Способ получения эндонуклеазы рестрикции @ Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, касается способа получения эндонуклеазы рестрикции ХЬа I из биомассы Xanthomonas badrii и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии.

Цель изобретения - упрощение процесса с одновременным повышением выхода и качества целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Биомассу клеток X.badrii штамм ВКПМ В-2754 (АТСС 11672) разрушают с помощью ультразвука, затем к клеточному гомогенату добавляют концентрированную смесь поли- этиленгликоля и декстрана в калий-фосфатном буфере, рН 7,4 до конечной концентрации в смеси полиэтиленгликоля 7%, декстрана 2% и NaCI до концентрации

0,35-0,42 М. После тщательного перемешивания смеск центрифугируют при lOOOOg в течение 20 мин, верхнюю полиэтиленглико- левую фазу, содержащую целевой продукт, собирают, разбавляют буфером, приливают гепаринсефарозу, предварительно уравновешенную 10 мМ трис-HCI, рН 7.2 и этой суспензией набивают колонку (нанесение в объеме), проводят элюцию белков линейным градиентом концентрации NaCI от 0 до 0,6 М в буфере. Фракции, содержащие эндо- нуклеазу ХЬа I собирают и концентрируют диализом против 50%-ного раствора глицерина в буфере.

Выход фермента из 10 г клеток составляет 120-150 тыс.ед.акт. Хранится препарат при -20(±2)°С в течение 6 мес без снижения активности. Свободен от значительных примесей неспецифических эндонуклеаз: обраО

со

ь. |

GJ

ботка ДНК фага Т7 50-кратным избытком фермента в течение 20 ч (1000-кратный избыток) при 37°С не изменяет специфической картины гидролиза.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Все операции по очистке фермента проводят при 4±4°С.

Активность рестриктазы ХЬа I тестируют методом гидролиза ДНК фага Т7 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для постоянного специфического гидролиза 1 мкг ДНКфагаТ7втечение 1 ч 37 ±1°С.

10 г замороженной биомассы X.badrii ВКПМ В-2754 суспендируют в 20 мл 10 мМ трис-HCI, рН 7,9, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,01 М 2-меркаптоэтанола, добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1 % и обрабатывают ультразвуком при частоте 20 кГц и амплитуде 17±2 мкм несколько раз до исчезновения вязкости в биомассе, периодически охлаждая смесь для предотвращения нагревания смеси и инактивации фермента. К клеточному гомо- генату при постоянном перемешивании приливают 30 мл смеси, содержащей 21% полиэтиленгликоля и 6% декстрана, 7,88 мл 4М раствора NaCI (до конечной концентрации последних: полиэтиленгликоля 7%, декстрана 2%, NaCI 0,35 М) и 22,12 мл деионизованной воды.

Смесь продолжают перемешивать в течение 20 мин, затем центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин. Верхнюю фазу отбирают, разбавляют в / раза буфером 10 мМ трис-HCI, рН 7,2, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 10% глицерина (буфер А) и добавляют туда же 10 мл гепарин-сефарозы, предварительно уравновешенной буфером А.Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 20 мин и набивают в колонку (2,0 Х15 см). Колонку промывают 100 мл 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 10% глицерина (буфер Б), фермент элюируют линейным градиентом концентрации NaCI от 0 до 0,6 М в буфере Б. Общий объем градиента 100 мл. Скорость нанесения, промывки и элюции 15 мл/ч. Собирают фракции объемом по 3 мл и анализируют на активность ретриктазы ХЬа I. Фракции, содержащие целевой продукт, которые элюируются в диапазоне концентрации NaCI 0,3-0,4 М, объединяют(v 15 мл), переносят в диализный мешок и диали- зуют против 200 мл 50%-ного глицерина в 10 мМ трис-HCI, рН 7,4, содержащим 0,1 мМ

ЭДТА 0,5 М KCI, 0,01 М 2-меркаптоэтанола (буфер С), Время диализа 14-17 ч.

Выход фермента составляет 120 тыс. ед. акт. Концентрация фермента 24000 ед. акт./мл.

Полученный препарат эндонуклеазы рестрикции ХЬа I хранят при -20°С в течение 6 мес без снижения активности. Содержание примесей неспецифических нуклеаз в препарате оценивали двумя способами: обработкой ДНК фага 17 избытками фермента в течение длительного времени и методом рестрикция-легирование-повторная рестрикция. Установлено, что при обработке 1 мкг ДНК фага Т7 50 ед.акт. препарата рестриктазы ХЬа I в течение 20 ч при 37°С не изменяется четкая специфическая картина гидролиза. Фрагменты, получаемые при обработке 1 мкг ДНК фага Т7 30 ед. акт препарата ХЬа I в течение 17 ч при 37°С,

лигируются ДНК-лигазой фага Т4 не менее

чем на 90% и полностью специфически гидролизуются при обработке препаратом ХЬа I.

Пример 2, Эндонуклеазу рестрикции

ХЬа I выделяют из 10 г клеток аналогично

примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 9,45 мл 4 М NaCI (до конечной концентрации 0,42 М) и 20,55 мл деионизованной воды.

Примеси неспецифических эндонуклеаз

и фосфатаз в препарате не обнаруживаются.

Формула изобретения Способ получения эндонуклеазы рестрикции ХЬа I, предусматривающий разрушение клеток продуцента Xanthomonas badrli ультразвуком, фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе, содержащей 7% полиэтиленгликоля и 2% декстрана, в присутствии NaCI, хроматографическую очистку на сорбенте, уравновешенном буфером, и диализ против 50%-ного раствора глицерина, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса с одновременным повышением

выхода и качества целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Xanthomonas badrli ВКПМ-2754, фракционирование клеточного гомогената проводят в присутствии 0,35-0,42 М NaCI, хроматог5 рафическую очистку фермента осуществляют на гепаринсефарозе, уравновешенной 10 мМ трис-HCI буфером рН 7,2.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, касается способа получения эндонуклеазы рестрикции ХЬа I из биомассы клеток Xanthomonas badrii штамм ВКПМ В-2754 (АТСС 11672) и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии. Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением выхода и качества целевого продукта. Для этого биомассу Xanthomonas badrii разрушают ультразвуком, полученный клеточный гомогенат фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-ный полиэтиленгликоль и 2%-ный декстран в присутствии 0,35-0,42 М NaCI, хроматографиче- скую очистку препарата осуществляют на гепаринсефарозе путем нанесения фермента на аффинный сорбент, уравновешенный ЮмМ трис-HCI буфером с рН 7,2 с последующим концентрированием целевого продукта диализом против 50%-ного раствора глицерина. Выход эндонуклеазы рестрикции ХВа 1 составляет 12-15 тыс.ед./г биомассы. Препарат свободен от примесей неспецифических эндо-и энзонуклеаз (Л