СИСТЕМА ФОРМИРОВАНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ ОБРАЗЦА И СПОСОБ ПЕРЕДАЧИ ИЗОБРАЖЕНИЯ КЛЕТОК ИЛИ ТКАНЕЙ, РАСПОЛОЖЕННЫХ В КУЛЬТИВАЦИОННОЙ КАМЕРЕ, К СРЕДСТВАМ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ Российский патент 2014 года по МПК G02B21/36 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к системе формирования изображения образца и к способу передачи изображения клеток или тканей, расположенных в культивационной камере, к средствам обработки данных.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Культивирование клеток или тканей часто бывает необходимым для биологических, биотехнологических или медицинских процедур или экспериментов. Термин «клетки или ткани» в контексте настоящего изобретения обозначает живой биологический материал, состоящий из одной или более клеток, включая эмбрионы. Хотя в некоторых случаях культивирование может быть осуществлено при комнатной температуре, при нормальных влажностных условиях и при составе газа, идентичном составу нормального атмосферного воздуха, часто клетки или ткани необходимо помещать в инкубатор, где образец выдерживают при предварительно заданной температуре и/или в искусственной среде с предварительно заданной влажностью и/или составом газа (например, с определенным содержанием CO₂, O₂ и/или N₂) в течение всего периода культивирования. В эмбриологических лабораториях или лабораториях искусственного оплодотворения оплодотворенные ооциты и эмбрионы, которые развиваются после дробления оплодотворенных ооцитов, культивируют, например, при постоянной температуре, равной примерно 37°C, при содержании CO₂, равном примерно 5-6%, и при относительной влажности воздуха, равной примерно 90%, в течение периода от 1 до 9 дней. Для других клеток или тканей могут быть необходимы другие условия окружающей среды, обеспечиваемые инкубатором.

Визуальная инспекция клеток или тканей может быть необходимой не только в конце запланированного периода культивирования, но и в некоторых случаях - во время периода культивирования. Наблюдение за динамикой развития эмбриона имеет большое значение для оценки, например, жизнеспособности эмбрионов. Извлечение клеток или тканей из инкубатора для повторных наблюдений является таким сильным стрессом для клеток или тканей, что может задержать их развитие или даже привести к их гибели. Этот стресс вызван, с одной стороны, извлечением клеток или тканей из искусственной среды на время наблюдения, а с другой стороны, само перемещение клеток или тканей является для них неблагоприятным воздействием. Поэтому был разработан ряд систем формирования изображения образцов для многократного захвата изображений клеток или тканей во время периода культивирования, которые не требуют извлечения клеток или тканей из инкубатора и позволяют пользователю получать информацию о процессе культивирования посредством визуальной инспекции полученных изображений или посредством обработки и анализа полученной из этих изображений информации.

В публикации ЕР 1548488 А1 (Tokai Hit Co. Ltd.) описан микроинкубатор, замкнутую камеру которого, содержащую образец, можно поместить на держатель объекта микроскопа; поэтому пользователь может проводить наблюдение с помощью микроскопа в любой момент времени, или развитие образца может быть зарегистрировано камерой, соединенной с микроскопом стандартным способом. Поскольку капсула соединена трубками с устройствами, подающими воду и CO₂, наблюдение за развитием более чем одного образца может быть неудобным. Кроме того, структура микроинкубатора является в высшей степени сложной, поэтому наблюдение за одним размещенным в инкубаторе образцом является очень дорогостоящим.

Несколько компаний, производящих микроскопы, производят тринокулярные инвертированные микроскопы с держателями объектов, вокруг которых оборудованы миниинкубаторы. Планшеты для культивирования эмбрионов можно поместить на держатель объекта микроскопа, который обеспечивает возможность наблюдения за несколькими образцами при перемещении планшета с помощью микромотора. Однако температура и другие параметры, зависящие от положения в инкубаторе, могут колебаться в большей степени, чем в стандартном лабораторном инкубаторе нормального размера, а количество образцов, за которыми можно наблюдать, ограничено, в частности, с учетом высокой стоимости встроенного микроскопа.

В публикации US 2006/0115892 А1 (Yamamoto et al.) описан инкубатор с встроенной в него системой штативов, позволяющей хранить несколько планшетов, содержащих образцы. Планшеты, содержащие образцы, вынимаются с помощью сложного механизма и перемещаются в поле зрения устройств, формирующих изображение, которые расположены над одним из участков инкубатора, принимающим образец. Инкубатор передает изображение, захваченное устройствами, формирующими изображение, к внешнему компьютеру. Хотя в этом случае возможно наблюдение за многими образцами, каждый образец можно инспектировать лишь относительно редко и, как указано выше, само перемещение образца может отрицательно повлиять на его развитие. Кроме того, при таком сложном механизме перемещения почти невозможна очистка инкубатора, которая очень важна для предотвращения заражения образцов микроорганизмами.

В вышеуказанной публикации US 2006/0115892 А1 (Yamamoto et al.) также описана система, в которой в камере инкубатора нет перемещающего механизма, а на одной из полок инкубатора размещен блок микроскопического наблюдения, тогда как клетки или ткани размещают на блоке микроскопического наблюдения на его смотровом окошке. В корпусе блока микроскопического наблюдения расположены оптическая система, камера и фокусирующие устройства, причем фокусирующие устройства оборудованы электромотором, который перемещает их перпендикулярно плоскости смотрового окошка. Изображения, захваченные камерой, передаются на внешние устройства обработки данных (то есть на компьютер) по сигнальному кабелю, который проходит через стенку инкубатора.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Автор настоящего изобретения проводил эксперименты с микроскопом, сходным с описанным в вышеупомянутой публикации US 2006/0115892 А1, внутри корпуса которого находились оптическая система, состоящая из объектива, призмы и проектора, камера и, необязательно, электрическая схема, управляющая осветительным устройством, которое освещает образец, помещенный на окно держателя образца. Во время использования такого микроскопа автор настоящего изобретения заметил, что в нескольких случаях развитие эмбрионов не соответствовало ожиданиям; эмбрионы погибали после нескольких делений, несмотря на то, что стресс, связанный с перемещением и освещением, был успешно сведен к минимуму за счет описанного устройства формирования изображения. Проведенные исследования (см. Пример 1 ниже) показали, что повреждение эмбрионов было вызвано прямыми и косвенными эффектами электрического тока, создаваемого камерой и управляющими электронными приборами, расположенными внутри устройства и находящимися под электрическим напряжением в течение всего периода культивирования.

Задачей настоящего изобретения было устранение или по меньшей мере уменьшение вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена за счет создания системы формирования изображения образца, предназначенной для передачи изображения клеток или тканей, расположенных в культивационной камере, к средствам обработки данных, определенной в независимом пункте 1 формулы изобретения, и способа, определенного в независимом пункте 7 формулы изобретения. Некоторые предпочтительные варианты осуществления системы и способа описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Изобретение будет более подробно описано ниже посредством описания некоторых предпочтительных вариантов его осуществления со ссылками на прилагаемые графические материалы, где:

Фиг.1 изображает вид сверху в разрезе варианта осуществления системы формирования изображения образца согласно настоящему изобретению;

Фиг.2 изображает вид в перспективе варианта осуществления блока микроскопа системы формирования изображения образца согласно настоящему изобретению;

Фиг.3 изображает продольный разрез блока микроскопа, изображенного на Фиг.2; и

Фиг.4 схематически изображает вариант осуществления блока управления системы формирования изображения образца согласно настоящему изобретению.

Одинаковые ссылочные позиции на рисунках обозначают одни и те же элементы.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фиг.1 изображает систему 1 формирования изображения образца согласно настоящему изобретению. Система 1 формирования изображения образца состоит из двух основных блоков: блока 2 микроскопа и блока 3 управления, соединенных друг с другом с помощью соединительных средств 4. Блок 2.микроскопа предназначен для использования в культивационной камере 6 инкубатора 5, обеспечивающей благоприятные условия окружающей среды для культивирования клеток или тканей. Блок 2 микроскопа, расположенный в культивационной камере 6, используют для формирования изображения клеток или тканей, подлежащих наблюдению, и для передачи захваченных изображений по соединительным средствам 4 к блоку 3 управления, предназначенному для использования и размещения вне культивационной камеры 6. Блок 3 управления, в свою очередь, передает изображения к средствам 7 обработки данных, которыми предпочтительно являются портативный персональный компьютер типа «ноутбук» или другие компьютерные средства.

Фиг.2 и 3 изображают вариант осуществления блока 2 микроскопа, который может быть размещен и предназначен для использования в культивационной камере 6 инкубатора 5. Блок 2 микроскопа содержит станину 8, которая образует корпус, содержащий сегмент 11 с полым профилем и квадратным поперечным сечением, который замыкается передней пластиной 9 и задней пластиной 10. Все элементы станины 8 могут быть изготовлены из любого коррозионностойкого материала, предпочтительно - из алюминия, нержавеющей стали, полимерного материала, например - АБС (акрилонитрилбутадиенстирола), или даже из стекла, или из материала, который изначально не является коррозионностойким, но которому придают коррозионную стойкость посредством обработки его поверхности. По существу, станина 8, в частности ее сегмент 11 с полым профилем, обеспечивает механическую стабильность всего блока 2 микроскопа. Передняя пластина 9 и задняя пластина 10 могут быть зафиксированы на сегменте 11 с полым профилем, например, посредством клеевого соединения.

Держатель 12 объекта расположен на верхней стенке сегмента 11 с полым профилем; на него можно поместить клетки или ткани, предназначенные для наблюдения и получения изображения, и он обеспечивает то, что клетки или ткани могут оставаться, по существу, неподвижными в течение периода культивирования. Поэтому на верхней стенке сегмента 11 с полым профилем предусмотрено отверстие 13, или окно для размещения образца, которое закрыто пластиной 14, изготовленной из обычного стекла или, предпочтительно, из оптического стекла или другого прозрачного материала, например из плексигласа или поликарбоната. Толщина пластины 14 может варьироваться от 0,02 мм до 55 мм в зависимости от рабочего расстояния объектива 18, который будет обсужден ниже. Клетки или ткани, обычно находящиеся в контейнерах для образцов (например, в чашке Петри), можно поместить на верхнюю сторону пластины 14 над отверстием 13.

В этом варианте осуществления настоящего изобретения на вершине станины 8 закреплена осветительная консоль 15, которая проходит над держателем 12 объекта; эта осветительная консоль 15 оборудована осветительным устройством 16 (например, светодиодом), который освещает клетки или ткани, помещенные на держатель 12 объекта. Назначение осветительного устройства 16 состоит в освещении клеток или тканей с освещенностью, равной по меньшей мере 0,01 люкс, а его мощность предпочтительно варьируется между 0,01 Вт и 5 Вт. Обычно длина волны света, излучаемого осветительным устройством 16, лежит в диапазоне длин волн от 400 нм до 700 нм, хотя в некоторых случаях может потребоваться свет с длиной волны, которая лежит ниже или выше видимого диапазона (инфракрасное или ультрафиолетовое излучение). В случае исследований, выполняемых с использованием системы формирования изображения образца согласно настоящему изобретению, в которых используют процедуры прижизненного окрашивания клеток флуоресцентными красителями, спектр источника света должен соответствовать используемому красителю.

Специалисты в данной области техники способны выбрать поддиапазон вышеуказанного диапазона длин волн, который является наиболее подходящим для клеток или тканей, чтобы минимизировать стресс, вызываемый у изучаемых клеток или тканей. Чтобы минимизировать стресс, связанный с освещением, осветительное устройство 16 включают лишь на период наблюдения или получения изображения в течение процесса культивирования, что будет более подробно обсуждено ниже. В проиллюстрированном варианте осуществления настоящего изобретения светодиод непосредственно освещает клетки или ткани, но возможны и другие варианты осуществления настоящего изобретения, в которых свет от светодиода рассеивается зеркалом с полированной матовой поверхностью, и этот рассеянный, диффузный свет доходит до клеток или тканей. Кроме того, в световой путь могут быть также введены дополнительные фильтры, матовое стекло или светорассеивающее стекло.

Следует отметить, что в других вариантах осуществления настоящего изобретения осветительная консоль 15 с осветительным устройством 16 может быть исключена из блока 2 микроскопа, и свет, необходимый для получения изображений клеток или тканей, может быть обеспечен источником света, независимым от системы 1 формирования изображений; например, внутреннее пространство инкубатора 5, в котором используется блок 2 микроскопа, может быть также оборудовано осветительным устройством. Кроме того, можно также разместить осветительное устройство 16 внутри блока 2 микроскопа, так что свет будет освещать клетки или ткани снизу. Это приведет к формированию изображения клеток или тканей в отраженном свете, а не в проходящем свете.

Корпус 17, образующий станину 8 блока 2 микроскопа, окружает камеру 17, в которой расположены устройство формирования изображения, формирующее оптическое изображение клеток или тканей, расположенных на держателе 12 объекта, и устройство захвата изображения, захватывающее изображение, проецируемое устройством формирования изображения.

В данном варианте осуществления настоящего изобретения устройство формирования изображения содержит объектив 18, расположенный под держателем 12 объекта, оптическая ось которого перпендикулярна пластине 14 держателя 12 объекта, призму 19, расположенную под объективом 18, и проекционное устройство 20, которое расположено на пути светового луча, идущего от объектива 18 и преломленного призмой 19 на 90 градусов.

Объектив 18 представляет собой систему линз с увеличением от 1 до 200, предпочтительно - с увеличением 10, и он отвечает за получение четкого изображения клеток или тканей, размещенных в поле зрения, при заданном увеличении. Рабочее расстояние объектива 18 связано с увеличением объектива; рабочее расстояние уменьшается при возрастании увеличения. В проиллюстрированном варианте осуществления настоящего изобретения используемый объектив 18 может быть нефторированной недеформированной планахроматной системой линз с увеличением 10, с фиксированной системой тубуса размером 160 мм и с рабочим расстоянием, примерно равным 1 см.

Поскольку расстояние между пластиной 14 и клетками или тканями, размещенными на пластине 14, может варьироваться в зависимости от толщины стенок контейнера для образца, а также от положения клеток или тканей внутри контейнера, объектив 18 снабжен фокусирующим устройством 21, которое обеспечивает регулировку четкости изображения, и которое способно перемещать объектив 18 вдоль его оптической оси. Объектив 18 ввинчен в оправу 22 объектива, или он может быть зафиксирован в ней посредством клеевого соединения. Наружная поверхность оправы 22 объектива снабжена резьбой, состоящей из 1-4 витков с шагом резьбы от 0,1 мм до 4 мм, предпочтительно от 0,5 мм до 2 мм, наиболее предпочтительно 1 мм. Резьба 22 объектива ввинчена в кольцо 23 фокусирующего держателя, снабженное такой же резьбой, а фокусирующий держатель снабжен фокусирующим колесом 25, которое выступает из корпуса через отверстие 24, имеющееся на передней пластине 9. Это позволяет осуществлять ручную регулировку четкости изображения посредством поворота фокусирующего колеса 25 после размещения клеток или тканей на пластине 14 держателя 12 объекта. Использование большого фокусирующего колеса 25 обеспечивает точную и легкую фокусировку. Высота отверстия 24 позволяет осуществлять вертикальное перемещение фокусирующего колеса 25, которое необходимо для фокусировки. Замкнутую конструкцию корпуса, образующего станину 8, можно получить, например, при использовании фокусирующего колеса, расположенного снаружи от корпуса, например на верхней стенке корпуса, и поворачивающегося на оси, проходящей через верхнюю стенку герметичным образом, причем на внутреннем конце этой оси предусмотрен диск, который, в свою очередь, поворачивает оправу 22 объектива с помощью ребристого ремня. Такая конструкция минимизирует проникновение в корпус водяного пара из влажной культивационной камеры 6; для впитывания водяного пара, который все же проник в корпус, и для защиты оптических и электронных устройств, находящихся внутри блока 2 микроскопа, внутри корпуса может быть размещен силикагель, который заменяют через предварительно заданные промежутки времени. В других вариантах осуществления настоящего изобретения объектив 18 может приводиться в движение электромотором или любым другим способом, известным в данной области техники.

Призма 19 преломляет свет, идущий от объектива 18, на 90 градусов и поэтому обеспечивает возможность использования конструкции блока 2 микроскопа, расположенной, по существу, горизонтально, что облегчает ее размещение в инкубаторе 5. В этом варианте осуществления настоящего изобретения призма 19 является стеклянной призмой с размерами 22 мм × 22 мм × 22 мм и с углом 45°, которую в других вариантах осуществления настоящего изобретения можно заменить зеркалами (например, полированными металлическими поверхностями). Призма 19 скреплена с держателем 26 призмы, который, в свою очередь, скреплен со стенкой 28 корпуса 27 призмы у отверстия на вертикальной стенке 28 корпуса 27 призмы; корпус 27 призмы изготовлен из полого профиля. Также имеется отверстие на верхней стенке 29 корпуса 27 призмы, в которое может вдаваться объектив 18, закрепленный в оправе 22 объектива, которая удерживается кольцом 23 фокусирующего держателя, зафиксированным на верхней стенке 29, например, посредством клеевого соединения. Сам корпус 27 призмы закреплен на дне сегмента 11 с полым профилем при помощи винтов (не показаны), которые проходят через сегмент 11 с полым профилем, или, альтернативно, посредством клеевого соединения.

Свет, выходящий из призмы 19, через отверстие держателя 26 призмы и отверстие в вертикальной стенке 28 корпуса 27 призмы входит в проекционное устройство 20. В этом варианте осуществления настоящего изобретения откорректированное по плоскости проекционное устройство 20, которое проецирует не содержащее искажений изображение на средства захвата изображения, является системой линз с увеличением 0,45. Держатель 30 проекционного устройства 20 зафиксирован на сегменте 11 с полым профилем способом, сходным с креплением корпуса 27 призмы, то есть с помощью винтов (не изображены), проходящих через дно сегмента 11 с полым профилем, или, альтернативно, посредством клеевого соединения.

Средства 31 захвата изображения образованы датчиком 32, который размещен внутри корпуса 31 камеры. Проекционное устройство 20 и корпус 31 камеры соединены друг с другом с помощью резьбового соединения. Датчик 32 внутри корпуса 31 камеры содержит другой корпус 33, который в данном варианте осуществления настоящего изобретения закрыт стеклянной пластиной в направлении падающего света. Кривая спектральной чувствительности датчика 32 должна перекрывать спектр света, излучаемого осветительным устройством 16. Датчик 32 может быть ПЗС-датчиком или КМОП-датчиком с предпочтительным разрешением, равным по меньшей мере 1 мегапикселю, а его размеры могут варьироваться от ¼ дюйма (6,35 мм) до ⅛ дюйма (28,575 мм), предпочтительно размер датчика равен ½ дюйма (1,27 мм). Следует отметить, что изображение, проектируемое проекционным устройством 20, предпочтительно должно перекрывать всю поверхность датчика 32. Датчик 32 может быть монохромным или цветным, его максимальная частота смены кадров предпочтительно не меньше 2 кадров в секунду и обычно варьируется от 30 до 60 кадров в секунду, но высокую частоту смены кадров обычно можно использовать только при меньшем разрешении. Общее увеличение блока 2 микроскопа с датчиком 32 можно рассчитать посредством перемножения увеличений объектива 18 и проекционного устройства 20.

В данном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения датчиком 32 можно управлять через его USB-порт, а захваченное изображение может быть передано через тот же USB-порт и соединительные средства 4 к блоку 3 управления. В проиллюстрированном варианте осуществления настоящего изобретения USB-порт датчика 32 соединен с коннектором 34, установленным на задней панели 10 корпуса, образующего станину 8, с помощью кабеля 35, сюда же присоединен кабель 36, питающий осветительное устройство 16, установленное на осветительной консоли 15, причем кабель 36 частично проходит в канале осветительной консоли 15.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, в котором фокусировка осуществляется с помощью мотора, мотор может быть подсоединен к коннектору 34, а четкость изображения можно регулировать с помощью блока 3 управления или средств 7 обработки данных автоматически, например на основании контрастности захваченного изображения.

Если вернуться к варианту осуществления настоящего изобретения, изображенному на Фиг.2, то очевидно, что коннектор 34 и соединенные с ним соединительные средства 4 не только передают захваченное изображение к блоку 3 управления и средствам 7 обработки данных, но и обеспечивают подачу электропитания к блоку 2 микроскопа.

На Фиг.1 показано, что соединительные средства 4, подсоединенные к коннектору 34 блока 2 микроскопа, который может быть помещен в инкубатор 5, могут быть выведены из инкубатора 5 (например, через дверцу инкубатора 5, или через герметично уплотненное отверстие, проходящее через стенку инкубатора 5, или с использованием взаимосвязанных коннекторов, встроенных в стенку инкубатора 5 и обращенных наружу и внутрь), и они могут быть подсоединены к блоку 3 управления, который может быть размещен за пределами инкубатора 5. С другой стороны, блок 3 управления системы 1 формирования изображения может быть соединен со средствами 7 обработки данных.

Блок 3 управления выполняет две задачи. Он получает изображения, захваченные блоком 2 микроскопа, и передает их к средствам 7 обработки данных, а также обеспечивает подачу электропитания к блоку 2 микроскопа таким образом, что он прекращает подачу электропитания к блоку 2 микроскопа, за исключением периода захвата изображения клеток или тканей средствами захвата изображения, то есть датчиком 32, и передачи захваченного изображения по соединительным средствам 4; за счет этого он переводит блок 2 микроскопа в состояние без напряжения и без тока, в котором минимизированы вредные эффекты, вызываемые электрическими и/или электронными приборами, находящимися в непосредственной близости от наблюдаемых клеток и тканей. Для этой цели блок 3 управления содержит средства, прекращающие подачу электропитания к блоку 2 микроскопа, за исключением периода захвата изображения клеток или тканей и передачи захваченного изображения к блоку 3 управления по соединительным средствам 4.

Принципиальная схема варианта осуществления блока 3 управления приведена на Фиг.4. В проиллюстрированном примере и в соответствии с изложенным выше блок 3 управления обеспечивает подачу электропитания к датчику 32 и осветительному устройству 16 таким образом, что он прекращает подачу электропитания, за исключением периода, когда блок 2 микроскопа действительно используется для получения изображения.

Пример блока 2 управления содержит четырехпортовый USB-концентратор 37, схему 38 управления микроскопом, три твердотельных переключателя 39, три коннектора 40 для подсоединения соединительных средств 4 одного, двух или трех блоков 2 микроскопа, USB-разъем 41 для обеспечения связи со средствами 7 обработки данных и блок 42 питания, который обеспечивает подачу электроэнергии к блоку 3 управления, а затем - к блокам 2 микроскопа, соединенным через соединительные средства 4 с коннекторами 40 с помощью USB-концентратора 3/ и схемы 38 управления микроскопом.

USB-концентратор 37 не только обеспечивает связь между средствами 7 обработки данных и USB-устройствами (в нашем примере - датчиками 32) в одном или более блоках 2 микроскопа, соединенных с блоком 3 управления, но и обеспечивает связь между средствами 7 обработки данных и схемой 38 управления микроскопом. Поэтому средства 7 обработки данных, которыми в данном примере является портативный персональный компьютер типа «ноутбук», могут связываться со схемой 38 управления микроскопом через USB-шину, если необходимо получить изображение с помощью блока 2 микроскопа. В этом случае схема 38 управления микроскопом посылает к соответствующему одному из трех твердотельных переключателей 39 такой сигнал, который приводит к подключению порта USB-концентратора 37, соответствующего определенному блоку 2 микроскопа, к соответствующему коннектору 40. При этом датчик 32, расположенный внутри блока 2 микроскопа, получает электропитание через USB-концентратор, и это обеспечивает возможность получения изображения клеток или тканей, расположенных на держателе 12 объекта соответствующего блока 2 микроскопа, с помощью блока 3 управления и передачи полученного изображения к средствам 7 обработки данных через соединительные средства 4 и блок 3 управления. Одновременно схема 38 управления микроскопом посылает прямоугольный импульсный сигнал с переменным коэффициентом заполнения и напряжением, которое превышает напряжение включения светодиода, на ее выход, соединенный с коннектором 40, относящимся к соответствующему блоку 2 микроскопа, к которому подсоединено осветительное устройство 16, то есть светодиод соответствующего блока 2 микроскопа, с помощью соединительных средств 4. Это приводит к тому, что светодиод освещает клетки или ткани, расположенные на держателе 12 объекта, светом с интенсивностью, соответствующей коэффициенту заполнения. Средства 7 обработки данных могут регулировать коэффициент заполнения, а значит - и интенсивность, с помощью команды, посылаемой к схеме 38 управления микроскопом через USB-шину.

После того как изображение клеток или тканей получено и передано к блоку 3 управления, схема 38 управления микроскопом отсоединяет блок 2 микроскопа от USB-концентратора 37 с помощью твердотельного переключателя 39 и выключает подачу прямоугольного импульсного сигнала на светодиод. Твердотельный переключатель 39 отсоединяет провода электропитания и сигнальные провода. При этом блок 2 микроскопа не получает ни электропитания, ни сигнального напряжения, и поэтому он переходит в состояние, в котором нет ни напряжения, ни токов. В данном варианте осуществления настоящего изобретения схема 38 управления микроскопом и твердотельный переключатель 39 образуют устройство, которое предназначено для прекращения подачи электроэнергии к блоку 2 микроскопа, за исключением периода захвата изображения клеток или тканей и передачи захваченного изображения к блоку 3 управления по соединительным средствам 4.

Представленный вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает возможность прекращения блоком 3 управления электропитания осветительного устройства 16 сразу же после того, как изображение захвачено, но когда передача изображения от датчика 32 к блоку 3 управления еще продолжается. Это приводит к дополнительному снижению стресса, вызванного освещением, у клеток или тканей. В качестве альтернативы такому подходу может быть использована менее сложная система, в которой осветительное устройство 16, то есть светодиод, получает электропитание непосредственно от USB-порта датчика 32 через последовательно включенное сопротивление. В таком варианте осуществления настоящего изобретения невозможно ни регулирование интенсивности света, ни независимое включение осветительного устройства 16.

Твердотельный переключатель 39, естественно, является лишь одним из примеров устройства, обеспечивающего отсоединение блока 2 микроскопа от источника питания, которым в описанном выше случае является USB-шина.

Очевидно, что в данном примере блок 3 управления с четырехпортовым USB-концентратором 37 может обслуживать три блока 2 микроскопа и передавать изображение, захваченное этими блоками, к одному средству 7 обработки данных, однако количество обслуживаемых блоков 2 микроскопа легко можно увеличить за счет увеличения количества портов USB-концентратора 37.

Если фокусировка в блоке 2 микроскопа осуществляется не вручную, а автоматически, то работу мотора, подключенного к коннектору 34 блока 2 микроскопа, можно обеспечить таким образом, что мотор не будет получать электропитания, то есть в нем не будет ни напряжений, ни токов, за исключением периода получения изображения и передачи данных, аналогично описанному выше.

Следует отметить, что осветительное устройство 16 и фокусирующее устройство на основе электромотора могут быть сконструированы как раздельные USB-устройства в блоке 2 микроскопа. В этом случае USB-концентратор будет соединен с коннектором 34 блока 2 микроскопа, к нему, в свою очередь, будут подключены 2 USB-устройства блока 2 микроскопа с различными функциями, а блок 3 управления будет отсоединять этот USB-концентратор, расположенный в блоке 2 микроскопа, а значит - и все USB-устройства, расположенные в блоке 2 микроскопа, от USB-концентратора 37.

Очевидно, что вместо описанного решения, частично основанного на USB-устройствах, специалисты в данной области техники смогут обеспечить связь между блоком 2 микроскопа и средствами 7 обработки данных через блок 3 управления несколькими другими способами, в которых подача электроэнергии к блоку 2 микроскопа прекращается, за исключением периода получения изображения и передачи данных. USB-шина и USB-разъем 41, образующие устройство сопряжения между блоком 3 управления и средствами 7 обработки данных, могут быть заменены несколькими другими способами, например, два блока могут быть соединены друг с другом через порты стандарта RS-232, с использованием технологии Bluetooth, локальной вычислительной сети (LAN) или беспроводной локальной сети (WLAN).

В качестве дополнительной опции блок 3 управления и средства 7 обработки данных могут быть объединены в одно устройство, которое принципиально не нарушает вышеописанное функционирование блока 3 управления. Возможным примером этого может быть включение блока управления в виде платы расширения стандарта PCI в компьютер, образующий средства 7 обработки данных, или, в качестве другого примера, описанное выше USB-соединение может быть установлено внутри общего корпуса, содержащего встроенный блок 3 управления и средства 7 обработки данных. Такая конструкция также может быть модифицирована таким образом, что хранение и обработка изображений, полученных в результате захвата изображений клеток или тканей, будет осуществляться внутри самого блока 3 управления.

В качестве другого возможного решения, датчик 32 может быть аналоговым ПЗС-устройством, и захваченное изображение может передаваться к блоку 3 управления по соединительным средствам 4 в виде аналогового видеосигнала. Преобразование аналогового сигнала в цифровую форму может осуществляться либо на месте, либо после передачи данных к средствам 7 обработки данных, и аналоговое ПЗС-устройство (совместно с осветительным устройством 16) будет переводиться в состояние без напряжения блоком 3 управления, за исключением периода формирования изображения и передачи данных.

Кроме того, следует отметить, что соединительные средства 4 между блоком 2 микроскопа и блоком 3 управления могут быть обеспечены не только одним кабелем, но существует также возможность того, что подача электропитания будет осуществляться по одному кабелю, тогда как данные будут перемещаться между блоками по другому кабелю (или кабелям) или даже через беспроводное соединение, если подача электропитания к блоку 2 микроскопа будет прекращаться блоком 3 управления, за исключением периода формирования изображения или передачи данных.

Во время эксплуатации системы 1 формирования изображения клетки или ткани (или даже отдельная клетка), находящиеся в контейнере для образцов, помещают на держатель 12 объекта блока 2 микроскопа, который находится над отверстием 13 в пластине 14, затем соединительные средства 4 подсоединяют к коннектору 34, а другой конец соединительных средств 4 вставляют в один из доступных коннекторов 40 на блоке 3 управления. Фокусировку, при необходимости, можно выполнить после соединения блока 3 управления с помощью USB-разъема 41 с портативным персональным компьютером типа «ноутбук», образующим средства 7 обработки данных. Затем изображение, сформированное системой 1 формирования изображения, отображается на экране компьютера типа «ноутбук», и фокус регулируется с помощью фокусирующего колеса 25. После этого блок 2 микроскопа вместе с клетками или тканями помещают в инкубатор 5, где клетки или ткани остаются, по существу, неподвижными на держателе 12 объекта блока 2 микроскопа в течение всего периода культивирования, а соединительные средства 4 выводят наружу из культивационной камеры 6 инкубатора 5 (Описанный выше порядок действий может быть изменен; например, можно поместить контейнер с клетками или тканями на держатель 12 объекта блока 2 микроскопа, который уже помещен в культивационную камеру 6).

Блок 2 микроскопа включается блоком 3 управления в результате команды, поступающей от компьютера, образующего средства 7 обработки данных, в предварительно определенные моменты времени, или команды, поступающей от пользователя в произвольно выбранные моменты времени, то есть в данном варианте осуществления настоящего изобретения, как описано выше, прямоугольный импульсный сигнал с переменным коэффициентом заполнения посылается к светодиоду, образующему осветительное устройство 16, которое освещает клетки или ткани, и одновременно устанавливается соединение между датчиком 32 и USB-концентратором 37 блока 3 управления с помощью твердотельного переключателя 39; при этом USB-концентратор 37 обеспечивает подачу электропитания к датчику 32, с одной стороны, и посылает команду для захвата изображения, с другой стороны, а затем получает данные, представляющие собой изображение, полученное в результате формирования изображения.

Согласно настоящему изобретению, схема 38 управления микроскопом прекращает подачу электропитания на светодиод и отсоединяет провода электропитания и сигнальные провода датчика 32 от USB-концентратора 37 с помощью твердотельного переключателя 39 после формирования изображения и передачи данных к блоку 3 управления, причем подача электропитания к блоку 2 микроскопа прекращается до начала следующего цикла формирования изображения.

Предпочтительно подача электропитания к блоку 2 микроскопа отсутствует в течение примерно 10-99,999% от общей продолжительности периода культивирования клеток или тканей, так что захват изображения клеток или тканей и передача захваченного изображения к блоку 3 управления осуществляется блоком 2 микроскопа через интервалы, предпочтительно лежащие в диапазоне от 1 минуты до 1 дня, более предпочтительно - в диапазоне от 1 минуты до 30 минут, при длительности, предпочтительно лежащей в диапазоне от 1 секунды до 1 минуты, более предпочтительно - в диапазоне от 1 секунды до 30 секунд. Длительность формирования изображения и передачи изображения очень сильно зависит от выбранного разрешения изображения. При более частом формировании изображений можно получить информацию о развитии клеток или тканей с лучшим временным разрешением, однако клетки или ткани при этом подвергаются более сильному стрессу, связанному с освещением, нагреванием, электрическим напряжением и электрическим током. Если регистрируется движущееся изображение вместо неподвижного изображения, то продолжительность регистрации будет соответствовать длительности видеозаписи.

Изображения передаются из блока 3 управления к средствам 7 обработки данных для хранения или произвольной обработки, и сами изображения и/или созданные на их основе анимации можно видеть на экране компьютера, и их можно анализировать с помощью программного обеспечения компьютера. В конце периода культивирования блок 2 микроскопа можно вынуть из инкубатора 5 вместе с клетками или тканями, после чего его можно при необходимости очистить перед размещением в нем новых клеток или тканей.

Следует отметить, что размеры поля зрения блока 2 микроскопа на держателе 12 объекта равны 0 мм × 1,1 мм в случае описанного выше предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения. Предпочтительно, с этим блоком 2 микроскопа может быть использован контейнер для образцов, на дне которого в пределах этой прямоугольной области можно разместить, например, 3×3 или 3×4 ячеек с диаметром от 100 мкм до 300 мкм и глубиной от 150 мкм до 300 мкм, сформированных посредством вдавливания инструмента с острым концом или посредством лазерной абляции. Если в каждую из ячеек помещен образец, то есть клетки или ткани (например, эмбрионы), то они не будут уходить из поля зрения системы 1 формирования изображения за счет всплывания в жидкой среде, а для их развития будет создана исключительно благоприятная микросреда.

Система 1 формирования изображения может быть успешно и экономически эффективно использована в соответствии с ее описанием в больших инкубаторах, относящихся к стандартному оборудованию, например эмбриологических лабораторий, для экономичного и одновременного наблюдения за многими образцами.

Кроме того, следует отметить, что оптическая система блока 2 микроскопа может отличаться от изображенной на Фиг.2 и 3. Одна из альтернатив уже была описана ранее: за счет исключения призмы 19 может быть сформирован прямой ход луча, что приведет к вертикальному размещению блока. В качестве другой возможности может быть осуществлена обратная конструкция за счет использования объектива с большим рабочим расстоянием; в этом случае объектив будет обеспечивать наблюдение клеток или тканей сверху, а не снизу, через дно контейнера для образцов.

Далее изобретение будет описано на основании приведенного ниже примера. ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Были проведены эксперименты с целью исследования эффектов постоянного низкого напряжения (прямого эффекта электричества и обусловленного им нагревания) на ранние стадии развития эмбрионов мыши in vitro. Задача исследования состояла в том, чтобы оценить, как длительное воздействие электрического тока, вызванного блоком микроскопа как устройством, обеспечивающим непрерывное наблюдение за эмбрионами в искусственно созданном пространстве для культивирования эмбрионов (СО₂-инкубаторе), прямо и косвенно влияет на развитие помещенных на него эмбрионов.

Материалы и методы

Процедура индукции суперовуляции

День - 3, 2 часа дня: 10 международных единиц (IU) сывороточного гонадотропина жеребых кобыл (PMSG) были введены внутрибрюшинно самкам мышей, являвшимся кандидатами в доноры эмбрионов.

День - 1, 2 часа дня: 5 международных единиц (IU) хорионического гонадотропина человека (PMSG) были введены внутрибрюшинно самкам мышей, являвшимся кандидатами в доноры эмбрионов.

День 0, 8:30 утра: выбор самок, у которых произошло спаривание, по наличию вагинальной пробки.

Вымывание эмбрионов

Стандартное хирургическое выделение одноклеточных эмбрионов согласно протоколу, описанному в литературе, и индивидуальные стандартные манипуляции в соответствии с предписаниями о защите животных. В первый день эксперимента фаллопиевы трубы мышей-доноров промывали промывочной жидкостью (например, промывочной средой производства компании Medicult, Дания) и полученные кумулюс-ооцитные комплексы обрабатывали ферментом гиалуронидазой в концентрации 0,5-1 мг/мл (например, производства компании Sigma-Aldrich, США) для получения очищенных эмбрионов для эксперимента.

Культивирование in vitro

Использовали капли среды EmbryoMax KSOM+AA (производства компании Millipore, США) объемом 30 мкл с покрытием из LiteOil (производства компании LlfeGlobal) после предварительной инкубации в течение по меньшей мере 6 часов в инкубаторе с содержанием CO₂, равным 60%, относительной влажностью, равной 90%, и температурой, равной 37°C.

Организация эксперимента

Во время экспериментов с некоторыми популяциями эмбрионов использовали блоки микроскопов, которые, кроме светодиода, образующего осветительное устройство, и цифровой камеры с датчиком, содержали дополнительные управляющие электронные устройства, которые в случае системы формирования изображения согласно настоящему изобретению располагаются в блоке управления, а значит - за пределами культивационной камеры, вдали от эмбрионов. Местоположение управляющих электронных устройств, уровень замкнутости корпуса, образующего станину микроскопа, и время, в течение которого был включен микроскоп, были различными в случае различных популяций эмбрионов, как показано в Таблице 1.

Таблица 1 Группа Организация эксперимента А Группу размещали в полном замкнутом блоке микроскопа, который также содержал управляющие электронные устройства и камеру, которая была постоянно включена; при этом освещение включали через каждые 10 минут. В Группу размещали в открытом корпусе микроскопа; управляющие электронные устройства находились за пределами полого профиля корпуса, причем камера была постоянно включена, и освещение включали через каждые 10 минут. С Группу размещали непосредственно на управляющих электронных устройствах. D Управляющие электронные устройства были размещены за пределами полого профиля блока микроскопа и за пределами культивационной камеры; группу размещали на корпусе замкнутого блока микроскопа с камерой и освещением, которые включали через каждые 10 минут (система и способ согласно настоящему изобретению). Е Контрольная группа эмбрионов со стандартным культивированием в микрокаплях.

Результаты

В Таблице 2 представлены полученные авторами результаты.

Таблица 2       Развитие эмбрионов Экспериментальная n Кол-во 2-   Бласто-   группа (кол-во эмбрионов) повторов клеточная стадия % цисты % А 144 16 140 97% 6 4% В 108 12 103 95% 80 74% С 27 3 7 26% 1 4% D 234 11 225 96% 212 91% Е 332 20 308 93% 285 86%

В группе «А» наблюдали комбинированный отрицательный эффект, обусловленный прямым воздействием электрического тока, постоянно присутствующего в микроскопе, и эффектом тепла, излучаемого электрическими и электронными приборами (цифровая камера): клетки делились в течение одного цикла, но только 4% развивались далее до стадии бластоцисты.

В группе «В» управляющие электронные устройства были размещены за пределами полого профиля блока микроскопа, но из-за непрерывной подачи электропитания на камеру, через которую наблюдали эмбрионы, происходило повышение температуры на 0,8-1,5°C, которое также было измеримым на поверхности микроскопа, служившей опорой для эмбрионов. Развитие эмбрионов было близким к нормальному, но процент эмбрионов, достигавших стадии бластоцисты, был более чем на 10% ниже, чем в контрольной группе.

В случае группы «С» наблюдали прямые эффекты электрического тока, которые привели к тому, что менее одной трети эмбрионов оказались способными к делению, и только один эмбрион достиг стадии бластоцисты. В этой группе был обнаружен наивысший эмбриотоксический эффект.

В группе «D» цифровую камеру выключали на периоды между захватами изображений, поэтому в блоке микроскопа отсутствовал электрический ток, а управляющие электронные устройства были расположены за пределами культивационной камеры. В этой группе был получен наибольший процент развития эмбрионов без признаков вредных эффектов.

Группа «Е»: контрольная группа.

В качестве вывода можно отметить, что низковольтный электрический ток оказывает прямые и непрямые отрицательные эффекты на развитие эмбрионов, а при использовании системы и способа согласно настоящему изобретению, эти отрицательные эффекты успешно устраняются.

Изобретение подробно описано на основании предпочтительных вариантов его осуществления, но специалисты в данной области техники смогут осуществить ряд модификаций и изменений без отклонения от объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.

Изобретение относится к системе (1) формирования изображения образца, предназначенной для передачи изображения клеток или тканей, расположенных в культивационной камере (6), к средствам (7) обработки данных. Система (1) содержит блок (2) микроскопа, предназначенный для использования в культивационной камере (6) и содержащий станину, держатель объекта, размещенный на станине, средства формирования изображения, размещенные на станине и предназначенные для формирования оптического изображения клеток или тканей, расположенных на держателе объекта, и средства захвата изображения, захватывающие изображение, проецируемое средствами формирования изображения. Блок (2) микроскопа содержит выведенные наружу из культивационной камеры (6) соединительные средства (4), которые обеспечивают подачу электропитания к блоку (2) микроскопа и передачу захваченного изображения. Соединительные средства (4) могут быть соединены с блоком (3) управления, предназначенным для использования вне культивационной камеры (6) и передающим захваченное изображение к средствам (7) обработки данных, а блок (3) управления содержит устройства, способные прекращать подачу электропитания к блоку (2) микроскопа, за исключением периода захвата изображения клеток или тканей и передачи захваченного изображения к блоку (3) управления по соединительным средствам (4). Технический результат - повышение надежности экспериментов, проводимых в культивационной камере. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

1. Система формирования изображения образца, предназначенная для передачи изображения клеток или тканей, расположенных в культивационной камере, к средствам обработки данных, содержащая блок (2) микроскопа, предназначенный для использования в культивационной камере (6), причем блок (2) микроскопа содержит станину (8), держатель (12) объекта, размещенный на станине (8) и обеспечивающий то, что расположенные на нем клетки или ткани остаются, по существу, неподвижными в течение всего периода культивирования, средства формирования изображения, размещенные на станине (8) и предназначенные для формирования оптического изображения клеток или тканей, расположенных на держателе (12) объекта, и средства захвата изображения, захватывающие изображение, проецируемое средствами формирования изображения; кроме того, блок (2) микроскопа содержит соединительные средства (4), которые могут быть выведены наружу из культивационной камеры (6), и которые обеспечивают подачу электропитания к блоку (2) микроскопа и передачу захваченного изображения,
отличающаяся тем, что соединительные средства (4) могут быть соединены с блоком (3) управления, предназначенным для использования вне культивационной камеры (6) и передающим захваченное изображение к средствам (7) обработки данных, причем блок (3) управления содержит устройства, способные прекращать подачу электропитания к блоку (2) микроскопа, за исключением периода захвата изображения клеток или тканей и передачи захваченного изображения к блоку (3) управления по соединительным средствам (4).

2. Система по п.1, отличающаяся тем, что блок (3) управления прекращает подачу электропитания к блоку (2) микроскопа примерно на от 10% до 99,999% от общей продолжительности периода культивирования клеток или тканей.

3. Система по п.1, отличающаяся тем, что блок (2) микроскопа содержит осветительное устройство (16) и/или перемещаемое электромотором фокусирующее устройство.

4. Система по п.1, отличающаяся тем, что блок (3) управления содержит устройство сопряжения, передающее захваченные изображения к средствам (7) обработки данных.

5. Система по п.1, отличающаяся тем, что блок (3) управления и средства (7) обработки данных представляют собой единое целое.

6. Система по п.1, отличающаяся тем, что она содержит один или более дополнительных блоков (2) микроскопа, предназначенных для использования в культивационной камере (6), соединительные средства (4) которых могут быть выведены наружу из культивационной камеры (6), могут быть соединены с блоком (3) управления и обеспечивают подачу электропитания к блоку (2) микроскопа и передачу захваченного изображения.

7. Способ передачи изображения клеток или тканей, расположенных в культивационной камере, к средствам обработки данных, содержащий стадии:
- размещения клеток или тканей на держателе (12) блока (2) микроскопа, содержащего средства формирования изображения для формирования оптического изображения клеток или тканей, расположенных на держателе (12) объекта, и средства захвата изображения, захватывающие изображение, проецируемое средствами формирования изображения;
- размещения блока (2) микроскопа в культивационной камере (6);
- выведения соединительных средств (4) блока (2) микроскопа наружу из культивационной камеры (6), причем эти соединительные средства (4) обеспечивают подачу электропитания к блоку (2) микроскопа и передачу захваченного изображения;
- удержание клеток или тканей, расположенных на держателе объекта блока (2) микроскопа, размещенного в культивационной камере (6), в, по существу, неподвижном состоянии в течение всего периода культивирования,
отличающийся тем, что способ дополнительно содержит стадии:
- соединения соединительных средств (4) с блоком (3) управления, расположенным вне культивационной камеры (6),
- захвата изображения клеток или тканей средствами захвата изображения и передачи его к блоку (3) управления и, в свою очередь, к средствам (7) обработки данных в выбранные моменты времени в течение периода культивирования, и
- прекращения подачи электропитания к блоку (2) микроскопа, за исключением периода захвата изображения клеток или тканей и передачи захваченного изображения к блоку (3) управления по соединительным средствам (4).

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что подача электропитания к блоку (2) микроскопа прекращается примерно на от 10% до 99,999% от общей продолжительности периода культивирования клеток или тканей.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что захват изображения клеток или тканей и передача захваченного изображения к блоку (3) управления осуществляются блоком (2) микроскопа через промежутки времени, лежащие в диапазоне от 1 минуты до 1 дня, в течение периодов времени, лежащих в диапазоне от 1 секунды до 1 минуты.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что в нем использован блок (2) микроскопа, который содержит осветительное устройство (16) и/или перемещаемое электромотором фокусирующее устройство.

11. Способ по п.7, отличающийся тем, что блок (3) управления содержит устройство сопряжения, передающее захваченные изображения к средствам (7) обработки данных, причем это устройство сопряжения соединено со средствами (7) обработки данных.

12. Способ по п.7, отличающийся тем, что в нем использован блок (3) управления, который представляет собой единое целое со средствами (7) обработки данных.

13. Способ по п.7, отличающийся тем, что он содержит стадии размещения дополнительных клеток или тканей на держателях (12) объекта одного или более дополнительных блоков (2) микроскопа, размещения одного или более блоков (2) микроскопа в культивационной камере (6), выведения соединительных средств (4) одного или более дополнительных блоков (2) микроскопа из культивационной камеры (6) и соединения их с блоком (3) управления, расположенным вне культивационной камеры (6), причем соединительные средства (4) обеспечивают подачу электропитания к одному или более блокам (2) микроскопа и передают захваченное изображение.