СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОПИОНИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N9/14 B01D15/38 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения пропионилхолинэстеразы (ПХЭ) - фермента, который может быть использован для оценки антихолинэстеразных свойств фосфорорганических и корбаматных соединений.

Известен способ получения псевдохолинэстеразы из плазмы крови лошадей, при этом разделение белковых фракций плазмы проводят высаливанием сернокислым аммонием, а выделение псевдохолинэстеразы производят фракционированием солями тяжелых металлов совместно с сернокислым аммонием (А.С. №187238 Способ получения псевдохолинэстеразы).

Недостатком данного способа является его многоступенчатость и трудоемкость процесса получения конечного продукта за счет использования при его получении солей тяжелых металлов. Кроме того, использование в качестве сырья плазмы крови лошадей не позволяет получить конечный продукт с высокой активностью.

Известен способ получения холинэстеразы из ганглиев головоногих моллюсков (Михеев Е.В. Автореферат, Комплексная технология биологически активной добавки к пище «Тинростим» и препарата холинэстеразы из ганглиев кальмаров, Владивосток, 2009). В описанном способе сублимированные ганглии кальмаров обрабатывают ферментными препаратами протеолитического действия, гомогенат центрифугируют, полученную массу очищают методом ультрафильтрации. Удельная активность полученного препарата составляет 24,7 Е/мг белка.

Недостатком данного способа является применение ферментных препаратов протеолитического действия, а также использование ультрафильтрации для очистки конечного продукта, которые значительно снижают активность холинэстеразы.

Наиболее близким аналогом по технической сущности к заявляемому техническому решению является «Способ получения холинэстеразы» (А.С. №543652 от 15.03.1974 г.) ,который заключается в гомогенизации сырья, обработке его органическими растворителями, фильтровании смеси, центрифугировании, пропускании надосадочной жидкости через хроматографическую колонку. В качестве сырья использовали ткань электрического органа ската.

Недостатком данного способа является использование в качестве сырья электрического органа ската, что не позволяет наладить промышленный масштаб производства конечного продукта, так как количество сырья очень ограничено. Кроме того, использование в качестве растворителей как органических, так и неорганических веществ, что значительно снижает выход готовой продукции. Полученный данным способом продукт является химически чистый и его можно использовать только в лабораторных условиях в научных целях.

Задачей данного изобретения является получение пропионилхолинэстеразы с оптимальной удельной активностью в промышленных масштабах.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани, включающий гомогенизацию ткани, фильтрование смеси, центрифугирование, пропускание надосадочной жидкости через хроматографическую колонку и сушку, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ в качестве исходного сырья используют ганглии головоногих моллюсков, гомогенизированное сырье подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц., полученный гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 (сырье : вода), при этом в хроматографической колонке в качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза), а перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000. При этом раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций.

Замороженное сырье нервной ткани головоногих моллюсков (ганглии) гомогенизируют и подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц. Обработка ультразвуком позволяет добиться более тонкого измельчения сырья, в результате чего большее количество фермента переходит в раствор. Гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 сырье/вода и периодически перемешивают в течение 1-2 ч и температуре 3-5°C. Затем фильтруют через капроновый фильтр или центрифугируют на центрифуге (3500 об/мин) для отделения надосадочной жидкости, которая является источником пропилхолинэстеразы. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до концентрации раствора равной 60%. Раствор оставляют на 2-4 ч для образования осадка. Осадок удаляют центрифугированием при 100000 об/мин. Надосадочную жидкость подвергают аффинной колоночной хроматографии на сорбенте. В качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза). Колонку с сорбентом уравновешивают натрий фосфатным буфером с pH 7,0. На колонку наносят количество раствора фермента, равное, в мл, свободному объему колонки. Несорбированные белковые компоненты смывают с колонки фосфатным буфером. Контроль наличия в элюате белков контролируют по величине поглощения длины волны при 280 нм.

Элюцию ПХЭ с колонки проводили 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0 с 0,5 М NaCl.

Элюированный фермент диализовали против дистиллированной воды в течение 12 ч.

Для повышения термоустойчивости фермента перед сушкой в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля в количестве 1:20 (1 мл полиэтиленгликоля на 20 мл раствора фермента) с молекулярной массой 6000, что значительно увеличивает удельную активность белка. Раствор фермента сублимировали при температуре досушивания не более 30°C.

Активность ПХЭ определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина. Количество белка определяли методом Эллмана.

В результате очистки был получен ферментный препарат с величиной удельной активности 250 ед/мг белка.

Заявляемое техническое решение соответствует критериям изобретения:

«новизна», так как для получения пропионилхолинэстеразы впервые использованы приемы обработки гомогенизированного сырья ультразвуком, а для получения ПХЭ с более высокой удельной активностью использована колонная хроматография с Con-А-сефарозой и 0,5% раствор полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000;

«промышленная применимость» - данная технология проста в исполнении и может быть применена для получения ПХЭ в промышленных масштабах.

Пример конкретного выполнения.

1 кг замороженных ганглий командорского кальмара гомогенизируют и подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц. Обработанный ультразвуком гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 сырье/вода. Гомогенат периодически перемешивают в течение 1-2 ч при температуре 3-5°C и фильтруют через капроновый фильтр для отделения надосадочной жидкости. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до конечной концентрации раствора равной 60%. Раствор оставляют на 3 ч для образования осадка. Осадок удаляют центрифугированием при 100000 об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают аффинной колоночной хроматографии на сорбенте. В качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза). Колонку с сорбентом уравновешивали натрий фосфатным буфером с pH 7,0. На колонку наносили количество раствора фермента, равное, в мл, свободному объему колонки. Не сорбированные белковые компоненты смывали с колонки фосфатным буфером.

Контроль наличия в элюате белков контролировали по величине поглощения длины волны при 280 нм. Элюцию ПХЭ с колонки проводили 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0 с 0,5 М NaCl. Элюированный фермент диализовали против дистиллированной воды в течение 12 ч.

Для повышения термоустойчивости ПХЭ перед сушкой в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля в количестве 1:20 (1 мл полиэтиленгликоля на 20 мл раствора фермента) с молекулярной массой 6000, что значительно увеличивает удельную активность белка.

Раствор фермента сублимировали при температуре досушивания не более 30°C.

Активность ПХЭ определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина. Количество белка определяли методом Эллмана.

В результате очистки был получен ферментный препарат в количестве 300 мг из 1 кг сырья) с величиной удельной активности 250 ед/мг белка.

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен способ получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани. Гомогенизируют ганглии головоногих моллюсков двукратной обработкой ультразвуком. Полученный гомогенат разводят дистиллированной водой, фильтруют смесь, центрифугируют, пропускают надосадочную жидкость через хроматографическую колонку, где в качестве сорбента используют конконавалин A-сефарозу (Con-A-сефароза), и сушат, причем перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют раствор полиэтиленгликоля. Раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C. Преимуществом изобретения является получение пропионилхолинэстеразы с оптимальной удельной активностью в промышленных масштабах. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани, включающий гомогенизацию ткани, фильтрование смеси, центрифугирование, пропускание надосадочной жидкости через хроматографическую колонку и сушку, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют ганглии головоногих моллюсков, гомогенизированное сырье подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц, полученный гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 (сырье:вода), при этом в хроматографической колонке в качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-A-сефароза), а перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют 0,5%-ный раствор полиэтиленгликоля.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C.