СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННОЙ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА И ОКСИГЕНАЦИЮ ГЕМОГЛОБИНА В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННОГО Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 

1. Цель работы - показать отрицательное действие обострения цитомегаловирусной инфекции у беременной на содержание метгемоглобина и оксигенацию гемоглобина в эритроцитах новорожденного.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения увеличения при обострении цитомегаловирусной инфекции метгемоглобина в эритроцитах периферической крови новорожденного как фактор, приводящий к снижению оксигенации гемоглобина, что создает угрозу формирования у новорожденного гемической анемии.

3. Раскрытие изобретения

Поскольку в безъядерных эритроцитах утилизация глюкозы выполняется через пентозный цикл, в процессе которого одним из важных этапов является образование никотинамидадениннуклеотида (НАДФ) и переход его в восстановленную форму - НАДФ·Н [6], НАДФ·Н принимает участие в восстановлении метгемоглобина, в котором железо гема, окисленое до Fe³⁺⁺⁺ , не способно переносить кислород. Вследствие подавления активности НАДФ·Н выключается из обменных процессов Fe²⁺⁺ и снижается в крови содержание HbO₂, а количество метгемоглобина увеличивается [1, 3]. В эритроцитах переносчиком водорода может быть метиленовый синий [5], который, выполнив свою функцию, обесцвечивается, переходя в бесцветную лейкоформу. При подавлении активности НАДФ·Н процесс переноса водорода резко снижается, поэтому эритроциты, окрашенные метиленовым синим, не будут обесцвечиваться, а количество метгемоглобина будет нарастать, препятствуя формированию оксигемоглобина.

В данной работе установлено, что обострение цитомегаловирусной инфекции подавляет формирование НАДФ·Н, так как задерживается обесцвечивание метиленового синего в эритроцитах, следовательно, нарушается перенос водорода и подавляется восстановление метгемоглобина, что и приводит к снижению процессов оксигенации гемоглобина с формированием в организме гемической анемии.

4. В доступной литературе аналогов по данному вопросу не отмечено.

5. Осуществление изобретения

5.1. Обследовано 25 беременных на сроке гестации 20-22 недели в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ) в стадии обострения (основная группа) и 15 беременных на тех же сроках гестации без патологии (контрольная группа), а также забиралась пуповинная кровь у 15 новорожденных от матерей, перенесших обострение ЦМВИ, и 15 новорожденных от матерей, не болевших ЦМВИ. У беременных симптоматически обострение ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз обострения ЦМВИ устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности - более 65%, а также ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

5.2. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

5.3. Содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови определяли спектрофотометрическим методом по Кушаковскому М.С. (1968) [2].

5.4. Активность метиленового синего в эритроцитах периферической крови определяли следующим образом: гепаринизированную кровь, взятую из пуповинной крови новорожденных в количестве 0,5 мл, помещали в 0,5 мл 0,1% раствора метиленового синего, приготовленного на фосфатном буфере с pH 7,4. Полученную взвесь эритроцитов в течение 5 мин содержали в термостате при температуре 37°C. Затем каплю взвеси помещали на предметное стекло и накрывали покровным стеклом, окатовав его парафином. Приготовленный препарат эритроцитов в 0,1% растворе метиленового синего помещали на микроскоп и изучали при увеличении 10×100 при комнатной температуре в течение 45 мин.

5.5. Содержание оксигемоглобина оценивали по прописи Эвелина и Мэллой [4].

6. В процессе исследования были получены следующие результаты

При обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации в периферической крови новорожденного отмечался высокий титр антител к цитомегаловирусу 1:1600. Количество окрашенных 0,1 раствором метиленового синего эритроцитов в начальном для исследования периоде насчитывалось 73,0±3,5% через 45 мин наблюдения количество окрашенных эритроцитов метиленовым синим на этом же препарате сохранялось до 62,5±1,9% (фигура 2). Параллельные исследования крови новорожденных от матерей, не болевших в период гестации показали (фигура 1), что на исходном отрезке времени на препарате было окрашено метиленовым синим 44,0±1,8% эритроцитов, а к 45 мин наблюдения их осталось только 8,8±0,6%. Количество метгемоглобина в крови новорожденных, родившихся от матерей, перенесших обострение цитомегаловирусной инфекции, составило 1,8±0,08%, у новорожденных, родившихся от здоровых беременных - 0,65±0,03%. Полученные показатели свидетельствуют, что при обострении цитомегаловирусной инфекции в период гестации подавляет активность НАДФ·Н, в результате чего задерживается обесцвечивание метиленового синего эритроцитов и увеличивается содержание метгемоглобина до 1,8±0,08%; в контроле - 0,65±0,03%. Это сказывается на оксигенации гемоглобина у новорожденных, родившихся от матерей с обострением цитомегаловирусной инфекции, в период гестации количество оксигемоглобина определялось в количестве 96,5±2,9% у новорожденных, родившихся от здоровых матерей - 99,0±1,8%, что создает угрозу развития у новорожденного при обострении ЦМВИ гемической анемии.

Пример 1.

Беременная А., 18 лет. Роды - в срок.

Обострение цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации с титром антител 1:1600 к цитомегаловирусу. Приводило к увеличению в крови новорожденного увеличение титра антител к цитомегаловирусу 1:1600. На мазках периферической крови новорожденного, окрашенных 0,1 раствором метиленового синего, через 45 мин наблюдения под микроскопом, сохранялось до 65,5% эритроцитов, окрашенных метиленовым синим. В периферической крови новорожденного количество метгемоглобина составило 1,8%, содержание оксигемоглобина снижалось до 96,5%. Это свидетельствовало, что плод при обострении во время беременности цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600 развивался в условиях гемической анемии, сохранившейся даже после рождения, что заставляет принимать для него коррегирующие лечебные мероприятия.

Пример 2.

Беременная Ш. 23 лет. Роды - в срок.

В течение гестации беременность протекала без осложнений. Признаков обострения цитомегаловирусной инфекции не отмечалось. В крови новорожденного признаков обострения цитомегаловирусной инфекции не отмечено. Проведенные исследования показали, что на окрашенном 0,1% раствором метиленового синего на мазке крови новорожденного первоначально было подсчитано 44,0% эритроцитов, окрашенных метиленовым синим. Через 45 мин наблюдения, под микроскопом окрашенных осталось только 8,8%. Следовательно, в крови было достаточно НАДФ·Н, чтобы выполнить восстановление метгемоглобина, что и подтверждается его низким содержанием - 0,65%. Оксигенация гемоглобина выполнялась в полном объеме, поскольку количество HbO₂ насчитывалось 99,0%. Причин развития анемии не было.

Литература

1. Галоян А.А., Симонян М.А. и др. Влияние обогащенного пролином полипептида на восстановление метгемоглобина и образование супероксида под действием металлопротеинов-цитохрома b558111 и супрола in vitro // Нейрохимия. - 2007. - №1. - С.37-40.

2. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина // Лен. отделение. - «Медицина». - 1968. - С.324.

3. Новицкий В.В., Сапрыкина Э.В. и др. Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобинообразователей // Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - №1. - С.32-37.

4. Покровский А.А. Биохимические методы исследования // Справочник М.: «Медицина», 1969. - С.337.

5. Энгельгардт В.А., Саков Н.Е. О механизме пастеровского эффекта // «Биохимия». - 1943. - Т.8. - С.9-12.

6. Murphy J.R. Erythrocyte metabolism I The equilibration of giucose - C¹⁴ between serum and erythrocytes // J. Lab. Clin. Med. - 1960. - vol.55. - p.281-286.

На фигуре 1 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови новорожденного, родившегося от здоровой беременной. В периферической крови на исходный момент исследования насчитывалось 44,0±1,8% эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленовой сини. Через 45 мин наблюдения их число снизилось до 8,8±0,6%, поскольку путь для восстановления метгемоглобин - свободен, а в крови отмечается высокий уровень оксигемоглобина - 99,0±1.8%.

На фигуре 2 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови новорожденного, родившегося от матери, перенесшей в третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител 1:1600. В силу ингибирования цитомегаловирусом процесса восстановления метгемоглобина число окрашенных эритроцитов остается высоким - 62,5±1,9%, исходное число - 73,0±3,5%, так как блокируется восстановление метгемоглобина - 1,8±0,08% (контроль - 0,65±0,03%) и снижается формирование оксигемоглобина до 96,5±2,9%, контроль - 99,0±1.8%.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на содержание метгемоглобина и оксигемоглобина в эритроцитах новорожденного. Для этого в периферической крови новорожденного при обострении у беременной в третьем триместре гестации цитомегаловирусной инфекции определяют количество эритроцитов, предварительно окрашенных 0,1% раствором метиленового синего. При титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, повышении количества эритроцитов через 45 мин после окрашивания до 62,5±1,9%, увеличении метгемоглобина до 1,8±0,08%, снижении оксигемоглобина до 96,5±2,9% оценивают как нарушение восстановления метгемоглобина и снижение оксигенации гемоглобина, что приводит к формированию у новорожденного гемической анемии. Способ позволяет изучить характер оксигенации гемоглобина в эритроцитах периферической крови новорожденных, родившихся от матерей с обострением цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации. 2 ил.

Способ оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции при ее обострении у беременных в третьем триместре гестации на содержание метгемоглобина и оксигемоглобина в эритроцитах крови новорожденного, включающий определение антител к цитомегаловирусу и количественное содержание эритроцитов в периферической крови новорожденного, предварительно окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, и при титре антител к цитомегаловиру 1:1600, повышении количества эритроцитов через 45 минут после окрашивания до 62,5±1,9%, увеличении метгемоглобина до 1,8±0,08%, снижении оксигемоглобина до 96,5±2,9% оценивают как нарушение восстановления метгемоглобина и снижение оксигенации гемоглобина, что приводит к формированию у новорожденного гемической анемии.