СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/50 

Цель работы - показать отрицательное влияние цитомегаловирусной инфекции на восстановление метгемоглобина в эритроцитах периферической крови беременных на третьем триместре гестации.

Как известно, в безъядерных эритроцитах широко представлен пентозный цикл утилизации глюкозы, в процессе которого происходит восстановление никотинамидадениннуклеотидфосфата (НАДФ) в восстановленную форму - НАДФ·Н (Федоров Н.А., 1976). За весь пентозный цикл образуется две молекулы НАДФ·Н (J. Murphy, 1960).

Образующиеся НАДФ·Н участвуют в разных клеточных процессах: синтезе жирных кислот, холестерина, восстановлении метгемоглобина. Нарушение пентозного цикла связано с разрушением структур эритроцитов и наступлением их гемолиза.

Особое место в функциональной деятельности эритроцита занимает метгемоглобин, являясь той формой гемоглобина, в которой железо гема окислено до Fe (III) и поэтому он не способен переносить кислород.

Формирование метгемоглобина в эритроцитах происходит при отравлении нитратами, анилином, полипептидами (Новицкий В.В., Сапрыкина Э.В. и др., 2006; Галоян А.А., Симонян М.А. и др., 2007).

Интенсивность реакций пентозного цикла в эритроцитах заметно увеличивается в присутствии метиленового синего, что способствует восстановлению метгемоглобина.

Вероятно, в безъядерных эритроцитах с утратой ядра произошла и утрата одного из факторов, участвующих в общей дыхательной системе -акцептора и переносчика водорода, который может быть заменен метиленовым синим (Энгельгардт В.А., 1943).

В норме восстановление метгемоглобина выполняется метгемоглобин-редуктазой. При подавлении ее функции могут ее заменить неферментативные системы; такие как глютатион, аскорбиновая кислота, метиленовый синий.

Однако на настоящее время в литературе нет сведений, указывающих на то, что в ингибировании метгемоглобин-редуктазы принимают участие антигены персистирующих инфекций, в том числе такие как антигены цитомегаловирусной инфекции.

В представленной работе мы остановились на следующих не освещенных в литературе факторах:

1. Содержание метгемоглобина в эритроцитах беременных изучалось в эритроцитах беременных при обострении во время гестации цитомегаловирусной инфекции, на третьем триместре беременности.

2. Процесс переноса электронов для восстановления метгемоглобина определяли путем окрашивания эритроцитов 0,1% раствором метиленового синего, предполагая, что ингибирование при цитомегаловирусной инфекции метгемоглобин-редуктазы приведет к повышенному включению в восстановление метгемоглобина метиленового синего как источника электронов.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 30 беременных, у которых на третьем триместре гестации появилось нарастание титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600. Обследовано 15 беременных, у которых в период гестации не обнаружено антител к цитомегаловирусу.

2. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.

3. Титр антител к цитомегаловирусу определяли иммуноферментным методом в периферической крови беременных на спектрофотометре «Stat Fax - 2100» (USA) с реагентами «Вектор-Бест» (Новосибирск).

4. Содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови определяли спектрофотометрическим методом по Кушаковскому М.С. (1968).

5. Активность метиленового синего в эритроцитах периферической крови определяли следующим образом:

гепаринизированную кровь, взятую из локтевой вены беременной в количестве 0,5 мл, помещали в 0,5 мл 0,1% раствора метиленового синего, приготовленного на фосфатном буфере с рН 7,4. Полученную взвесь эритроцитов в течение 5 мин содержали в термостате при температуре 37°С. Затем каплю взвеси помещали на предметное стекло и накрывали покровным стеклом, окатовав его парафином. Камеру со взвесью эритроцитов в 0,1% растворе метиленового синего помещали на микроскоп и изучали при увеличении 10×100. Полученные поля фотографировались на пленку «Кодак», с которой через сканер вносились в компьютер. В последующем производили подсчет количества эритроцитов, окрашенных метиленовой синькой, на 100 от общего числа подсчитанных как у здоровых беременных, так и беременных с обострением цитомегаловирусной инфекцией.

В процессе исследования были получены следующие результаты.

При обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации при титре 1:1600 в периферической крови количество окрашенных 0,1% раствором метиленового синего эритроцитов насчитывалось 12,0±0,9% (фигура 1), а количество метгемоглобина увеличивалось до 1,5±0,42%. У здоровых беременных содержание эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, составило 3,0±0,08% (фигура 2), а содержание метгемоглобина - 0,5±0,04%.

Таким образом, цитомегаловирусная инфекция подавляет восстановления метгемоглобина и создает угрозу насыщения гемоглобина эритроцитов кислородом.

1. Галоян А.А., Симонян М.А. и др. Влияние обогащенного пролином полипептида на восстановление метгемоглобина и образование супероксида под действием металлопротеинов-цитохрома b558111 и супрола in vitro. // Нейрохимия. - 2007. - №1. - с.37-40.

2. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина. // Лен. отделение. - «Медицина». - 1968. - 324 с.

3. Новицкий В.В., Сапрыкина Э.В. и др. Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобино-образователей. // Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - №1. - с.32-37.

4. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция.// М.:. - «Медицина». - 1976. - 543 с.

5. Энгельгардт В.А., Саков Н.Е. О механизме пастеровского эффекта. // «Биохимия». - Т.8. - 1943. - С.9-12.

6. Murphy J.R. Erythrocyte metabolism I The equilibration of glucose - С between serum and erythrocytes // J. Lab. Clin. Med. - 1960. - vol.55. - p.281-286.

На фигуре 1 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови беременной на третьем триместре гестации 0,1% раствором метиленового синего при обострении цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600. В силу ингибирования цитомегаловирусом процесса восстановления метгемоглобина число окрашенных эритроцитов остается высоким (12,0±0,9), так как блокируется перенос электронов с метиленовым синим.

На фигуре 2 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови здоровых беременных. В периферической крови определяется только 3,0±0,08% эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, поскольку путь для него к восстановлению метгемоглобина свободен.

Изобретение применяют для оценки влияния цитомегаловирусной инфекции на содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре гестации. Сущность способа: в периферической крови беременных с цитомегаловирусной инфекцией на третьем триместре гестации определяют количество эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, выполняющего роль переносчика электронов, и содержание метгемоглобина в эритроцитах. Если при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 будет наблюдаться увеличение числа окрашенных эритроцитов до 12,0±0,9%, а увеличение метгемоглобина до 1,5±0,42%, то оценивают нарушение восстановления метгемоглобина и угрозу насыщения гемоглобина эритроцитов кислородом. 2 ил.

Способ оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови беременных в третьем триместре, отличающийся тем, что дополнительно определяют количественное содержание в периферической крови эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, выполняющего роль переносчика электронов, и если при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 в третьем триместре гестации будет наблюдаться увеличение числа окрашенных эритроцитов до 12,0±0,9%, а увеличение метгемоглобина до 1,5±0,42%, то оценивают как нарушение восстановления метгемоглобина и угрозу насыщения гемоглобина эритроцитов кислородом.