого микроорганизма, сложности выбора критериев включения и исключения испытуемых из обследования, высокая стоимость химических реактивов, человеческих трудозатрат.

B.C. Кришталь в качестве одного из методов изучения действия света предложил проводить анализ умственной работоспособности и утомляемости, свето- и цветовосприятия с применением психологического тестирования. Недостаток метода - использование человека как объекта исследования, вытекающий из этой субъективной оценки действия света и односторонний подход к анализу, позволяющему установить лишь нервно-психическое состояние обследуемых на момент проведения исследования, не учитывая показателей нейроиммуноэндокринной регуляции [Кришталь B.C., 2005]. Вместе с тем, значения отдельно взятых параметров, полученных по результатам тестирования, анкетирования либо комплекса тестирование + анкетирование, не всегда отражают истинного состояния влияния света на все органы и системы человека, что связано с многообразием сопровождающих системные дисфункции нарушений.

Представлены литературные данные о прогнозировании риска возникновения патологии сердечно-сосудистой системы при действии освещения, генерируемого светодиодами или иными искусственными источниками освещения, по оценке степени вариабельности сердечного ритма и анализу вегетативного показателя ритма сердца [Кудряшов Е.А., 2008]. Использование данного метода может быть весьма востребовано в медицинских стационарах, оборудованных современными энергоэффективными искусственными приборами, однако имеет ограниченное применение, вследствие сложного дорогостоящего оборудования и обучения персонала и возможности его использования для проведения санитарно-эпидемиологического контроля биобезопасности действия искусственного света.

Существуют методы, позволяющие при помощи анкетирования оценить влияние света на психосоматическое состояние обследуемых, однако при их использовании также не исключено влияние субъективных эндогенных и экзогенных факторов (особенности хронотипа, состояния здоровья на момент проведения исследования), влияющих на получаемые результаты.

Поскольку значения, полученные при данных методах исследований могут содержать неточности, например при проведении анкетирования или анализе биохимических показателей крови, то наиболее точным отражением влияния действия света, генерируемого светодиодными носителями может стать изучение действия света на модели клеток, быстрореагирующих на различные экзогенные воздействия и имеющих фоторецепторы для квантов света - нейтрофильных гранулоцитов [Гизингер О.А., 2013, заявка на изобретение №2013142730 от 19.09.2013, заявка на изобретение №2013158668 от 26.12.2013] с учетом представленных в реферате недостатков метода, который и может быть принят за основу и взят за прототип.

В основу изобретения положена задача, заключающаяся в создании экспериментальной модели лабораторных животных- морских свинок, чувствительных к изучаемым спектральным характеристикам, делающей возможным дальнейшее проведение статистически грамотного анализа оценки действия света, генерируемого светодиодными или иными искусственными источниками на состояние и функциональную активность клеточных элементов периферической крови половозрелых морских свинок.

Указанная задача решается за счет того, что в предлагаемом способе биологическая оценка действия света, генерируемого светодиодными или иными искусственными источниками света, происходит с полноценным клиническим и функциональным результатом, исключая прямое участие исследуемых (человека) различных возрастных групп в качестве моделей для проведения эксперимента. Применение способа не требует дорогостоящей аппаратуры, дефицитных химических реактивов, доступен в практике научно-исследовательских лабораторий, имеющих условия для содержания лабораторных животных, особенно важен при оценке биобезопасности новых, внедряемых в цветосветовую среду лечебных учебных и иных социальных объектов источников, расширяет информацию о биологических эффектах света оптического диапазона.

Заявляемый способ позволяет объективно оценивать действия физических факторов на факторы гомеостаза макроорганизма с использованием моделей чувствительных лабораторных животных. Ранее такой анализ мог быть проведен с помощью анализа изолированных клеточных культур нейтрофильных гранулоцитов для оценки влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы периферической крови доноров и секретов урогенитального тракта в условиях эксперимента [Гизингер О.А. и соавт., 2009; 2013], без учета реакции мононуклеарных клеток.

Авторами впервые предложено использовать данный метод для изучения биологических эффектов влияния света, оптического диапазона, генерируемого светодиодными и иными искусственными источниками.

Для решения вышеуказанной задачи были исследованы три экспериментальные модели лабораторных животных (морских свинок). Использование данных животных определено их чувствительностью к действию света оптического диапазона. В зависимости от выбора источника света в первой модели на лабораторных животных действовали естественным светом в условиях нормального хроноритма (естественная смена дня и ночи),контрольная группа), Т=4500 К (белый свет), длина волны 360 нм; во второй модели на лабораторных животных действовали светом, генерируемым люминесцентными лампами Т=4500 К (белый свет), дина волны 360 нм; в третьей модели действовали светом, генерируемым светодиодными источниками Т=4500 К (белый свет), длина волны 360 нм. При проведении исследования учитывался состав, абсолютное и относительное содержание форменных элементов периферической крови лабораторных животных, их функциональная активность. Для проведения исследования были сформированы группы: группа 1 (контрольная) - животные находились при естественном освещении; группа 2 - на лабораторных животных воздействовали светом, генерируемым люминесцентными лампами; группа 3 - на лабораторных животных воздействовали светом, генерируемым светодиодами. Точками мониторинга показателей были 10 дней, 20 дней эксперимента. Опытные и контрольные группы животных во время облучения искусственным светом находились в специально оборудованных для проведения эксперимента помещениях. Действующее световое поле, с учетом показателей освещенности, было конфигурировано таким образом, чтобы в любой точке изучаемой поверхности отклонение плотности светового потока составляло не более 10% от заданных параметров. Полученные результаты были подвергнуты статистической с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки. О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали значимыми при р≤0,05.

Качественный анализ показал, что десятидневное воздействие света, генерируемого естественными источниками света на лабораторных животных в условиях естественного хронотипа не приводит к изменению абсолютного и относительного количества клеточных факторов периферической крови и их функциональной активности. Количественный состав лейкоцитов в периферической крови лабораторных животных, находящихся под действием светодиодных и люминесцентных источников света в течение 10 дней при условии отсутствия у животных десинхроноза показал наличие достоверных различий по содержанию форменных элементов: снижение палочкоядерных гранулоцитов на 26,6%, у животных, находящихся под действием люминесцентных ламп, снижение лимфоцитов на 10% у животных, находящихся под действием светодиодных ламп. Результаты влияния различных источников света на состав и функциональную активность клеточных факторов периферической крови морских свинок в условиях in vivo (10 дней воздействия искусственным светом) представлены в таблице 1.

Количественный состав лейкоцитов в периферической крови лабораторных животных, находящихся под действием светодиодных и люминесцентных источников света в течение 20 дней не выявил изменений по абсолютному содержанию и содержанию палочкоядерных нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов в группах животных, находящихся в условиях естественного (контроль) и светодиодного освещения (р₁>0,05). Абсолютное и относительное количество сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови лабораторных животных, находящихся под освещением люминесцентных ламп было повышено по сравнению с показателями животных, находящихся под действием светодиодного освещения и естественным освещением. Абсолютное содержание моноцитов в группе животных, находящихся при светодиодном освещении (5,63±0,41%) статистически значимо отличалось от показателей содержания моноцитов у животных из группы контроля (7,50±0,79%) и показателей у животных, находящихся в условиях люминесцентного освещения (7,75±2,42%), причем относительные показатели моноцитов у животных, находящихся под воздействием люминесцентных ламп в 3 раза превышали значения контрольной группы и группы животных, находящихся при светодиодном освещении (p₁<0,05, р₂<0,05). Результаты влияния различных источников света на клеточные факторы периферической крови в условиях in vivo (20 дней воздействия искусственным светом) представлены в таблице 2.

Анализ данных функциональной активности клеточных элементов периферической крови морских свинок, находящихся в условиях искусственного освещения в течение 10 суток выявил различия в показателях фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у животных, находящихся под действием естественного света, и у животных, находящихся под действием люминесцентных и светодиодных ламп (p_1,2<0,05). Установлено, что после воздействия света люминесцентных ламп в крови обследуемых животных увеличивалось количество активных нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте по сравнению с естественным освещением, и светодиодным освещением, усиливался их фагоцитоз. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном стимулирующем влиянии света, генерируемого люминесцентными лампами, тогда как лампы накаливания и светодиодные носители генерируют свет, не вызывающий выраженных иммунологических изменений в системе нейтрофильных гранулоцитов периферической крови лабораторных животных. Результаты представлены в таблице 3.

Таким образом, воздействие света, генерируемого люминесцентными и светодиодными лампами, в пределах световой температуры 4500 К, длине волны 360 нм в течение 10-20 суток приводит к статистически значимому изменению количества и функциональной активности клеточных элементов периферической крови лабораторных животных (морских свинок) по сравнению с естественным освещением, причем воздействие света люминесцентных ламп приводит к значительной активации кислородзависимого метаболизма и фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови морских свинок в условиях in vivo.

Применение способа оценки воздействия искусственного освещения на состояние и функциональную активность факторов периферической крови путем воздействия на половозрелых морских свинок, позволяет решить проблему лабораторного контроля эффективности и биобезопасности искусственных источников света, генерируемых люминесцентными лампами и светодиодами с привлечением в качестве модели чувствительных к изучаемым спектральным характеристикам лабораторных животных.

Предлагаемый способ отличается от существующих тем, что используя лабораторных животных (морских свинок), имеющих фоточувствительные рецепторы к изучаемым спектральным характеристикам искусственного света приобретается возможность более качественно, без использования человека как объекта при проведении исследований, в условиях in vivo оценить биологические эффекты влияния искусственных источников света на состояние базовых параметров гомеостаза макроорганизма, тем самым способствовать прогнозированию и исключению рисков, возникающих при планировании цветосветовой среды обитания человека и окружающих его биологических объектов. Ввиду корректности метода (уход от необходимости использования человека как объекта исследования), соблюдения правил обращения с животными, простоты выполнения манипуляций и дешевизны лабораторных методов исследования указанный способ оценки доступен большинству санитарно-гигиенических, иммунологических лабораторий, исследовательских институтов, занимающихся вопросами гигиенического нормирования искусственного света и имеющих разрешение на работу с лабораторными животными.

Заявляемый способ может найти широкое применение в иммунологии, при изучении иммунотропных или иммуносупрессивных эффектов при проведении санитано-гигиенической оценки освещенности жилых и промышленных объектов, что свидетельствует о его соответствии критерию "промышленная применимость".

Литература

1. Анисимов В.Н. Эпифиз, биоритмы и старение организма/ В.Н. Анисимов // Успехи физиологических наук. - 2008. - Т. 39. -№4. - С. 52-60.

2. Брейнард Г.К. Восприятие света как стимула незрительных реакций человека / Г.К. Брейнард, И. Провенсио // Светотехника.- 2008. -№1. - С. 6-12.

3. Биске К. Субъективные оценки цветопередачи в зависимости от спектра излучения источников света / К. Биске, К. Вандаал, К. Юнгнич // Светотехника.- 2007.- №5. - С. 14-17.

4. Гизингер О.А. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы периферической крови доноров в условиях эксперимента. / О.А. Гизингер, К.Г. Ишпахтина, О.Л. Колесников // Иммунология. - 2009. - Т. 30, №5. - С. 263-267.

5. Гизингер О.А. Исследовательские подходы в области безопасности освещения в условиях мегаполиса / О.А. Гизингер, М.В. Осиков, О. Р. Бокова, и др. // Полупроводниковая светотехника. - 2013. - Т. 1, №21. - С. 60-61.

6. Долгушин И.И. Нейтрофилы и гомеостаз. / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин; УрО РАН. -Екатеринбург, 2001. - 258 с.

7. Гигиенические характеристики энергосберегающих источников света [Электронный ресурс] / М.Э. Гусельников [и др.] // Энергетика: экология, надежность, безопасность: материалы докл. 14 Всерос. науч. - техн. конф., 9-11 дек. 2008 г., Томск - Томск, 2008. -Режим доступа: URL: http://www.lib.tpu.ru/fulltext/m/2009/ml9.pdf#page=204, (дата обращения 30.05.2013).

8. 3ак П.П. Потенциальная опасность освещения светодиодами для глаз детей и подростков. / П.П. Зак, М.А. Островский // Светотехника.- №3. -2012.- С. 125-134.

9. Кришталь B.C. Влияние цветности освещения на психофизиологическое состояние человека. / B.C. Кришталь, Ф.П. Говоров // Свiтлотехнiка та електроенергетика. - №5. -2005. - С. 20-24.

10. Кудряшов Е.А. Применение вариабельности сердечного ритма для оценки организма и прогноза заболеваний/ Е.А. Кудряшов, Л.М. Лавров //Нижегородский медицинский журнал. - №5. - 2008. - С. 52-60.

11. Кучма В.Р. Гигиенические основы использования светодиодов в системах искусственного освещения/В. Р. Кучма, Л.М. Текшева // М. - ФГБУ «Научный центр здоровья детей», РАМН, 2013. - 246 с.

12. Brainard G.C. Photoreception for regulation of melatonin and the circadian system in humans/ G.C. Brainard // Fifth International LRO Lighting research symposium, Orlando. 2002. - c. 23-26.

Изобретение относится к медицине, в частности к исследованиям функциональной активности факторов периферической крови при действии искусственного света. Для этого на половозрелых морских свинок воздействуют излучением оптического диапазона, генерируемых светодиодами или люминесцентными лампами с цветовой температурой 4500 К в диапазоне длин волн 360-460 нм в течение различных временных интервалов. При этом оценку воздействия производят по показателям функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и количества мононуклеарных клеток. Использование способа не требует дорогостоящей аппаратуры, дефицитных химических реактивов, особенно важен при оценке биобезопасности новых, внедряемых в цветосветовую среду искусственных источников света, расширяет информацию о биологических эффектах света оптического диапазона. 3 табл.

Способ оценки воздействия искусственного освещения на состояние и функциональную активность факторов периферической крови путем воздействия на половозрелых морских свинок как животных, чувствительных к изучаемым спектральным характеристикам, излучениями оптического диапазона, генерируемых светодиодами или люминесцентными лампами с цветовой температурой 4500 К в диапазоне длин волн 360-460 нм в течение различных временных интервалов, при этом оценку воздействия производят по показателям функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови и количества мононуклеарных клеток.