СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА МУТНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЗВЕСЕЙ, СТАНДАРТНЫЙ ОБРАЗЕЦ МУТНОСТИ БАКТЕРИЙНЫХ ВЗВЕСЕЙ, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ, НАБОР СОДЕРЖАЩИЙ СТАНДАРТНЫЙ ОБРАЗЕЦ МУТНОСТИ БАКТЕРИЙНЫХ ВЗВЕСЕЙ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/24 G01N21/17 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к способам получения стандартного образца мутности бактериальных взвесей.

Изобретение может быть использовано для контроля технологических параметров микробиологических производств, определения общей концентрации микробных клеток в бактерийных взвесях при производстве, контроле и сертификационных испытаниях иммунобиологических лекарственных препаратов, микробиологических исследованиях воды, при стандартизации ветеринарных бактерийных препаратов, а также в других областях экспериментальной, технической, фармацевтической и общей микробиологии.

Известен способ получения образца для визуального определения оптической плотности бактерийных взвесей (Никитин В.М. с соавт., SU 1346675 A1), состоящий в получении суспензии частиц нитроцеллюлозы в фосфатно-солевом буферном растворе. Способ включает следующие стадии: получение суспензии нитроцеллюлозы из щелочного раствора путем добавления ледяной уксусной кислоты, трехкратное центрифугирование суспензии в фосфатно-солевом буферном растворе, отделение осадка и его повторное ресуспендирование в фосфатно-буферном растворе, имеющем pH 7,2. В подготовленную суспензию добавляют мертиолят и фасуют в ампулы. Техническим результатом является повышение стабильности образца для визуального определения оптической плотности бактерийных взвесей.

К недостаткам данного способа следует отнести: использование токсичных реактивов; многократное центрифугирование для отделения суспензии нитроцеллюлозы.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбран способ изготовления из кварцевого стекла типа Пирекс жидких оптических нефелометрических стандартов, состоящий в механическом измельчении осколков стекла типа Пирекс до размеров 0,5-2,5 мкм, обработке полученной пыли в водной среде в течение 5 ч при постоянном пропускании углекислого газа, после обработки взвесь декантируют и фракционируют на центрифуге, добавляют мертиолят и фасуют в стандартные пробирки (Фихман Б.A., SU 115987 А).

К недостаткам этого известного способа следует отнести следующее: на стадии предварительной подготовки стекло подвергается вибропомолу, на стадии обработки в жидкой фазе необходимо постоянное барботирование углекислым газом жидкой фазы. Использование стадии вибропомола приводит к значительному увеличению экономических и трудовых затрат на изготовление стандартного образца мутности, а использование стадии барботирования углекислым газом при проведении шуттелирования приводит к усложнению технологического аппаратного оформления способа получения стандартного образца мутности.

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа получения стандартного образца мутности бактерийных взвесей с одновременным повышением стабильности стандартного образца.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе получения стандартного образца мутности бактерийных взвесей, включающем шуттелирование химически нейтрального боросиликатного стекла, предусмотрены следующие отличия: нет предварительной обработки стеклянных осколков для получения пылеобразной массы с размером частиц менее 3-3,5 мкм, а также не используют углекислый газ на стадии шуттелирования. Кроме того, добавление консервирующего агента (этилртутьтиосалицилат натрия), также являющегося поверхностно-активным веществом, производится до начала шуттелирования, что позволяет получить стабильную маточную микросуспензию.

Поставленная задача также решается благодаря тому, что с помощью предложенного способа получают стандартный образец мутности бактерийных взвесей, содержащий микросуспензию химически нейтрального боросиликатного стекла с размером частиц 0,5-3,5 мкм, при этом содержание частиц этой фракции составляет не менее 95%; также предусмотрено применение стандартного образца мутности бактерийных взвесей для определения количества микробных клеток в бактерийной взвеси; предложен набор, содержащий стандартный образец мутности бактерийных взвесей, пустые пробирки, паспорт стандартного образца, инструкцию по применению и сравнительную таблицу.

Сущность предложенного способа заключается в следующем:

Готовят маточную суспензию из осколков химически нейтрального боросиликатного стекла с размерами частиц 5-35 мм и бидистиллированной воды, в присутствии этилртутьтиосалицилата натрия с концентрацией 0,01% (вес); полученную смесь шуттелируют в течение 10-70 сут., после чего проводят фракционирование полученной микросуспензии частиц стекла по размерам; после фракционирования отбирают фракцию микросуспензии, обеспечивающую мутность, соответствующую международному стандартному образцу мутности ВОЗ; производят фасовку полученной микросуспензии в стандартные пробирки из химически нейтрального боросиликатного стекла.

Между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно: сокращение числа операций приготовления микросуспензии приводит к упрощению способа получения, а добавление этилртутьтиосалицилата натрия на стадии формирования маточной взвеси позволяет стабилизировать микросуспензию частиц стекла.

Изобретение позволяет получить стабильный стандартный образец мутности при уменьшении числа стадий способа получения.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Приготовление маточной взвеси

Осколки химически нейтрального боросиликатного стекла размером 5-35 мм суспендируют в растворе этилртутьтиосалицилата натрия с концентрацией 0,01% (вес.) в бидистиллированной воде. Полученную суспензию в объеме 1 дм³ помещают в колбу объемом 5 дм³, которую закрепляют в шуттель-аппарат и подвергают встряхиванию в течение 10-70 сут. Режим встряхивания составляет не менее 50-60 колебаний в минуту по 5-6 ч в сутки при амплитуде колебаний не менее 5 см.

Пример 2. Фракционирование маточной микросуспензии

Для фракционирования маточной микросуспензии по размерам частиц полученную микросуспензию после шуттелирования подвергают седиментации, в процессе которой происходит удаление крупных (более 3,5 мкм) и мелких (менее 0,5 мкм) частиц.

После завершения фракционирования отбирают фракцию микросуспензии с размерами частиц в диапазоне 0,5-3,5 мкм, при этом содержание частиц этой фракции составляет не менее 95%.

Пример 3. Получение микросуспензии с заданной оптической плотностью

Пробы микросуспензии готовят с использованием международного стандартного образца мутности ВОЗ следующим образом. Колбу с фракционированной микросуспензией тщательно встряхивают, до исчезновения осадка на дне. Затем отбирают пробы объемом 6-7 см³ и помещают в пробирку, входящую в комплект международного стандартного образца мутности ВОЗ.

Совмещают пробирки с международным стандартным образцом мутности ВОЗ и исследуемой пробой микросуспензии в вертикальном положении на уровне глаз, прикладывают плотно за ними (по отношению к оператору) сравнительную таблицу (Рис.1) и освещают источником рассеянного света таким образом, чтобы пробирки не экранировали друг друга от света. Источником света могут служить: люминесцентная лампа мощностью от 20 до 40 Вт; лампа накаливания матовая или с матовым фильтром (плафоном) мощностью от 40 до 60 Вт, а также - рассеянный дневной свет.

В случае одинаковой четкости видимых элементов сравнительной таблицы через международный стандартный образец мутности ВОЗ и пробирку с исследуемой микросуспензией мутность их считают одинаковой и равной мутности, указанной на этикетке международного стандартного образца мутности ВОЗ, а именно 10 ME. В противоположном случае изменяют концентрацию исследуемой пробы микросуспензии при помощи добавления раствора этилртутьтиосалицилат натрия с концентрацией 0,01% (вес.) в бидистиллированной воде или добавления отобранной фракции микросуспензии до совпадения мутности с международным стандартным образцом мутности ВОЗ.

Проводят измерения оптической плотности пробы микросуспензии, мутность которой соответствует 10 ME международного стандартного образца мутности ВОЗ, с помощью колориметра фотоэлектрического концентрационного КФК-3-ЗОМЗ при длине волны 540±3 нм и используя кюветы с длиной оптического пути 5 мм.

Пример 4. Стабильность микросуспензии частиц стекла

Результаты исследования стабильности значений оптической плотности микросуспензий стандартного образца мутности, приготовленных из стекла Pyrex^© (образец № 1), Symax^© (образец № 2), приведены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты измерений оптической плотности микросуспензр с целью исследования стабильности Номер измерения Временной интервал мес. Снижение значения оптической плотности в образце №1 №2 Δ OD Δ OD, % Δ OD Δ OD, % 1 1 0 0 0 0 2   0,006 1,6 0,004 1,3 3 6 0,014 3,7 0,016 3,4 4 9 0,023 6,1 0,025 5,3 5 12 0,03 8 0,031 7,1 Обозначения: Δ OD - разность значений оптической плотности исходной микросуспензии и через определенный интервал времени; Δ OD, % - значение снижения оптической плотности исходной микросуспензии, выраженное в процентах от исходного; №1 - микросуспензия, изготовленная и стекла марки Pyrex^©; №2 - микросуспензия, изготовленная и стекла марки Symax^©.

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что к концу временного интервала исследования стабильности снижение значения оптической плотности микросуспензии стандартного образца мутности не превышает 10% и соответствует допустимым отклонениям значения аттестованной характеристики, приведенным в технических условиях на изготовление комплектов стандартного образца мутности. Временной интервал исследования, в течение которого изменение оптической плотности не превышает 10%, принят в качестве срока годности стандартного образца мутности бактерийных взвесей.

Пример 5. Фасовка подготовленной фракции микросуспензии

Подготовленные пробирки помещают в штатив. Микросуспензии с оптической плотностью, соответствующей стандартному образцу мутности, разливают с помощью дозатора или градуированной пипеткой по 6 см³ в пробирку, постоянно взбалтывая колбу с микросуспензией для обеспечения равномерной оптической плотности в процессе розлива. После окончания розлива пробирки со стандартной микросуспензией запаивают и проверяют герметичность методом погружения в водный раствор метиленового синего с концентрацией 0,1% и выдерживания запаянных пробирок под избыточным давлением в объеме раствора метиленового синего (202,6×10⁵ Па) в течение временного интервала, установленного действующими нормативными документами, в частности МУК 4.1/4.2.588-96 Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям.

После проверки всех запаянных пробирок на герметичность запайки наклеивают этикетки с указанием:

- сокращенного названия предприятия;

- единиц стандартного образца мутности (5, 10, 20 ME);

- даты изготовления и срока годности.

После этикетирования формируют набор, содержащий стандартный образец мутности бактерийных взвесей.

Пример 6. Набор, содержащий стандартный образец мутности бактерийных взвесей

Набор содержит две пробирки - стандартный образец мутности 10 ME и стандартный образец мутности 5 ME, 2 пустые пробирки идентичного качества и размера пробиркам со стандартным образцом, паспорт на стандартный образец мутности, сравнительную таблицу, инструкцию по применению.

Набор помещают в картонную коробку. На этикетке коробки указывают:

- полное название предприятия-изготовителя;

- адрес, телефон;

- полное название стандартного образца;

- состав набора;

- серия и дата изготовления;

- срок годности;

- условия хранения;

- предупреждающие надписи.

Готовый набор носит наименование «Комплект ОСО мутности».

Альтернативным вариантом формирования комплекта является набор, содержащий одну пробирку стандартного образца мутности 20 ME, пробирку идентичного качества и размера пробирке со стандартным образцом, паспорт на стандартный образец мутности, сравнительную таблицу, инструкцию по применению.

Пример 7. Взаимозаменяемость химически нейтрального боросиликатного стекла разных производителей

Химически нейтральное боросиликатное стекло Pyrex^© было выбрано на основании того, что первый международный стандартный образец мутности ВОЗ изготавливался из стекла этой марки.

Поскольку стекло необходимого химического состава в настоящее время производят помимо Англии, в Германии (Duran^©) и Чехии (Symax^©), проведены сравнительные исследования микросуспензий из стекла указанных марок. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Сравнение оптической плотности микросуспензий из стекла разных марок разных марок Образцы микросуспензий Торговая марка стекла Значение оптической плотности, безразмерная величина №1 Pyrex^© 0,463±0,023 №2 Symax^© 0,462±0,021 №3 Duran^© 0,463±0,023

Значение t - критерия Стьюдента для оценки различия средних значений оптической плотности составляет t_эксп=0,066 и является меньше, чем t_табл=2,31 для числа степеней свободы к=8 и уровня значимости α=0,05. Значения F - критерия Фишера для оценки различий между дисперсиями составляет F_эксп=1,33 и является меньше, чем F_табл=6,39 для числа степеней свободы к=4 и уровня значимости α=0,05.

Применение параметрических критериев для статистической оценки достоверности различий результатов, приведенных в таблице 2, позволило сделать вывод о том, что отличия значений оптической плотности микросуспензий, приготовленных из стекла разных торговых марок, статистически незначимы.

Следовательно, стекла торговых марок Pyrex^©, Symax^©, Duran^© являются взаимозаменяемыми.

Пример 8. Применение стандартного образца мутности бактерийных взвесей

Стандартный образец мутности бактерийных взвесей, полученный описанным способом, позволяет оценить концентрацию микробных клеток в бактерийной взвеси визуальным способом.

Перед применением стандартный образец взбалтывают для гомогенизации микросуспензии.

Исследуемую бактерийную взвесь объемом 6-7 см³ помещают в пробирку, входящую в набор, при этом бактерийная взвесь должна быть гомогенной. Пробирку с бактерийной взвесью совмещают в вертикальном положении со стандартным образцом мутности на уровне глаз. Прикладывают к пробиркам сравнительную таблицу и освещают источником рассеянного света таким образом, чтобы пробирки не экранировали друг друга.

Для оценки количества микробных клеток в исследуемой бактерийной взвеси мутность последней должна быть идентична мутности стандартного образца. Идентичность оценивают визуально по степени контрастности графических элементов сравнительной таблицы (Рис.2).

Мутность стандартного образца, содержащего подготовленную микросуспензию, равную мутности 10 ME МСО ВОЗ, ориентировочно соответствует следующим концентрациям клеток в 1 мл:

0,93×10⁹ клеток/мл для микробов кишечной группы;

11×10⁹ клеток/мл для микробов коклюшной группы;

1,7×10⁹ клеток/мл для бруцеллезных микробов;

2,2×10⁹ клеток/мл для холерного вибриона;

5×10⁹ клеток/мл для туляремийных микробов.

Для стандартного образца 5 ME концентрация микробных клеток в 2 раза меньше, чем для стандартного образца 10 ME.

Для стандартного образца 20 ME концентрация микробных клеток в 2 раза больше, чем для стандартного образца 10 ME.

Таким образом, реализация заявленного способа позволяет получить стабильный стандартный образец мутности, пригодный для использования в микробиологических и технологических процессах, с наименьшими трудовыми и экономическими затратами. Аналогичным образом, с учетом раскрытия изобретения в описании, специалистом в данной области могут быть получены или выполнены другие варианты изобретения, которые охватываются формулой изобретения, приводимой ниже.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Пат. 115987 СССР, МКИ C12Q 1/00. Способ изготовления из кварцевого стекла типа пирекс жидких оптических нефелометрических стандартов / Б.А. Фихман (прототип).

2. Пат. 1346675 СССР, МКИ C12Q 1/00. Образец для визуального определения оптической плотности бактерийных взвесей / В.М. Никитин, В.А. Нахаба, Л.А. Сичинский.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложен способ получения стандартного образца мутности бактерийных взвесей, стандартный образец мутности бактерийных взвесей, применение стандартного образца мутности бактерийных взвесей, а также набор, содержащий стандартный образец мутности бактерийных взвесей. Способ включает шуттелирование химически нейтрального боросиликатного стекла без барботирования углекислым газом в присутствии этилртутьтиосалицилата натрия в течение 10-70 сут. Шуттелирование осуществляют при режиме встряхивания не менее 50-60 колебаний в минуту по 5-6 ч в сут при амплитуде колебаний не менее 5 см. После шуттелирования полученную суспензию подвергают седиментации для удаления частиц с размером более 3,5 мкм и менее 0,5 мкм. Стандартный образец мутности бактерийных взвесей содержит микросуспензию химически нейтрального боросиликатного стекла с размером частиц 0,5-3,5 мкм, при этом содержание частиц этой фракции составляет не менее 95%. Предложенные изобретения позволяют упростить способ получения стандартного образца мутности бактерийных взвесей и одновременно повысить стабильность стандартного образца. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 8 пр.

1. Способ получения стандартного образца мутности бактерийных взвесей, включающий шуттелирование осколков химически нейтрального боросиликатного стекла, отличающийся тем, что проводят шуттелирование осколков с размером частиц 5-35 мм без барботирования углекислым газом в присутствии раствора этилртутьтиосалицилата натрия с концентрацией 0,01% (вес.) в бидистиллированной воде в течение 10-70 сут при режиме встряхивания, составляющем не менее 50-60 колебаний в минуту по 5-6 ч в сут при амплитуде колебаний не менее 5 см, после шуттелирования полученную микросуспензию подвергают седиментации для удаления частиц размером более 3,5 мкм и менее 0,5 мкм.

2. Стандартный образец мутности бактерийных взвесей, полученный способом по п.1, содержащий микросуспензию химически нейтрального боросиликатного стекла с размером частиц 0,5-3,5 мкм, при этом содержание частиц этой фракции составляет не менее 95%.

3. Применение стандартного образца мутности бактерийных взвесей, полученного способом по п.1, для определения количества микробных клеток в бактерийной взвеси.

4. Набор для определения количества микробных клеток в бактерийной взвеси, содержащий пробирки со стандартным образцом мутности бактерийных взвесей, полученным способом по п.1, пустые пробирки идентичного качества и размера пробиркам со стандартным образцом, паспорт стандартного образца, инструкцию по применению и сравнительную таблицу.