СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФИКСИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/02 G01N33/483 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для изучения свойств эритроцитов фиксировать на своей поверхности различные микроорганизмы, в том числе и возбудителей инфекций бактериальной природы человека и сельскохозяйственных животных, что может способствовать изучению особенностей патогенеза ряда бактериальных заболеваний.

Большое внимание при изучении патогенеза инфекционных болезней придается исследованию адгезивных свойств микробов в отношении клеток макроорганизма [1, 3]. Существуют различные способы определения фиксирующих свойств микробов к эритроцитам. Однако они имеют некоторые недостатки, такие как трудоемкость исследований, ограниченное число изучаемых штаммов микроорганизмов, недостаточная информативность, а порой и необходимость использования сложной и дорогостоящей аппаратуры [3].

Известен способ одномоментного определения адгезивности микробных колоний первичного посева в отношении эритроцитов [2], который заключается в том, что на изолированные колонии первичного посева, выросшие на плотной питательной среде, наносят 3-5%-ную взвесь эритроцитов и затем спустя 2-5 мин подсчитывают количество колоний, вокруг которых образуется ореол прикрепленных к их краям эритроцитов. Такие колонии считают адгезивно-активными.

Способ дает возможность проводить изучение адгезивности лишь отдельных изолированных колоний, выбранных исследователем, что в значительной степени обесценивает полученные результаты. Кроме того, используя данный способ, можно наблюдать лишь передвижение эритроцитов к колониям и их фиксирование по их краям, а говорить о непосредственной фиксации микробов к эритроцитам достаточно затруднительно.

Существует способ определения адгезивных свойств микробных клеток [1], заключающийся в том, что в пробирку вносят по 0,5 мл взвесей микробов и эритроцитов в концентрациях 10⁹ кл/мл и 100 млн/мл соответственно. Смеси инкубируют при 37°С на встряхивателе в течение 30 мин, после чего на предметном стекле готовят мазок, его высушивают, окрашивают и рассматривают под микроскопом. Адгезивные свойства оценивают по 3 показателям: среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту адгезии (КА), индексу адгезии микроорганизма (ИАМ). При этом СПА - среднее количество микробов, прикрепившееся к 1 эритроциту, при подсчете не менее 25 эритроцитов. КА - это процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности фиксированные микробы. А ИАМ - среднее число микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците.

К недостаткам этого способа следует отнести трудоемкость и относительную субъективность при подсчете эритроцитов и микробов на их поверхности, а также ограниченное количество исследуемых эритроцитов. Кроме того, при микроскопии мазков достаточно сложно разделять фиксацию микробов на эритроцитах и их спонтанное расположение около них.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для определения фиксирующей активности эритроцитов в отношении микробов сначала проводится инкубирование смеси взвесей микробов и эритроцитов в пробирке при 37-39°С на встряхивателе в течение 30 мин, а затем, в отличие от прототипа, смесь центрифугируют до осаждения эритроцитов, после чего с помощью фотоэлектроколориметра определяют оптическую плотность (ОП) надосадочной жидкости в пробирке.

Для контроля определяют ОП надосадочной жидкости в пробирке, содержащей микробную взвесь и физраствор хлорида натрия вместо взвеси эритроцитов и находящейся в тех же условиях.

В случае фиксации определенного количества микробов на эритроцитах ОП надосадочной жидкости в опытной системе в сравнении с контрольной после центрифугирования снижается.

Бактериофиксирующую активность эритроцитов предложили рассчитывать по формуле

,

где БФАЭ % - бактериофиксирующая активность эритроцитов, Д_к - ОП надосадочной жидкости в контрольной системе, Д_о - ОП надосадочной жидкости в опытной системе, - ОП надосадочной жидкости системы, содержащей взвесь эритроцитов и физраствор хлорида натрия вместо микробной взвеси, и находящейся в тех же условиях.

Величину ввели в формулу для более точного рассчета БФАЭ, чтобы устранить влияние частичного гемолиза эритроцитов при манипуляциях с ними на результаты измерения ОП.

Для проведения эксперимента использовали вакцинный штамм EV чумного микроба и культуру Staph.epidermidis музейного штамма, которые выращивали в течение 24 часов в чашках Петри на мясопептонном агаре (МПА). С помощью физиологического раствора хлорида натрия делали смывы выросших культур с поверхности сред. От содержащихся в полученных взвесях крупных взвешенных частиц освобождались путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 1 мин для их осаждения. Затем оптическую плотность (ОП) микробных взвесей доводили 1,0 ед. экстинкции (для стандартизации опыта). Для измерения ОП использовали прибор КФК-2, зеленый светофильтр, кюветы с рабочим расстоянием между гранями 5 мм, а в качестве растворителя для взвесей - физиологический раствор хлорида натрия.

В опытную систему в силиконизированные пробирки вносили по 1 мл взвеси эритроцитов человека, трижды отмытых физиологическим раствором, в концентрации 0,6-0,7 млрд/мл и по 2,5 мл взвеси микробной культуры с ОП 1 ед. Пробирки выдерживали в течение 30 мин во встряхивателе при температуре 37-39°С. Применяли лабораторный встряхиватель типа 358 S с максимальной амплитудой (25 мм) и минимальной частотой колебаний (50 циклов/мин). Затем пробирки центрифугировали при 1000 об/мин для осаждения эритроцитов и измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости. Контролем служили пробы с 1 мл физраствора и 2,5 мл взвеси микробов, находящиеся в аналогичных условиях.

Учет результатов фиксации бактерий к эритроцитам осуществляли по разнице измерения оптической плотности (ОП) надосадочной жидкости в пробирках опытной и контрольной систем (таблица 1).

Таблица 1
Результаты измерения ОП надосадочной жидкости в опытной и контрольной системах, ед. экстинкции, (n=6) Вид микроба ОП надосадочной жидкости в опытной системе ОП надосадочной жидкости в контрольной системе Вакцинный штамм EV чумного микроба 0,33±0,05 0,65±0,05 Staph.epidermidis 0,79±0,06 0,57±0,06

Из данной таблицы видно, что в опытной системе, содержащей взвесь вакцинного штамма чумного микроба, происходило уменьшение ОП надосадочной жидкости после центрифугирования по сравнению с контрольной системой, что свидетельствовало о фиксации микробов на эритроцитах. В пробирках со стафилококком уменьшения ОП в опытной системе по сравнению с контрольной не было, т.е. фиксации не наблюдалось.

Установили, что в опытной системе в ходе эксперимента возникает незначительный гемолиз эритроцитов, что влияет на результат измерения ОП надосадочной жидкости. При проведении исследований в 1-2 пробирки вносили по 1 мл взвеси эритроцитов и 2,5 мл физраствора. Измеряли ОП надосадочной жидкости в них после культивирования во встряхивателе и центрифугирования и установили, что она отличается от ОП физраствора на 0,05-0,13 ед. экстинкции. Данную величину () предложили учитывать при расчете БФАЭ.

В следующей серии опытов провели сравнительную оценку БФАЭ человека в отношении вакцинного штамма EV и нескольких музейных штаммов сапрофитных микробов. В качестве питательных сред применяли МПА, при выращивании чумного микроба вакцинного штамма - МПА с добавлением генцианвиолета. Пользуясь полученными данными, по предложенной формуле определяли БФАЭ человека в отношении указанных микробов (таблица 2).

Таблица 2
Определение БФАЭ в отношении различных микроорганизмов, (n=5) Вид микроба БФАЭ, % Вакцинный штамм EV чумного микроба 50±16,4 Ps.aeruginosa 12±4,3 E.coli 9,2±5,6 Pr.vulgaris - Staph.epidermidis -

Для более объективной характеристики БФАЭ в отношении различных микробов ввели шкалу оценки, в соответствие с которой БФАЭ менее 10% считается слабой, 11-20% - средней, 21-40% - высокой, 41% и более - очень высокой.

БФАЭ в отношении штамма EV определили как очень высокую, в отношении Ps.aeruginosa - среднюю, E.coli - слабую. В отношении двух музейных штаммов двух видов микробов - Pr.vulgaris и Staph.epidermidis БФАЭ не проявилась.

Обнаружили, что БФАЭ в отношении одних и тех же микробов, многократно пассированных через питательные среды, резко уменьшается, кроме того, значительное влияние на проявление у микроба адгезивных свойств в отношении эритроцитов оказывает состав плотной питательной среды для выращивания микроба. Для этого проводили эксперимент, в котором использовали свежие культуры вакцинного штамма EV чумного микроба, взятые из новых флаконов с вакциной и выращиваемые в течение 24 часов на МПА и переваре Хоттингера, и культуры этого же микроба, пассированные трехкратно через плотные питательные среды (МПА). В состав сред для подавления посторонней микрофлоры добавляли генцианвиолет. Результаты определения БФАЭ в эксперименте представлены в таблице 3.

Таблица 3
Влияние состава питательной среды и количества пассажей на БФАЭ в отношении вакцинного штамма чумного микроба, (n=6). Различия при получении микробной культуры БФАЭ, % Выращивание на переваре Хоттингера после однократного пересева из свежего флакона с вакциной 81±8,2 Выращивание на МПА после однократного пересева из свежего флакона с вакциной 54,8±7,54 Выращивание на МПА после 3-кратного пассажирования 35,3±19,7

Из таблицы видно, что более оптимальной средой выращивания для проявления у вакцинного штамма чумного микроба адгезивных свойств в отношении эритроцитов человека является перевар Хоттингера. При культивировании этого микроба на МПА данная способность проявляется в меньшей степени, а при многократном пассировании через плотную питательную среду значительно снижается.

Таким образом, предложенный способ определения БФАЭ позволяет изучать фиксирующие свойства эритроцитов по отношению к различным микроорганизмам в том числе и к возбудителям бактериальных инфекций, оценивать степень их выраженности, выявлять условия, влияющие на фиксацию микробов на эритроцитах. Это дает возможность получить новые, дополнительные сведения о характере взаимодействия микробных клеток с эритроцитами человека. Предлагаемый способ определения БФАЭ не требует применения сложного и дорогостоящего оборудования, достаточно чувствителен, а также прост в исполнении. Он позволяет, в отличие от прототипа, одновременно устанавливать взаимодействие миллионов эритроцитов с десятками миллионов бактерий. С его помощью можно изучать адгезивные свойства широкого спектра микробов и выявлять даже незначительные их изменения.

Литература

1. Брилис В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. / В.И.Брилис, Т.А.Брилене, Х.П.Ленцнер, А.А.Ленцнер // Лабораторное дело. - 1986. - №4. - С.210-212. - прототип.

2. Гизатулина С.С. Способ оценки состояния микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных колоний и типу адгезинов. / С.С.Гизатулина, М.О.Биргер, Л.И.Кулинич и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1991. - №4а. - С.21-23.

3. Куликовский А.В. Изменение адгезивной способности микроорганизмов. / А.В.Куликовский, И.Б.Павлова // Ветеринария. - 1993. - №7. - С.22.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии. Сущность разработки заключается в том, что смесь взвесей микробов и эритроцитов инкубируют при 37-39°С на встряхивателе в течение 30 мин, центрифугируют до осаждения эритроцитов, а затем с помощью фотоэлектроколориметра определяют оптическую плотность надосадочной жидкости смеси. Бактериофиксирующую активность эритроцитов - БФАЭ (%) - рассчитывают по разности между Д_к (оптическая плотность надосадочной жидкости в контрольной системе) и суммой Д_о (оптическая плотность надосадочной жидкости в опытной системе) и (оптическая плотность надосадочной жидкости системы, содержащей взвесь эритроцитов и физраствор хлорида натрия вместо микробной взвеси и находящейся в тех же условиях), деленной на Д_к и умноженной на 100%. Использование способа позволяет определять способность эритроцитов фиксировать на своей поверхности различные микроорганизмы, в том числе возбудителей бактериальных инфекций и дает возможность изучения адгезивных свойств микробов. 3 табл.

Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ), включающий инкубирование смеси взвесей микробов и эритроцитов при 37-39°С на встряхивателе в течение 30 мин, отличающийся тем, что в последующем смесь центрифугируют до осаждения эритроцитов, а затем с помощью фотоэлектроколориметра определяют оптическую плотность надосадочной жидкости смеси по формуле ,
где БФАЭ (%) - бактериофиксирующая активность эритроцитов;
Д_к - оптическая плотность надосадочной жидкости в контрольной системе;
Д_о - оптическая плотность надосадочной жидкости в опытной системе;
- оптическая плотность надосадочной жидкости системы, содержащей взвесь эритроцитов и физраствор хлорида натрия вместо микробной взвеси и находящейся в тех же условиях.