СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/02 G01N33/50 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии и медицинской микологии для количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды, для характеристики их вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к лигандам различной природы.

Существуют различные подходы в количественном определении уровня адгезии клеток микроорганизмов (бактерий и дрожжеподобных грибов) к лигандам различной природы.

Известен способ количественного определения адгезии клеток микроорганизмов к коллагену и фибронектину, основанный на окрашивании специфически адгезированных клеток красителем - кристаллическим фиолетовым, однако, такой способ требует дофиксации клеток с помощью глутарового альдегида, использования дополнительной процедуры для разрушения клеток с использованием детергента Triton Х-100 [1].

Более простым представляется подход с использованием мембран, в которых заключен соответствующий лиганд (например, гемоглобин) [2]. В этом случае клетки микроорганизмов связываются с мембраной, несущей лиганды, с помощью специфических адгезинов, расположенных на поверхности их клеточных стенок. Количественный уровень адгезии в этом случае определяется при подсчете количества клеток микроорганизмов, адгезированных на мембране с лигандами, либо по уменьшению оптической плотности суспензии клеток микроорганизма после взаимодействия с мембраной. Однако такой подход требует отработанного подхода в изготовлении мембран с использованием специфических компонентов - нитроцеллюлозы, органических растворителей. На практике требуется использование сравнительно большого количества мембран (для достижения большой площади рабочей поверхности - нескольких квадратных сантиметров), а также большого объема (несколько миллилитров) суспензии микроорганизмов, что не всегда позволяет использовать этот метод при малом количестве биоматериала, например при наличии одной небольшой колонии микроорганизма, выросшей на твердой (агаризованной) питательной среде.

Наиболее близким к нашему изобретению можно отнести способ определения адгезии микроорганизмов к лигандам, сорбированных на полистироловую поверхность 96-луночных планшет [3]. Этот подход позволяет избавиться от применения различных, в том числе небезопасных, веществ, а также свести работу к использованию микрообъемов (порядка 100 мкл), не требующих большого количества исходного биоматериала. Однако описанное изобретение обладает рядом недостатков. Во-первых, для количественной оценки адгезии клеток микроорганизмов предлагается либо добавление в лунки планшета (содержащие адгезированные клетки) жидкой питательной среды, либо отбор аликвоты суспензии микроорганизмов из лунок планшета в жидкую (или посев на твердую) питательную среду с последующей инкубацией и оценкой роста (подсчета образовавшихся колоний) культуры микроорганизмов, что позволяет получить результаты только по прошествии существенного количества времени (от 6 до 48 ч в зависимости от условий инкубации и вида микроорганизма). Кроме того, в этом случае не учитывается возможность различия в скорости роста у разных штаммов одного и того же вида микроорганизма, что может искусственно увеличивать или нивелировать реальное различие в адгезивном потенциале конкретных штаммов. Во-вторых, использование для количественной оценки адгезированных клеток микроорганизмов определения активности бактериальных ферментов у адгезированных клеток является практически непригодным в силу вариации самой активности (количества) ферментов у различных штаммов одного и того же вида микроорганизма [4] и, соответственно, отсутствия абсолютной корреляции между уровнем ферментативной активности и уровнем адгезивного потенциала. Этот подход также может увеличивать или нивелировать реальное различие в адгезивном потенциале сравниваемых штаммов.

В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка простого способа, позволяющая быстро, менее чем за 1 час, с использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, в микрообъемах, без дополнительного использования химических реагентов, количественно определять уровень адгезии клеток микроорганизмов (бактерий и дрожжеподобных грибов) к лигандам различной природы.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает предварительное сорбирование в лунках полистиролового планшета специфического лиганда, добавление в лунки планшета суспензии клеток микроорганизмов, непродолжительную инкубацию суспензии клеток в лунках планшета, последующий отбор аликвоты суспензии из лунки и добавление ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли (например, 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия), с последующей оценкой уровня адгезии клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм. На основании полученных данных по оптической плотности определяют индекс адгезии. Индекс адгезии (в процентах) высчитывают по формуле:

ИА=100-100×(ОП₆₀₀опыт/ОП₆₀₀контроль),

где

ОП₆₀₀опыт - значение оптической плотности суспензии при 600 нм, отобранной из лунки, содержащей лиганд;

ОП₆₀₀контроль - значение оптической плотности суспензии при 600 нм, отобранной из лунки не содержащей лиганд.

Чем выше индекс адгезии, тем выше уровень адгезии штамма микроорганизма к выбранному лиганду.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка быстрого способа определения уровня адгезии микроорганизмов к лигандам различной природы, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, в микрообъемах, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов.

Пример 1. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus к гемоглобину. В лунки планшета предварительно сорбируют лиганд - человеческий гемоглобин. Для этого гемоглобин растворяют в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 из расчета 20 мкг/мл. Приготовленный раствор в объеме 50 мкл вносят в лунки планшета, инкубируют в течение 24 ч при 4°C. После этого лунки планшета трижды промывают 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. Подготовленные таким образом планшеты можно хранить в течение года при 4°C в сухих условиях. В готовые лунки планшета вносим по 200 мкл суспензии Staphylococcus aureus в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 с оптической плотностью при 600 нм в диапазоне от 0,500 до 0,600. Инкубируем в течение 15 минут, после этого отбираем 100 мкл суспензии из лунки и переносим ее в другую лунку, содержащую 100 мкл 0,2 М натрий-фосфатный буферный раствор с рН 7,4, перемешиваем разведенную суспензию и далее измеряем оптическую плотность полученных разведенных суспензий при 600 нм. В качестве контрольных вариантов используются лунки, не содержащие гемоглобин. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют миоглобин. Результаты представлены в таблице 2.

Пример 3. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют коллаген. Результаты представлены в таблице 3.

Пример 4. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют фибронектин. Результаты представлены в таблице 4.

Пример 5. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют фибриногену. Результаты представлены в таблице 5.

Пример 6. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют иммуноглобулин A (IgA). Результаты представлены в таблице 6.

Пример 7. Определение уровня адгезии проводят аналогично примеру 1, но в качестве микроорганизма используют дрожжеподобный гриб Candida albicans. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 1 Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к гемоглобину   Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом S.aureus АТСС 25923   контроль гемоглобин контроль гемоглобин контроль гемоглобин значение ОП 600 нм 0,300 0,280 0,310 0,285 0,315 0,269 Индекс адгезии, % 6,7 8,0 14,6

Таблица 2 Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к миоглобину   Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом S. aureus АТСС 25923   контроль миоглобин контроль миоглобин контроль миоглобин значение ОП 600 нм 0,300 0,283 0,310 0,288 0,315 0,270 Индекс адгезии, % 5,6 7,0 14,2

Таблица 3 Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к коллагену   Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом S. aureus АТСС 25923   контроль коллаген контроль коллаген контроль коллаген значение ОП 600 нм 0,300 0,285 0,310 0,290 0,315 0,279 Индекс адгезии, % 5,0 6,4 11,4

Таблица 4 Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к фибронектину   Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом S. aureus АТСС 25923   контроль фибронектин контроль фибронектин контроль фибронектин значение ОП 600 нм 0,300 0,288 0,310 0,295 0,315 0,287 Индекс адгезии, % 4,0 4,8 8,8

Таблица 5 Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к фибриногену   Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом S. aureus АТСС 25923   контроль фибриноген контроль фибриноген контроль фибриноген значение ОП 600 нм 0,300 0,285 0,310 0,288 0,315 0,285 Индекс адгезии, % 5,0 7,0 9,5

Таблица 6 Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к IgA   Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом S. aureus ATCC 25923   контроль IgA контроль IgA контроль IgA значение ОП 600 нм 0,300 0,291 0,310 0,297 0,315 0,295 Индекс адгезии, % 3,0 4,1 6,3

Таблица 7 Определение уровня адгезии клеток Candida albicans к гемоглобину   Штамм С.albicans с кожи здорового человека Штамм С.albicans с кожи человека с атопическим дерматитом Candida albicans музейный штамм №4   контроль гемоглобин контроль гемоглобин контроль гемоглобин значение ОП 600 нм 0,300 0,275 0,310 0,280 0,315 0,273 Индекс адгезии, % 8,3 9,6 13,3

ЛИТЕРАТУРА

1. Pynnonen M., Stephenson R.E., Schwartz K., Hemandez M., Boles B.R. / Hemoglobin promotes Staphylococcus aureus nasal colonization // PLoS Pathogens, 2011.

2. Лисовская С.А. / Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук «Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов Candida albicans» // Казань, 2008. 25 с.

3. Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Мустафин И.Г. / Способ определения адгезии Staphylococcus spp.к гемопротеинам // Патент RU №2393229.

4. Баязитова Л.Т., Тюрин Ю.А., Куликов С.Н., Долбин Д.А., Фассахов Р.С. / Исследование антибактериальной активности препарата «Скин-кап» в отношении Staphylococcus aureus при местной терапии атопического дерматита // Практическая Медицина, 2009, №3 (35), с.89-91.

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской бактериологии и медицинской микологии, и описывает способ количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды. Способ включает предварительную сорбцию в лунках полистиролового планшета специфического лиганда, выбранного из ряда: гемоглобин, миоглобин, коллаген, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулин А, добавление в лунки планшета с сорбированным лигандом суспензии клеток микроорганизма, инкубирование суспензии клеток в лунках планшета в течение 15 минут, отбор аликвоты суспензии из лунки и добавление ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия, при этом оценку уровня адгезии клеток бактерий проводят путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм при сравнении их с контрольными вариантами лунок, не содержащих лиганд. Изобретение характеризуется высокой скоростью проведения определения уровня адгезии микроорганизмов к лигандам различной природы, высокой воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов и может быть использовано для in vitro характеристики вирулентных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды, по уровню их адгезии к лигандам различной природы. 7 табл., 7 пр.

Способ определения адгезивного потенциала микроорганизмов, характеризующийся тем, что в лунках полистиролового планшета сорбируют специфический лиганд, выбранный из ряда: гемоглобин, миоглобин, коллаген, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулин А, добавляют в лунки планшета с сорбированным лигандом суспензию клеток микроорганизма, проводят инкубацию суспензии клеток в лунках планшета в течение 15 минут, отбирают аликвоту суспензии из лунки и добавляют ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия и оценивают уровень адгезии клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм при сравнении их с контрольными вариантами лунок, не содержащих лиганд.