СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ, АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА И ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ Российский патент 2015 года по МПК A61K39/295 A61K39/02 A61K39/12 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся разработкой и конструированием вакцинных препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций (патент РФ на изобретение №2080875 от 18.03.92, МКИ А61 К39/125, 39/135). Данный способ получения поливалентной вакцины включает раздельное выращивание культур Salmonella typhi, Salmonella paratyphi В, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, отделение биомассы от питательной среды, экстракцию антигенов проводят водно-солевым раствором при птуттелировании в присутствии антибиотика и мелкораздробленного стекла в течение 1-1,5 ч, полученные экстракты центрифугируют, очистке подвергают супернатанты и после смешивания получают целевой продукт в виде смеси клеточных стенок, содержащих О-антигены используемых культур, со жгутиками, содержащими Н-антигены, и растворимыми Vi-антигенами сальмонелл. Технология получения данной вакцины очень сложная и для профилактики инфекционных болезней кроликов не рекомендуется.

Известен способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями (патент РФ на изобретение №2035189 от 02.01.86, МКИ А61К 39/125, 39/135). Данный способ включает раздельное выделение протективных антигенов, из штамма Staphylococcus aureus №Б - 243 выделяют цитоплазматический антиген, из токсинопродуцирующего штамма Pseudomonas aeruginosa НИИЭМ №PA - 7 получают анатоксин синегнойной палочки, из клинических штаммов Proteus mirabilis №6, 8, 40, 508, 1115, 4641 выделяют растворимые антигены путем контролируемого протеолиза, полученные антигены смешивают в физрастворе из расчета содержания их в 1 мл вакцины 0,15-0,2 мг белка, 15-30 мкг белка, 10-20 мкг белка соответственно и в смесь дополнительно добавляют коммерческий стафилококковый анатоксин и гидроокись алюминия в количестве 5-10 ЕС и 1-2 мг соответственно. Технология получения вакцины очень сложная, для профилактики кроликов не применяется.

Известен способ изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий (патент РФ №2388489, 10.05.2010), включающий проведение отбора пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Полученная вакцина не применяется для профилактики кроликов.

Известен способ изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (патент РФ на изобретение №2064304 от 27.07.96, МКИ А61 К 39/275). Данный способ предусматривает раздельное выращивание вакцинного вируса миксоматоза кроликов в культуре клеток куриных фибробластов с активностью не ниже 10^4,0 ИД₅₀/см³, замораживают-оттаивают, смешивают с инактивированной суспензией печени кроликов, зараженной вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, в соотношении 1:1, стабилизируют полученную смесь защитной средой при соотношении 10:1, фасуют и лиофилизируют после замораживания при минус 55±5°С в течение 10±2 ч путем выдерживания материала при температуре от минус 50±5°С до 0°С в течение 31±1 ч и затем от 0°С до плюс 20±1°С Па и досушивают в течение 3±1 ч. Данный способ позволяет получать бивалентную вакцину против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Технология получения данной вакцины очень сложная.

Техническим результатом изобретения является получение безвредной, специфичной, высокоиммуногенной ассоциированной вакцины для защиты кроликов против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни, путем введения новых инактивированных возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияние.

Технический результат достигается тем, что в способе изготовления вакцины, ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающем отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их псевдомонозом и вирусной геморрагической болезнью из местного эпизоотического очага, выделение чистых культур возбудителей болезней, для чего проводят раздельное выращивание культур Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов, далее для получения возбудителя псевдомоноза культуру Pseudomonas aeruginosa выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром не менее 4 млрд. микробных клеток в 1 см³ в течение 12-24 часов при температуре 37°С; для получения вируса геморрагической болезни кроликов заражают вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³, проводят отбор печени от павшего кролика, ее измельчение и гомогенизацию, доводят полученную массу физраствором до 10-15%-ной суспензии, затем проводят экстракцию вируса при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов, декантацию надосадочной жидкости, добавляют физраствор в соотношении 1:1, фильтруют, инактивируют культуры путем внесения формалина 0,1-0,4%-ной концентрации и выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов, после этого смешивают инактивированные культуры Pseudomonas aeruginosa и вирусной геморрагической болезни кроликов в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему смеси, тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их псевдомонозом и вирусной геморрагической болезнью из местного эпизоотического очага; раздельно выращивают культуры Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов; для получения возбудителя псевдомоноза культуру Pseudomonas aeruginosa выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром не менее 4 млрд. микробных клеток в 1 см³ в течение 12-24 часов при температуре 37°С, для получения вируса геморрагической болезни заражают вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³, проводят отбор печени от павшего кролика, которую после измельчения, гомогенизации экстрагируют вирус из 10-15%-ной суспензии печени при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов при периодическом перемешивании, а после инактивации формалином и выдержки инактивированные культуры Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов смешивают в равных соотношениях и вносят раствор гидроокиси алюминия.

Инактивируют культуры возбудителей формалином до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 48-96 часов и смешивают чистые культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ кроликов обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против двух инфекций.

Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, специфичной вакцины для защиты кроликов от псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: ассоциированная вакцина против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (СТО 00495549-0044-2007); ассоциированная вакцина против пастереллеза и вирусной геморрагической болезни кроликов (ТУ утверждены 30.09.94 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена 27.05.94 г.); вакцина против геморрагической болезни кроликов тканевая инактивированная гидроокись алюминиевая СТО 00495549-0005-2006.

Методы выделения и характеристика микроорганизмов рода Pseudomonas описаны в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии», авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр. 259-261; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных», авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., М.: «ИзограФъ», 2005, на стр. 522-525.

Методы выделения и характеристика вирусной геморрагической болезни кроликов описаны в «Методических указаниях по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов», утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 28.12.88; в книге «Вирусная геморрагическая болезнь кроликов», авторы: Шевченко А.А., Вишняков И.Ф., Бакулов И.А., Власова Т.А. М.: «Две Короны», 1995, 48 с.; в книге «Болезни кроликов», авторы: Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Литвинов A.M. М.: «Аквариум», 2002, стр. 42-57.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что сначала проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их псевдомонозом и вирусной геморрагической болезнью из местного эпизоотического очага. Затем выделяют чистые культуры возбудителей болезней, для чего проводят раздельное выращивание культур Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов. Далее для получения возбудителя псевдомоноза культуру Pseudomonas aeruginosa выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром не менее 4 млрд. микробных клеток в 1 см³ в течение 12-24 часов при температуре 37°С. Для получения вируса геморрагической болезни кроликов заражают вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³, проводят отбор печени от павшего кролика, ее измельчение и гомогенизацию, доводят полученную массу физраствором до 10-15%-ной суспензии. Затем проводят экстракцию вируса при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов, декантацию надосадочной жидкости, добавляют физраствор в соотношении 1:1, фильтруют. Инактивируют культуры путем внесения формалина 0,1-0,4%-ной концентрации и выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов. После этого смешивают инактивированные культуры Pseudomonas aeruginosa и вирусной геморрагической болезни кроликов в равных соотношениях. Затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему смеси, тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их псевдомонозом и вирусной геморрагической болезнью, из которых приготавливают суспензию и проводят лабораторные исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя псевдомоноза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа видны прямые или изогнутые палочки размером 1,5-3,0 мкм, располагающиеся одиночно, парами, в виде цепочек, окрашенные в розовый цвет, характерные для Pseudomonas aeruginosa.

Для определения культуральных свойств возбудителя псевдомоноза делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясопептонный бульон, в чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА), кровяной МПА и селективную среду, содержащую цетилтриметил аммония бромид, на которой другие псевдомонады не растут. Через 24 часа инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают поверхностную серебристо-белую пленку в МПБ, характерный признак и помутнение среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост сероватых, полупрозрачных колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Pseudomonas aeruginosa.

Для получения вирусного сырья при изготовлении вакцины используют не привитых против вирусной геморрагической болезни кроликов, массой не менее 1,5 кг, заражают их вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл³. Через 48-72 часа кролики погибают, от павших берут печень в целофановые пакеты, замораживают, измельчают ножницами и на гомогенизаторе. Полученное сырье доводят физраствором (рН 7,2) до 10-15%-ной суспензии, затем экстрагируют вирус при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов, периодически перемешивая, декантируют надосадочную жидкость, к осадку добавляют физраствор 1:1, перемешивают. Для освобождения от клеточного детрита проводили фильтрование через два слоя стерильной марли. Затем отфильтрованное биосырье сливают в емкость и проводят инактивацию внесением формалина 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов при периодическом перемешивании, затем смешивают инактивированные антигены в равных соотношениях, вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов чистых культур возбудителей Pseudomonas aeruginosa и вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих двух опасных инфекционных болезней псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Раздельное выращивание возбудителей позволяет получать концентрацию Pseudomonas aeruginosa не менее 4 млрд. в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования и вируса геморрагической болезни кроликов с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл³. Использование формалина для инактивации в 0,1-0,4%-ной конечной концентрации позволяет в течение 48-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения.

Вакцина, полученная заявляемым способом, прошла апробацию. Кроликам вводили однократно в дозе 1 см³ полученную вакцину, и через 12-15 суток у привитых кроликов формирование напряженного иммунитета против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения кроликам внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Изобретение касается способа изготовления вакцины, ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Охарактеризованный способ включает отбор пораженных органов от павших кроликов в период их заболевания из местного эпизоотического очага, выделение чистых культур возбудителей болезней, для чего проводят раздельное выращивание культур Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов. Для получения возбудителя псевдомоноза культуру Pseudomonas aeruginosa выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы. Для получения вируса геморрагической болезни кроликов заражают вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов с инфекционной активностью не менее 10³ ЛД 50/см³. Проводят отбор печени от павшего кролика, ее измельчение и гомогенизацию. Смешивают инактивированные культуры Pseudomonas aeruginosa и вирусной геморрагической болезни кроликов в равных соотношениях. Вносят раствор гидроокиси алюминия, перемешивают, фасуют и укупоривают. Представленное изобретение позволяет изготовить безвредную, высокоиммуногенную вакцину, стабильную при хранении. 1 табл.

Способ изготовления вакцины, ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их псевдомонозом и вирусной геморрагической болезнью из местного эпизоотического очага, выделение чистых культур возбудителей болезней, для чего проводят раздельное выращивание культур Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов, далее для получения возбудителя псевдомоноза культуру Pseudomonas aeruginosa выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром не менее 4 млрд. микробных клеток в 1 см³ в течение 12-24 часов при температуре 37°С; для получения вируса геморрагической болезни кроликов заражают вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³, проводят отбор печени от павшего кролика, ее измельчение и гомогенизацию, доводят полученную массу физраствором до 10-15%-ной суспензии, затем проводят экстракцию вируса при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов, декантацию надосадочной жидкости, добавляют физраствор в соотношении 1:1, фильтруют, инактивируют культуры путем внесения формалина 0,1-0,4%-ной концентрации и выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов, после этого смешивают инактивированные культуры Pseudomonas aeruginosa и вирусной геморрагической болезни кроликов в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему смеси, тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.