СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТЕРОГЕННОСТИ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/49 G01N33/539 G01N33/92 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП) в сыворотке крови человека.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований методы определения атерогенности ИК-ммЛПНП. Учитывая важную патогенетическую роль иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для лабораторных исследований способов определения атерогенности ИК-ммЛПНП [1, 3, 4].

Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [5]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность и длительность проведения исследования.

В качестве прототипа использован способ оценки атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротены низкой плотности [2].

В прототипе преципитат иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, из сыворотки крови человека готовят путем обработки буфером, содержащим 8,3%-ный ПЭГ 3350 и 3,3%-ный ПВП 12600, в соотношении 1:1,2, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Преципитат, содержащий ИК-ммЛПНП, отделяют центрифугированием при 3100g в течение 10 мин при 23°C, растворяют в буфере без ПЭГ и ПВП, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах (ХИК) с использованием ферментативного набора, степень связывания комплемента (ССК) морской свинки, рассчитывают атерогенность иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП как отношение ССК к ХИК.

Недостаток метода (прототипа) - исследование атерогенности ИК-ммЛПНП только у больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий, которые не позволили авторам определить референсные значения по атерогенности данных комплексов.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, для рутинных исследований с высокой точностью и с минимальной затратой времени.

Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию циркулирующих иммунных комплексов сыворотки, содержащих ммЛПНП, проводят путем обработки сыворотки буферным раствором, содержащим препарат ПЭГ-3350, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПЭГ-3350, определяют содержание холестерина в преципитированных иммунных комплексах с использованием стандартного ферментативного набора и степень связывания комплемента морской свинки, после чего рассчитывают атерогенность ИК-ммЛПНП как отношение ССК к ХИК. При величине этого показателя ниже 24 ЕД констатируют повышенную атерогенность ИК-ммЛПНП из-за сниженной комплементактивирующей функции IgG в ИК-ммЛПНП.

Способ определения атерогенности ИК-ммЛПНП включает:

1. Буфер-1 для преципитации ИК-ммЛПНП содержит 10% полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 («Sigma», США) в 0,01 М трис-HCl-буфере с pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;

2. Буфер-2 для растворения преципитата ИК-ммЛПНП представляет собой 0,01 М трис-HCl-буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.

Способ определения атерогенности ИК-ммЛПНП осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень холестерина и степень связывания комплемента морской свинки в ПЭГ-преципитатах путем обработки сыворотки крови Буфером-1 в соотношении 1:2,5 для преципитации ИК-ммЛПНП, инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждением преципитата центрифугированием, декантацией и последующим растворением его в исходном объеме в Буфере-2. Холестерин в ИК-ммЛПНП определяют с использованием ферментативного набора «Холестерин». Комплементактивирующую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследуют с помощью гемолитического теста с использованием комплемента морской свинки, стандартизованных (1,5×10⁸ кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15 мМ CaCl₂ (VBS²⁺).

Рассчитывают атерогенность ИК-ммЛПНП в ЕД как отношение ССК к холестерину в преципитированных иммунных комплексах, содержащих ммЛПНП. При величине атерогенности ИК-ммЛПНП менее 24 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови из-за сниженной комплементактивирующей функции IgG в ИК-ммЛПНП.

Этап 1. Определение содержания холестерина в иммунных комплексах в сыворотке крови доноров и больных с атеросклерозом каротидных артерий. Приготовление преципитата иммунных комплексов из сыворотки: к 50 мкл сыворотки крови добавляют 125 мкл буфера-1 и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием при 3100g в течение 10 мин при 23°C. Супернатант тщательно декантируют и осадок растворяют в 50 мкл буфера-2. Содержание холестерина определяют с использованием коммерческого набора «Холестерин» фирмы «ЗАО Эколаб» (Россия). Полученные результаты представлены в таблице.

Этап 2. Определение степени связывания комплемента морской свинки иммунными комплексами, содержащими ммЛПНП. К 10 мкл растворов преципитатов, разбавленных в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺, добавляют 12 мкл разбавленного 1:19 раствора комплемента морской свинки. Общий объем доводят до 0,3 мл буфером VBS²⁺ и инкубируют 20 мин при 37°C. После инкубации добавляют 200 мкл ЕА и повторно инкубируют 30 мин при 37°C. После инкубации реакцию останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугируют и определяют величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержит преципитата иммунных комплексов. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствует о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяют по формуле:

У(%)=[(X-R)/(H-R)×100],

где Н, R и X - величины оптической плотности А₄₀₅ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяют по формуле:

ССК(%)=100-У.

Полученные результаты представлены в таблице.

Этап 3. Определение атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (АИК-ммЛПНП). АИК-ммЛПНП рассчитывают в сыворотке крови обследуемых индивидуумов как отношение степени связывания комплемента к холестерину преципитированных иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (ХИК). Полученные данные представлены в таблице.

Как видно из данных, представленных в таблице, содержание ХИК в сыворотке крови здоровых доноров в 100% случаев было ниже 10 мг/дл (разброс от 2,3 до 9,2 мг/дл), в то время как ХИК в сыворотке крови неврологических больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий был в среднем в 2,5 раза выше нормальных величин и варьировал от 13,7 до 44,6 мг/дл. Степень связывания комплемента морской свинки ПЭГ-преципитатом в группе здоровых доноров была статистически значимо выше (р=0,028; t - тест Стьюдента), чем в группе больных (в среднем 62% и 42%, соответственно).

Полученные результаты по оценке атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, свидетельствуют однозначно о том, что иммунные комплексы больных с атеросклерозом каротидных артерий обладают сниженной комплементактивирующей способностью, в данном случае гетерогенного комплемента морской свинки. И, как следствие, - повышенный уровень иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, в крови у больных с атеросклерозом каротидных артерий из-за нарушения их солюбилизации и элиминации с участием аутологичной системы комплемента. Сниженная комплементактивирующая способность IgG в иммунных комплексах больных с атеросклерозом также приводит к незавершенному фагоцитозу и, как следствие, - образованию «пенистых» клеток при данной патологии.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить функциональную оценку атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, с минимальной затратой времени и средств, а также проводить широкие скрининговые обследования, диагностировать атеросклероз на доклинической стадии, прогнозировать течение атеросклеротического процесса у обследуемых в динамике. Выявление повышенного уровня ХИК при широких скрининговых обследованиях может быть предиктором атеросклероза на доклинической стадии. Доступность реагентов и простота способа определения ХИК в лабораторной практике позволяют проводить углубленное исследование патогенеза атеросклеротических заболеваний. С другой стороны, внедрение способа определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, в лабораторную практику позволит разрабатывать новые методы терапии атеросклероза и контролировать эффективность проводимого лечения.

Литература

1. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С.99-103.

2. Шойбонов Б.Б., Кравченко М.А., Шабалина А.А., Костырева М.В., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф. Оценка атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Неинфекционные заболевания и здоровье населения России» 16-17 мая 2013 г. Москва. Тез. Докладов. // Профилактическая медицина. - 2013. - Т.16, №2 (вып. 2). - С.150.

3. Burnt D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V.61, №7. - P.679-689.

4. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P.359-369.

5. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum Ann. Med. - 1989. - V.21 (6). - P.455-459.

  Содержание холестерина иммунных комплексов (ХИК), степень связывания комплемента (ССК) и атерогенность иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (АИК-ммЛПНП) в ПЭГ-преципитатах сывороток крови доноров и неврологических больных Доноры ХИК, мг/дл ССК, % АИК-ммЛПНП Больные ХИК, мг/дл ССК, % АИК-ммЛПНП 1 5,2 56 108 1 30,0 43 14 2 6,4 70 109 2 26,4 35 13 3 2,3 27 117 3 21,1 33 16 4 4,5 80 178 4 16,9 39 23 5 9,2 78 85 5 44,6 72 16 6 5,0 41 82 6 27,0 51 19 7 5,3 53 100 7 29,1 3 1 8 5,7 82 144 8 16,6 41 3 9 6,8 73 107 9 14,8 35 24 10 7,8 69 89 10 40,0 77 19 11 8,4 49 58 11 13,7 33 24 М±m 6,1±2,0 62±18 107±32 М±m 25,5±10,2 42±20 16±8

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП). Для этого преципитат ИК-ммЛПНП из сыворотки крови человека готовят путем обработки буфером, содержащим 10%-ный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350), в соотношении 1:2,5, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Агрегаты ИК-ммЛПНП осаждают центрифугированием, растворяют в буфере без ПЭГ-3350, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах (ХИК) и степень связывания комплемента (ССК) морской свинки преципитированными иммунными комплексами. Рассчитывают атерогенность ИК-ммЛПНП как отношение ССК к ХИК. При величине менее 24 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови из-за сниженной комплементактивирующей функции IgG в ИК-ммЛПНП. Использование данного способа позволяет проводить оценку атерогенности ИК-ммЛПНП, диагностировать атеросклероз на доклинической стадии, а также прогнозировать как течение атеросклеротического процесса у индивидуумов, так и эффективность проводимой терапии. 1 табл.

Способ определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины (ИК-ммЛПНП), в сыворотке крови человека путем обработки ее в течение 10 мин буфером, содержащим полиэтиленгликоль (ПЭГ), осаждением ИК-ммЛПНП центрифугированием, определением холестерина в иммунных комплексах и степени связывания комплемента, отличающийся тем, что обработку сыворотки ведут 10% раствором ПЭГ-3350 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка:ПЭГ-3350 (1:2,5), рассчитывают атерогенность ИК-ммЛПНП как отношение степени связывания комплемента к содержанию холестерина в иммунных комплексах и при величине менее 24 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови из-за сниженной комплементактивирующей функции IgG в ИК-ммЛПНП.