СПОСОБ ПОДГОТОВКИ САПНЫХ, ТУЛЯРЕМИЙНЫХ, БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ МИКРОБОВ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИХ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОДСЧЕТОМ В ГЕМОЦИТОМЕТРИЧЕСКИХ КАМЕРАХ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/06 C12Q1/24 G01N1/28 G01N15/06 C12Q1/06 C12R1/38 C12R1/92 

Изобретение относится к способам исследования микроорганизмов микроскопическими методами, в частности к способам определения общей концентрации (живых и мертвых) микробов подсчетом под микроскопом, и может быть использовано при производстве диагностических и лечебно-профилактических бактерийных препаратов, а также при стандартизации микробных культур в процессе проведения коллекционных работ.

Известен способ подготовки микробных взвесей для подсчета в гемоцитометрах Горяева, Тома и др., состоящий в разведении исследуемой суспензии физиологическим раствором или дистиллированной водой до конечного разведения, вводимого в камеру (Б. А. Фихман. Оптическая стандартизация бактерийных препаратов. - М., Бюро научной информации, 1960).

Общим с заявляемым способом является этап приготовления из исследуемой суспензии предварительного разведения необходимой кратности.

К недостаткам данного способа следует отнести низкую точность и плохую воспроизводимость результатов подсчета. Источником ошибок являются низкая осаждаемость на дно камеры клеток многих видов бактерий, связанная с высокой седиментационной устойчивостью их взвесей в дистиллированной воде или физиологическом растворе. Присущая таким микробам подвижность в среде суспендирования, обусловленная броуновским движением либо наличием у клеток жгутиков, приводит к их перемещению из одного поля зрения в другое, что препятствует подсчету и существенно снижает его точность.

Серьезным недостатком этого способа является опасность заражения в процессе подсчета, поскольку многие патогенные микробы способны длительно сохранять жизнеспособность в физиологическом растворе и дистиллированной воде. Подсчет таких микробов приходится проводить с использованием ватно-марлевых повязок либо респиратора "Лепесток-200". Дыхание оператора через эти средства защиты вызывает запотевание окуляров, для устранения которого требуется прерывать работу и протирать линзы. Все это не способствует экспрессности и точности анализа.

Известны также способы подготовки микробных взвесей для подсчета, основанные на использовании для диспергирования клеток коллоидных растворов, способных при застывании переходить в состояние геля, например 4 %-ного водного раствора поливинилового спирта (Б.А. Фихман. Новая среда для микроскопического счета бактерий в камере. - Журн. микробиол., эпидимиол. и иммунобиол. - 1962. N 2. -С. 55- 56).

Общим с заявляемым способом является этап предварительного разведения анализируемой суспензии до необходимой концентрации клеток во взвеси.

К недостаткам данного способа следует отнести трудоемкость и сложность подсчета, поскольку микробы фиксируются образовавшимся гелем по всей глубине гемоцитометра, равной 100 мкм. В результате лишь часть клеток попадает в поле зрения микроскопа. Для подсчета остальных клеток требуется многократно перефокусировать микроскоп и просматривать каждое поле зрения по всей глубине гемоцитометра с исключением подсчитанных микробов. Указанные сложности затрудняют подсчет и существенно снижают его точность.

Недостатком данного способа является сохранение жизнеспособности многими патогенными бактериями в 4 %-ном растворе поливинилового спирта, что приводит к описанным выше последствиям.

Известны также способы подготовки взвесей бактерий для подсчета, основанные на использовании растворов химических соединений, способных снижать седиментационную устойчивость микробных суспензий. Например, жидкости, состоящей из 10 см³ спирта, 30 см³ глицерина, 60 см³ дистиллированной воды и 10 см³ спиртового раствора генцианвиолета (D. Horvath. Ein eifaches Verfahres fur Bakterien - Zahlung. - Zbl. Bakteriol., parariterl., Jnfektions Krankh. 1. Abt. Jrig., 1930, Bd 1, H.3/4, S. 238-239).

Общим с заявляемым способом является этап приготовления из исследуемой суспензии предварительного разведения необходимой кратности.

Недостатком данного метода является его низкая эффективность применительно к возбудителям сапа, туляремии и бруцеллеза. Рассматриваемая жидкость обеспечивает осаждение на дно гемоцитометров от 10 до 15% клеток указанных возбудителей. Почти половина микробов до завершения анализа (в течение 3 часов с момента приготовления взвеси) сохраняет жизнеспособность. Все это затрудняет подсчет и приводит к неприемлемой вариабельности результатов.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ подготовки микробных взвесей для подсчета под микроскопом в гемоцитометре, основанный на использовании для суспендирования микробов жидкости Калиссона, состоящей из 2 см³ соляной кислоты, 100 см³ двухлористой ртути 1:500 с добавлением 1%-ного фуксина (J. Callison. A diluting fluid for standardization of vaccinnes with the hemacytometr. - J. Med. Res. 1912. V. 27. N 2. P. 225 - 227).

Общим с заявляемым способом является этап предварительного разведения анализируемой суспензии раствором, содержащим соляную кислоту.

К недостаткам рассматриваемого способа следует отнести плохую осаждаемость в гемоцитометрах клеток возбудителей сапа, туляремии и бруцеллеза, суспендированных в жидкости Каллисона. Так, через 24 часа после введения смеси в гемоцитометр подавляющее большинство 80...90% сапных, туляремийных и бруцеллезных микробов остается во взвешенном состоянии и подвержено броуновскому движению. Кроме того, не менее половины микробов указанных видов сохраняют свою жизнеспособность в течение 3 часов после суспендирования в жидкости Каллисона. Все это является источником значительных ошибок, неприемлемых при стандартизации бактерийных препаратов, и требует соблюдения строгих мер специальной техники безопасности.

Задачей изобретения является обеспечение достаточно быстрого (в течение 1 часа с момента введения в камеру) осаждения на дно гемоцитометра большинства клеток возбудителей сапа, туляремии и бруцеллеза с одновременной их инактивацией и сохранением четкости наблюдаемой микроскопической картины. Все это необходимо для точного и экспрессного подсчета.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе подготовки взвесей клеток возбудителей сапа, туляремии и бруцеллеза для подсчета, включающем этап предварительного разведения анализируемых материалов, предусмотрены следующие отличия:
предварительная обработка микробов раствором едкого натра;
последующая обработка клеток раствором танина;
использование для приготовления окончательного разведения суспензии раствора, содержащего соляную и молочную кислоты;
выдерживание заполненного гемоцитометра в парах формалина.

Указанные отличия обусловлены следующими причинами:
седиментационная устойчивость в дисперсных средах сапных, туляремийных и бруцеллезных микробов определяется электрокинетическим потенциалом клеток, наличием у них мощных сольватных оболочек, обусловленной особой гидрофильностью биополимеров микрокапсул, и малыми их размерами (небольшой массой), что в совокупности препятствует действию гравитационных сил. Следовательно, для обеспечения осаждения микробов требуется устранить или уменьшить влияние указанных факторов. Среди этих факторов масса клеток наименее подвержена экспериментальным воздействиям, а более изменчивы электрокинетический потенциал и соль ватная оболочка;
для уменьшения гидрофильности поверхности клеток их вначале обрабатывают раствором едкого натра, обеспечивающим гидролиз биополимеров микрокапсул;
раствор танина способствует уменьшению размеров сольватной оболочки;
соляная и молочная кислоты обеспечивают pH среды, близкий к изоэлектрической точке микробов. Катионы водорода улучшают адсорбцию клеток на стекле;
соляная и молочная кислоты вызывают гибель клеток возбудителей сапа, туляремии и бруцеллеза;
выдерживание заполненного гемоцитометра в парах формалина в течение 1 часа обеспечивает обеззараживание его поверхностей, контаминирование которых могло произойти в процессе введения взвеси в камеру;
используемые растворы не вызывают лизиса клеток и их избыточной агрегации, характеризуются прозрачностью, низкими показателями светопреломления и обеспечивают высокий контраст изображения сапных, туляремийных и бруцеллезных микробов в фазово-контрастном микроскопе.

Способ включает следующие этапы:
разведение исследуемой взвеси;
введение подготовленного конечного разведения в гемоцитометр;
выдерживание гемоцитометра в камере с парами формалина для обеспечения обеззараживания и осаждения клеток.

Способ выполняется следующим образом.

Исследуемый материал разбавляют в пробирке раствором едкого натра до концентрации, соответствующей по оптической плотности стандарту мутности ГИСК имени Л.А. Тарасевича на 10 ЕД. При этом учитывают разведение материала (величина Р). Микробы в растворе щелочи выдерживают 30 минут.

Затем готовят еще два десятикратных разведения.

Одно - на растворе танина, а из него - на растворе соляной и молочной кислот. В пробирках с танином и кислотами микробы выдерживают до 5 минут. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем периодического встряхивания.

Для обработки сапных микробов используют 0,05 М раствор едкого натра и 0,15%-ный раствор танина; для туляремийных микробов - 0,001 М раствор едкого натра и 0,2%-ный раствор танина; для бруцеллезных микробов - 0,01 М раствор едкого натра и 0,5%-ный раствор танина.

Заключительную обработку микробов всех указанных видов осуществляют 0,1 М раствором соляной кислоты с добавлением к нему 4 % молочной кислоты (по объему).

Растворы всех реактивов готовят на дистиллированной воде.

Взвесь клеток из пробирки с кислотами вводят при помощи пипеток в гемоцитометр с притертым покровным стеклом. Гемоцитометры и покровные стекла предварительно тщательно промывают и протирают с целью удаления посторонних частиц, имитирующих микробные клетки.

Заполненный гемоцитометр помещают в чашку Петри. Закрывают ее крышкой, на дно которой помещают диск фильтровальной бумаги, смоченной 2...3 см³ формалина. Чашки Петри с камерами выдерживают на рабочем столе в течение 1 часа.

Для контроля отсутствия загрязнения гемоцитометров и подсчета клеток используют оптическую систему фазово-контрастного микроскопа (микроскоп МБИ-3 либо МБР, МБ-1А, "Биолам Л-211", фазово-контрастное устройство КФ-4, объектив х 20Ф, бинокулярная насадка АУ-12, окуляры х 10). Настройку микроскопа осуществляют по описанию, прилагаемому к комплекту КФ-4.

Микроскоп фокусируют на сетку Горяева, добиваясь при помощи микровинта четкого изображения микробов. Они выглядят в виде черных палочек и кокков.

Подсчитывают клетки, расположенные в больших квадратах сетки Горяева по диагонали камеры. Вначале - клетки, находящиеся в квадрате сетки, а затем, медленно поднимая тубус микроскопа микровинтом, учитывают над тем же квадратом единичные микробы, которые могут прилипнуть к нижней поверхности покровного стекла.

При анализе не считают клетки, пересекаемые нижней и левой границами квадрата. Их принимают за клетки, лежащие в соседних квадратах.

Всего требуется учесть около 500 клеток (10...12 больших квадратов).

Искомую концентрацию микробов в исследуемом материале рассчитывают по формуле

где C - концентрация клеток,
P - величина разведения материала раствором щелочи,
H - количество проанализированных квадратов,
M - количество учтенных клеток.

Для сравнения эффективности заявляемого способа и прототипа готовили разведения из одних и тех же материалов возбудителей сапа штамм Ц-5, туляремии штамм Schu и бруцеллеза штамм Br. melitensis M 16. С целью обеспечения равных концентраций клеток в конечных разведениях, вводимых в камеры, материалы в экспериментах "по прототипу" разводили таким же образом, как при заявленном способе, с той лишь разницей, что вместо предлагаемых растворов щелочи, танина, соляной и молочной кислот использовали жидкость Каллисона на всех этапах разведения. В каждом опыте анализировали по 10 полей зрения. Осаждаемость микробов характеризовали средним количеством клеток, приходящимся на один квадрат. Жизнеспособность микробов к началу подсчета оценивали методом высева на селективные питательные среды и биопробой на экспериментальных животных. Для контроля контаминации поверхности гемоцитометров делали смывы ватно-марлевыми тампонами. Полученные пробы высевали на плотные питательные среды и использовали для заражения. Микробы сапа высевали на агар, приготовленный на основе соляно-кислотного гидролизата казеина, туляремийные микробы - на основе эрититагара, бруцеллы - на кровяной агар. Для постановки биопроб в опытах с сапом, туляремией и бруцеллезом использовали соответственно золотистых хомячков, белых мышей и морских свинок. Сравнительные исследования показывают, что заявляемый способ по сравнению с прототипом, обеспечивает значительно большую осаждаемость микробов на дно гемоцитометра и их инактивацию в процессе подготовки к подсчету (табл. 1).

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами показано в табл. 2.

Предлагаемый способ подготовки взвесей клеток возбудителей сапа, туляремии и бруцеллеза для подсчета имеет следующие преимущества:
обеспечивает осаждение на дно камеры 80...90 % клеток через один час после введения подготовленного разведения в гемоцитометр. Остальные микробы адсорбируются нижней поверхностью покровного стекла; приводит к инактивации микробов указанных видов как в самой камере, так и на всей поверхности гемоцитометра, что позволяет проводить подсчет без соблюдения строгих мер защиты. Пробы анализируют вне вытяжного шкафа, без использования респираторов и ватно-марлевых повязок;
сохраняет внешнюю целостность микробов и четкость их микроскопической картины в используемой оптической системе, что в совокупности с иммобилизацией клеток на дне камеры и на покровном стекле обеспечивает условия, необходимые для осуществления подсчета под микроскопом. Выполнение анализа доступно лаборанту, имеющему навыки работы с фазово-контрастными микроскопами;
способ обеспечивает достаточную для практического применения точность подсчета, ошибка не превышает 10%, а расхождение результатов анализа между лабораториями - 12%;
затраты времени на определение общей концентрации микробов в пробе подсчетом под микроскопом составляют 2 часа с момента поступления ее в лабораторию, что позволяет охарактеризовать метод подсчета с предлагаемым способом подготовки взвесей как экспрессный.

Возможность осуществления предложенного способа показана на следующих примерах.

Пример 1. Подготовка взвесей сапных микробов для определения общей концентрации клеток в сапной вакцине.

В целях обеспечения удобного для подсчета количества клеток в одном квадрате гемоцитометра (примерно 30...80 особей) предварительно определяют оптическую концентрацию клеток в вакцине по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 единиц мутности. В исследуемой серии она равна 5 млрд. микробов/см³. Затем вакцину разводят параллельно в двух пробирках 0,05 М раствором едкого натра в пять раз. Для этого в пробирки наливают по 4,0 см³ раствора щелочи и вносят по 1,0 см³ вакцины градуированной пипеткой на 1,0 см³. Величина разведения вакцины "P" составляет 5.

Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Содержимое периодически перемешивают путем встряхивания. Через 30 минут из пробирок со щелочью готовят два ряда двух последовательных десятикратных разведений. Первое из них готовят на 0,15%-ном растворе танина, а второе - на 0,1 М растворе соляной кислоты с добавлением к ней 4% молочной кислоты. Раствор танина и кислот разливают в пробирки по 4,5 см³. Градуированной пипеткой из средней части пробирки со щелочью отбирают по 0,5 см³ содержимого и переносят в пробирку с танином. Ее закрывают ватно-марлевой пробкой, содержимое перемешивают. Из этой пробирки аналогичным образом переносят 0,5 см³ взвеси клеток в пробирку с кислотами. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Содержимое перемешивают встряхиванием.

Таким образом, для исследуемой вакцины готовят два ряда пробирок, содержащих по три параллельных пробирки.

После встряхивания из пробирок с кислотами переносят капли взвеси в гемоцитометр при помощи пипеток. В силу капиллярности жидкость с клетками затягивается в камеру. Гемоцитометр помещают в чашку Петри с фильтровальной бумагой, смоченной формалином. Через 1 час проводят подсчет.

Концентрацию клеток рассчитывают по формуле, представленной в описании, исходя из количества подсчитанных клеток, числа проанализированных квадратов и величины разведения вакцины. Из усреднения результатов двух параллельных определений устанавливают общую концентрацию клеток в вакцине.

Пример 2. Подготовка взвеси туляремийных микробов для определения их общей концентрации в культуре методом подсчета.

Предварительно определяют оптическую концентрацию клеток в культуре при помощи стандарта ГИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 единиц мутности, чтобы обеспечить последующим разведением культуры удобное для подсчета количества клеток в одном квадрате камеры (30...80 особей). Оптическая концентрация оказалась равной 15 млрд. клеток/см³. Исходя из этих данных, культуру разводят параллельно в двух пробирках 0,001 М раствором едкого натра в 15 раз. Для этого в пробирки наливают по 7,0 см³ щелочи и вносят по 0,5 см³ исследуемой культуры. Величина разведения культуры "P" составляет 15. Последующие этапы выполнения способа подготовки взвесей являются аналогичными приведенным в примере 1, с той лишь разницей, что для разведения туляремийных микробов используется 0,2 %-ный раствор танина.

Пример 3. Подготовка взвесей бруцеллезных микробов для определения их общей концентрации в культуре методом подсчета.

Подобным образом, как в примерах 1 и 2, устанавливают оптическую концентрацию клеток в исследуемой культуре. Она оказалась равной 20 млрд. клеток/см³.

Исходя из этих данных, культуру разводят параллельно в двух пробирках 0,01 М раствором едкого натра в 20 раз. Для этого в пробирки разливают по 1,9 см³ щелочи и вносят по 0,1 см³ анализируемой культуры. Величина разведения культуры составляет 20.

Последующие десятикратные разведения готовят таким же образом, как в примере 1, с той лишь разницей, что для разведения бруцеллезных бактерий используют 0,5%-ный раствор танина.

В табл. 3 представлены результаты определения общей концентрации клеток методом подсчета и количества живых микробов в культурах P. mallei, F. tularensis и Br. melitensis высевом на чашки с плотными питательными средами. Взвеси микробов перед заполнением гемоцитометров готовили по заявляемому способу.

Из табл. 3 следует, что после обработки по заявляемому способу сапные, туляремийные и бруцеллезные микробы становятся доступными для подсчета при помощи микроскопа. Установленные значения общей концентрации (живых и мертвых) бактерий превышают данные чашечного метода о количестве живых микробов. Отмеченные расхождения могут быть объяснены частичной агрегацией клеток на поверхности агара, в результате которой образование некоторых колоний происходит не из одной клетки, а из их агрегатов, а также наличием в исследованных культурах не только живых, но и мертвых особей. Живые микробы в процессе приготовления взвесей по предлагаемому способу инактивируются, поэтому при подсчете они морфологически не могут быть отделены от мертвых особей, исходно имевшихся в исследованном материале.

Изобретение предназначено для стандартизации микробных культур при производстве диагностических и лечебно-профилактических препаратов. Анализируемые микробные суспензии обрабатывают сначала растворами едкого натра. Затем готовят из них десятикратные разведения. Полученные разведения обрабатывают в течение 3-5 мин последовательно растворами танина и 0,1 М раствором соляной кислоты с добавлением 4% молочной кислоты. Обработанной микробной взвесью заполняют гемоцитометрическую камеру. Выдерживают ее в парах формалина не менее 1 ч. Для сапных, туляремийных и бруцеллезных микробов используют соответственно 0,05; 0,001; 0,01 М растворы едкого натра и 0,15; 0,2; 0,5%-ный растворы танина. Изобретение повышает точность и обеспечивает экспрессность подсчета микробных клеток. 3 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ подготовки сапных, туляремийных, бруцеллезных микробов к определению их концентрации подсчетом в гемоцитометрических камерах, включающий предварительное разведение исследуемого материала и заполнение гемоцитометрической камеры, отличающийся тем, что микробы вначале обрабатывают в течение 25 - 35 мин растворами едкого натра, затем, используя десятикратные разведения, обрабатывают в течение 3 - 5 мин последовательно растворами танина и 0,1 М раствором соляной кислоты с добавлением 4% молочной кислоты, а заполненную гемоцитометрическую камеру выдерживают в парах формалина не менее 1 ч. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сапные микробы обрабатывают 0,05 М раствором едкого натра, а затем 0,15%-ным раствором танина. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что туляремийные микробы обрабатывают 0,001 М раствором едкого натра, а затем 0,2%-ным раствором танина. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что бруцеллезные микробы обрабатывают 0,01 М раствором едкого натра, а затем 0,5%-ным раствором танина.