СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ДИСФУНКЦИИ У КРЫС, ИНДУЦИРОВАННОЙ АДАПТАЦИЕЙ ОРГАНИЗМА К НИЗКИМ СЕЗОННЫМ ТЕМПЕРАТУРАМ Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 A61K31/35 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной морфологии.

Репродуктивная система человека и животных чрезвычайно чувствительна к действию экстремальных факторов среды, в связи с этим поиск средств, повышающих адаптационные возможности органов репродуктивной системы, является важнейшей медико-биологической проблемой. Одним из направлений современной экспериментальной репродуктологии является разработка препаратов, корригирующих тестикулярную дисфункцию, возникающую при взаимодействии организма животных с неблагоприятными факторами среды. В большинстве исследований предпочтение отдается веществам, выделенным из растительного сырья, что объясняется отсутствием у них токсических эффектов на репродуктивную функцию животных. Дигидрокверцетин является флавоноидом природного происхождения, который получают из древесины лиственницы сибирской и даурской. Дигидрокверцетин является малотоксичным соединением, не обладающим мутагенными свойствами и не угнетающим репродуктивную функцию у животных. Однако протективные свойства дигидрокверцетина при нарушениях репродуктивной функции у животных, развивающихся в процессе адаптации к экстремально низким температурам, изучены не были.

В результате проведенного патентного поиска других препаратов для коррекции тестикулярной дисфункции у крыс, индуцированной адаптацией к низким сезонным температурам, выявлено не было.

Задача изобретения заключается в создании способа коррекции структурного и функционального состояния семенников лабораторных животных при адаптации к низким сезонным температурам.

Предложен способ применения препарата дигидрокверцетин, являющегося флавоноидом природного происхождения. Дигидрокверцетин, получаемый из древесины лиственницы сибирской и даурской [1. Конкина И.Г. Сравнительная оценка реакционной способности кверцетина и дигидрокверцетина по отношению к пероксильным радикалам / И.Г. Конкина, С.А. Грабовский, Ю.И. Муринов, Н.Н. Кабальнова // Химия растительного сырья. 2011. №3. С.207-208] является малотоксичным соединением, не обладающим мутагенными свойствами и не угнетающим репродуктивную функцию у животных [2. Жанатаев А.К. Изучение генотоксичности ДКВ in vivo / А.К. Жанатаев, А.В. Кулакова, В.В. Насонова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 145. №3. С.309-312].

Способ осуществляется следующим образом.

В эксперименте изучены свойства дигидрокверцетина как корректора тестикулярной дисфункции у крыс, индуцированной адаптацией животных к низким температурам. Для этого экспериментальные животные (40 беспородных половозрелых белых крыс-самцов) были разделены на три группы: группу контроля составили интактные крысы (n 10), содержавшиеся в виварии при 18-20°С, крысы второй группы (группа сравнения, n 15) и третьей группы (группа коррекции, n 15) охлаждались в климатокамере «ILKA» при температуре -15°С по 3 часа ежедневно на протяжении четырех недель с соблюдением адекватных условий влажности и вентиляции. Режим охлаждения был выбран с учетом возникновения в таких условиях в тканях и органах подопытных животных выраженных биохимических и морфологических изменений [3. И.Ю. Саяпина, С.С. Целуйко. Окислительный стресс в предстательной железе на этапах адаптации организма к низким температурам // Сибирский медицинский журнал, №4, 2011]. Крысы из группы коррекции ежедневно перед охлаждением получали перорально дигидрокверцетин в дозе 5 мг/кг массы тела. После окончания эксперимента животных умерщвляли под тиопенталовым наркозом путем декапитации. В качестве объекта исследования были использованы семенники и кровь животных.

Тестикулярную дисфункцию, а также корригирующие эффекты дигидрокверцитина оценивали при помощи гистологических и количественных (программно-аппаратный комплекс для количественного анализа «Видео-Тест-Морфология 5.0», Россия) методов, методов иммуноферментного анализа (набор для определения концентрации тестостерона в сыворотке крови, Вектор-Бест, Россия), биохимических и статистических методов (Statistica 6.0.).

Результаты количественного исследования генеративной активности семенников показали, что диаметр извитых семенных канальцев у крыс, получавших дигидрокверцетин, на 10,5% больше (р<0,05), чем у крыс из группы сравнения (табл.1). Изучение цитологического профиля сперматогенеза показало (табл.1), что в семенниках крыс из группы коррекции количество прелептотенных сперматоцитов относительно группы сравнения увеличилось на 23,5%, пахитенных сперматоцитов на 20,6%, круглых сперматид на 23,4% и удлиненных сперматид на 37,5% (р<0,05). Таким образом, относительное количество прелептотенных сперматоцитов, пахитенных сперматоцитов и круглых сперматид не отличается от одноименных показателей у интактных крыс, а относительное количество удлиненных сперматид превышает контрольные значения (табл.1).

Индекс сперматогенеза, характеризующий генеративную активность семенников, у крыс, получавших дигидрокверцетин, не отличается от крыс из группы коррекции и группы контроля (табл.1).

На фоне приема дигидрокверцетина относительное количество клеток Лейдига в интерстиции семенников увеличивается относительно группы сравнения на 26,8% (р<0,05) и не отличается от количества гландулоцитов в семенниках интактных крыс (табл.1). Результаты морфометрии показали (табл.1), что линейные размеры ядра и цитоплазмы клеток Лейдига больше, чем у крыс контрольной группы (р<0,05), что является свидетельством гипертрофии интерстициальных гландулоцитов. Диаметр извитых семенных канальцев у крыс, получавших дигидрокверцетин, на 10,5% больше (р<0,05), чем у крыс из группы сравнения (табл.1).

Исходя из результатов сравнительного анализа количественных показателей генеративной активности семенников, можно констатировать, что дигидрокверцетин предупреждает нарушения сперматогенеза, индуцированные адаптацией животных к низким сезонным температурам. Результаты биохимического исследования показали (табл.2), что после 4-х недель адаптации к низким температурам в сыворотке крови крыс и тканях семенника развивается окислительный стресс. Содержание гидроперекисей липидов в тканях семенника повышено на 68%, диеновых конъюгатов на 13%, а содержание витамина Е снижено на 18% (р<0,05). В сыворотке крови содержание диеновых конъюгатов повышено на 76%, гидроперекисей липидов и малонового диальдегида на 25%, в то время как содержание витамина Е снижено на 34% (р<0,05). Окислительный стресс различной этиологии является основной причиной тестикулярной дисфункции [4. Turner Т.Т. Oxidative stress: a common factor in testicular dysfunction / T.T. Turner, J.J. Lysiak // Journal of Andrology. 2008. Vol.29, №5. P. 488-498]. Окислительный стресс нарушает процессы пролиферации и дифференцировки сперматогенных клеток, индуцирует их гибель путем апоптоза, является основной причиной дегенеративных изменений и гибели клеток Лейдига путем апоптоза [5. Aitken, RJ. Antioxidant systems and oxidative stress in the testes / R.J. Aitken, S.D. Roman // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2008. №1. P. 115-124].

По результатам биохимического исследования можно констатировать, что при адаптации к низким температурам дигидрокверцетин проявляет антиоксидантный эффект, приводя к статистически значимому снижению в сыворотке крови крыс диеновых конъюгатов на 28,2% и малонового диальдегида на 18% (табл.2), что обусловлено антиоксидантными свойствами данного препарата [1. Конкина И.Г. Сравнительная оценка реакционной способности кверцетина и дигидрокверцетина по отношению к пероксильным радикалам / И.Г. Конкина, С.А. Грабовский, Ю.И. Муринов, Н.Н. Кабальнова // Химия растительного сырья. 2011. №3. С.207-208]. Дополнительное поступление в организм животных дигидрокверцетина, по-видимому, позволяет уменьшить расходование основного компонента антиоксидантной защиты организма витамина Е. В сыворотке крови животных, получавших дигидрокверцетин, уровень витамина Е увеличивается на 11,3% (табл.2).

Пример 1.

В течение четырех недель одна группа крыс подвергалась охлаждению в климатокамере «ILKA» при температуре - 15°С по 3 часа ежедневно. В это же время другая группа крыс ежедневно на протяжении четырех недель перед охлаждением получала перорально вместе с пищей дигидрокверцетин в дозе 5 мг/кг массы тела. После завершения эксперимента животных умерщвляли путем декапитации, функциональную активность семенников изучали при помощи гистологических и количественных методов, в сыворотке крови и тканях семенника определяли содержание продуктов перекисного окисления липидов и витамина Е, методом иммуноферментного анализа определяли концентрацию тестостерона в сыворотке крови.

Морфометрическое исследование показало, что после 4-х недель адаптации в семенниках крыс, не получавших дигидрокверцетин, уменьшается диаметр извитых семенных канальцев (табл.1). В семенниках крыс, получавших дигидрокверцетин, диаметр семенных канальцев статистически значимо больше, чем у крыс, которым не проводилась коррекция (табл.1).

Изучение цитологического профиля сперматогенеза показало, что после 4-х недель адаптации к низким температурам в семенниках крыс, не получавших коррекцию дигидрокверцетином, уменьшается относительное количество прелептотенных сперматоцитов, пахитенных сперматоцитов, круглых и удлиненных сперматид (табл.1). У крыс, получавших дигидрокверцетин, относительное количество прелептотенных сперматоцитов, пахитенных сперматоцитов, круглых и удлиненных сперматид статистически значимо выше, чем у крыс, не получавших коррекцию (табл.1).

Таблица 1 Количественные показатели функциональной активности семенников (М±m) Показатель Группа контроля Группа сравнения Группа коррекции Диаметр канальцев (мкм) 277,86±1,27 255,76±1,08 p₁<0,05 281,98±1,65 P₂<0,05 Индекс сперматогенеза (усл. ед.) 3,3±0,45 3,28±0,44 р₁>0,05 3,28±0,44 р₂>0,05 Прелептотенные сперматоциты (число) 66,03±1,29 56,83±1,15 p₁<0,05 70,2±1,18 р₂<0,05 Пахитенные сперматоциты (число) 81,13±1,78 65,83±1,28 p₁<0,05 79,41±0,99 р2<0,05 Круглые сперматиды (число) 199,13±3,68 162,93±3,31 p₁<0,05 201,03±3,46 р₂<0,05 Удлиненные сперматиды (число) 219,23±4,47 163,8±3,65 p₁<0,05 225,62±3,27 р₂<0,05 Диаметр ядра клеток Лейдига (мкм) 6,23±0,02 6,57±0,03 pi<0,05 6,67±0,02 р2>0,05 Диаметр цитоплазмы клеток Лейдига (мкм) 8,31±0,03 9,04±0,04 p₁<0,05 8,77±0,04 р2<0,05 Относительное количество клеток Лейдига (число) 10,9±0,28 8,84±0,27 p₁<0,05 11,21±0,32 р₂<0,05 Тестостерон (нмоль/л) 32,36±2,03 32,17±0,83 p₁>0,05 31,25±1,54 р₂>0,05

Здесь и в таблице 2 p₁ - уровень доверительной вероятности при сравнении показателей группы контроля и группы сравнения, р₂ - уровень доверительной вероятности при сравнении показателей группы коррекции и группы сравнения.

Количественный анализ инкреторной активности семенника показал, что после 4-х недель адаптации в интерстициальной ткани семенника уменьшается относительное количество клеток Лейдига (табл.1), однако уровень тестостерона находится на уровне интактных крыс (табл.1). Структурной основой увеличения концентрации тестостерона в условиях уменьшения популяции интерстициальных гландулоцитов является компенсаторная гипертрофия клеток Лейдига (табл.1).

На фоне приема дигидрокверцетина относительное количество клеток Лейдига в интерстиции семенников относительно группы сравнения увеличивается и не отличается от количества гландулоцитов в семенниках интактных крыс (табл.1). Результаты морфометрии показали (табл.1), что линейные размеры ядра и цитоплазмы клеток Лейдига больше, чем у крыс контрольной группы, что является свидетельством гипертрофии интерстициальных гландулоцитов. Анализ популяционного состава клеток Лейдига показал, что в семенниках крыс, получавших дигидрокверцетин, преобладающим морфофункциональным типом являются средние и большие эндокриноциты, принимающие активное участие в синтезе стероидных гормонов.

Биохимическое исследование показало, что после 4-х недель адаптации в сыворотке крови крыс повышается уровень малонового диальдегида, снижается содержание витамина Е (табл.2). В сыворотке крови крыс, получавших дигидрокверцетин, содержание малонового диальдегида достоверно ниже, а концентрация витамина Е выше, чем у крыс, которым не проводилась коррекция (табл.2).

В сыворотке крови крыс, не получавших дигидрокверцетин, статистически значимо снижается уровень витамина Е, в сыворотке крови крыс, получавших перед охлаждением дигидрокверцетин, уровень витамина Е достоверно выше, чем в группе сравнения (табл.2).

В тканях семенника крыс после 4-х недель адаптации повышается уровень диеновых конъюгатов (табл.2). В тканях семенника у крыс, получавших дигидрокверцетин, содержание диеновых конъюгатов снижается (табл.2).

Таким образом, дигидрокверцетин при адаптации к низким температурам проявляет антиоксидантный эффект, устраняя основную причину тестикулярной дисфункции.

Таблица 2 Содержание основных продуктов перекисного окисления липидов и витамина Е в сыворотке крови и ткани семенников (М±m) Группы животных ДК (нмоль/г) ГЛ (нмоль/г) МДА (нмоль/л) Витамин Е (мкг/г)   Сыворотка крови Группа контроля 27,2±3,0 26,06±1,46 4,84±0,27 51,12±4,11 Группа сравнения 48,9±3,4 p₁<0,05 32,76±1,81 p₁<0,05 6,06±0,34 p₁<0,05 32,48±2,29 p₁<0,05 Группа коррекции 35,12±2,57 р₂<0,05 30,25±2,08 р₂>0,05 4,97±0,29 р₂<0,05 36,2±2,07 р₁>0,05   Семенник Группа контроля 69,98±5,44 25,81±0,9 - 52,63±3,81 Группа сравнения 78,9±5,03 p₁<0,05 43,35±2,81 p₁<0,05 - 32,51±0,82 P₁<0,05 Группа коррекции 70,17±3,52 р₂<0,05 42,07±2,85 Р₂>0,05 - 40,48±1,93 р₂>0,05 ДК - диеновые конъюгаты, ГЛ - гидроперекиси липидов, МДА - малоновый диальдегид.

Коррекция окислительного стресса дигидрокверцетином предотвращает нарушения популяционного состава и гибель клеток Лейдига, способствует развитию компенсаторной гипертрофии эндокриноцитов. На фоне приема дигидрокверцетина отмечается количественное восстановление сперматогенных клеток, относящихся к разным популяциям. Коррекция окислительного стресса дигидрокверцетином предотвращает ускоренную элиминацию сперматогенных клеток в извитых канальцах, тем самым обеспечивая восстановление численности клеток эпителиосперматогенного слоя. Таким образом, дигидрокверцетин можно использовать в качестве средства, корригирующего окислительный стресс и его проявления в виде тестикулярной дисфункции.

Технический результат изобретения заключается в коррекции дигидрокверцетином тестикулярной дисфункции, вызванной адаптацией к низким сезонным температурам, и повышении резистентности организма животных к неблагоприятным факторам среды.

Источники информации

1. Конкина И.Г. Сравнительная оценка реакционной способности кверцетина и дигидрокверцетина по отношению к пероксильным радикалам / И.Г. Конкина, С.А. Грабовский, Ю.И. Муринов, Н.Н. Кабальнова // Химия растительного сырья. 2011. №3. С.207-208.

2. Жанатаев А.К. Изучение генотоксичности ДКВ in vivo / А.К. Жанатаев, А.В. Кулакова, В.В. Насонова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 145, №3. С.309-312.

3. И.Ю. Саяпина, С.С. Целуйко. Окислительный стресс в предстательной железе на этапах адаптации организма к низким температурам // Сибирский медицинский журнал, №4, 2011.

4. Turner Т.Т. Oxidative stress: a common factor in testicular dysfunction / T.T. Turner, J.J. Lysiak // Journal of Andrology. 2008. Vol.29, №5. P. 488-498.

5. Aitken RJ. Antioxidant systems and oxidative stress in the testes / R.J. Aitken, S.D. Roman // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2008. №1. P.115-124.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной морфологии, и касается изучения вопросов коррекции тестикулярной дисфункции, индуцированной адаптацией организма к низким температурам. Для этого в эксперименте крысам осуществляют ежедневное пероральное введение дигидрокверцитина в дозе 5 мг/кг массы тела перед охлаждением. При этом охлаждение проводят при температуре -15°C по 3 часа в день в течение четырех недель. Способ обеспечивает восстановление тестикулярной функции и повышение резистентности организма к неблагоприятным факторам среды. 2 табл., 1 пр.

Способ коррекции тестикулярной дисфункции у крыс, индуцированной адаптацией организма к низким температурам, включающий ежедневное пероральное введение дигидрокверцитина в дозе 5 мг/кг массы тела перед охлаждением, которое проводят при температуре -15°C по 3 часа в день в течение четырех недель.