Способ определения видовой принадлежности водных организмов Советский патент 1983 года по МПК A01K61/00 

относительную скорости гидролиза, а определение видовой принадлежности осуществляют путем сопоставления этих данных с заранее полученными аналогичными показателями,- специфич ными для каждого вида организмов. Кроме того, проводят исследовани субстратной специфичности холинэсте разы или фосфатазы, а в качестве ис точника ферментов используют гомоге наты тканей ганглиев или гонад. . Способ заключается, в следующем. .Готовят гомогенат соответствующе ткани для исследования: гомогенат оптических ганглиев Ксшьмаров для определения свойств холинэстераз и фосфатаз и гомогенат гонад для изучения свойств фосфатаз. Готовят растворы соответствующих субстратов для каждого из ферментов холиновые эфиры уксусной (ацетилхолин), припионовой (пропионилхолин) и масляной (бутилхолин) кислот для холинэстераз и фосфорные эфиры: X глицерофосфат, (Ь- глицерофосфат и фенилфосфат - для фосфотазы. Измеряют скорость гидролиза этих субстратов под действием фермента го могенатов тканей при различной концентрации субстрата, для чего, в тер мостатируемую кювету вносят последо вательно соответствующие буферные растворы, гомогенаты тканей и раств ры субстратов. Измеряют и рассчитывают кинетические параметры холинэстеразного и фосфатазного гидролизов, для чего строят график субстратной специфичности на основе измерения паталичес кой активности ферментов при различ ных концентрациях субстратов, (так называемые кривые гидролиза субстра тов - зависимость . Находят кинетические параметры гидролиза: оптимальную конттентрацию субстрата(S опт которая равна концентрации субстрата, соответствующей оптимальному значению скорости величину константы Михаэлиса(Км) максимальную скорость гидролиза(„(.,, согласно общепринятым методам ферментативной генетики из уравнения 11ихаэлиса-Ментена, и относительную скорость гидролиза (VOTM Вычисление величины относительной скорости гидролиза СVOTH) проводят из сравнения данных Уу, для каждого из субстратов, условно принимая субстрата, гидролизующегося с наибольшей скоростью, за 100%. Полученные данные являются специфичными для каждого вида кальмаров, поэтому в дальнейшем, проводят изуче ние кёшьмаров, выловленных,во время промысла или научно-исследоваТельски ми судами по данной методике, и сравнивая вновь полученные данные с уже известными, можно с точностью определить видовую принадлежность особи. Пример. Уточняли видовую принадлежность выловленного кальмара с помощью-изучения свойств холинэстеразы. Активность холинэстеразы определяли методом непрерывного потенциометрического титрования 0,02 молярным раствором NaOH кислоты, выделяющейся при гидролизе субстрата при постоянных рН 7,5 и температуре 25с в при-, сутствии 0,1 М КС 1. Контроль рН осуществляли при помощи стеклянного , электрода, подключенного к высокочувртвительному (рН 262) потенциометру. Электродом сравнения служит хлорсеребряный электрод. Постоянную температуру (25 ) реакционной среды поддерживали ультратермостатом, подсоединенным к кювете для титрования. За единицу активности (Е) принимали такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мк мох;я субстрата в минуту при стандартных условиях. Перед опытом ткань дефростировали на воздухе и гомогенизировали в таком объеме ВОДИ, чтобы конечная концентрация равнялась 10 мг/мл. В стеклянную термостатируемую кювету вносили пипеткой последовательно 1 мл 710 М фосфатного буфера с рН 7,7; 0,2 лл гомогената ткани оптического ганглия кальмара с 1 мл 1М раствора КС1, определенное количество дистиллированной воды - до общего объема пробы 10 мл с учетом добавляемого в последнюю очередь объема субстрата. Смесь тщательно перемешивали магнитной мешалкой в течение 1-2 мин, доводили рН реакционной смеси 0,02М NaOH до 7,5 и затем вносили субстрат, причем объем добавляемого раствора субстрата рассчитывали таким образом, чтобы конечная его концентрация была равна той, которая необходима для опыта. Oбpaзs oщaяcя в ходе ферментативного гидролиза субстрата кислота была оттитрована 0,-02N раствором NaOH. Щелочь добавляли в реакционную смесь из бюретки небольшими порциями (по 1 см), в котором содержалось 5,2 мкл щелочи через фиксировсшные промежутки времениН / 0,02М NaOH добавляли с таким расчетом, чтобы колебания стрелки не превышали 0,1 рН от заданной величины 7,5. Время начинали отсчитывать в момент добавления 1 см щелочи, отсчет заканчивали тогда, когда стрелка достигала заданной величины рН (7,5) . Для определения среднего значения опыт проводили 5-7 раз. Полученную среднюю величину вводили в формулу расчета удельной активности. Скорость гидролиза определяли в широком диапазоне концентрации субстратов: от до В ка честве субстратов использовали стандартные холиновые эфиры карбоновых кислот в форме иодидов, растворенных в дистиллированной воде: ацетилхолин (Ах), бутирилхолин (БуХ) , пропиони лхолин (Пх), мехолин (ацетил-(-метилхолин) и один не холиновый эфир йодметилат - ацетотиэтилпиперидинйя (ИЭМ). Кинетические параметры: константу Михаэлиса и максимальную скорость гидролиза рассчитывали по методу Лай нуивера и Берка, а удельную активность по формуле д Мщ -Ущ ЧГ удельная активность, , нормальность раствора щелочи , мк , количество 1челочи, затраченной на титрование,моль, количество анализируемого раствора фермента в реакционной смеси, мл, продолжительность ферментативной реакции, мин. При расчете скорости реакции учитывали спонтанный (самопроизвольный) гидролиз субстрата. Удельную активность ткани рассчитывали по формуле: где А - удельная активность, Е/мп, С - концентрация ткани в гомогенате, мг/мп. По полученным данным измерения скорости гидролиза при различных кон центрациях стандартных субстратов строят график субстратной специфичности (граоик №1) н находят К ёои-Ь (табл.(1). Изучение морфологических призпаков и биохимии позволили сделать вывод относительно того, что выловленный кальмар является новозеландским (Nototodarus Sloan Sloani). .Пример 2. Уточняли видовую принадлежность заловленного кальмара с помощью изучения свойств холинэстеразы по методике, описанной в примере №1. Морфологические и биохимические признаки свидетельствуют о том, что этот кальмар относится к другому виду - командорскому (Berry tenth Is ma gister) (график 2, табл. 1), Пример 3. Проводили определение видовой принадлежности кальмара с помощью фосфатаэы ганглиев. Активность фосфатазы определяли по модифицированному методу Боданско го; при котором образующиеся при гид ролизе эфиров ортофосфорной кислвты фосфаты при взаимодействии с молибдатом аммония образуют соли гетерополикислот, восстанавливающиеся амидолом до молибденовой сини, обладающей яркой синей окраской с максимумом поглощения в зоне 750 нм. Оптическую плотность молибденовой сини определяли с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-60, светофильтра 7 пря длине волны 750 нм или с помощь спектрофотометра СФ-26 при диине волны . 750 нм. Калибровочную кривую строи- ли, используя в качестве источника фосфата водный раствор .. Исходный раствор содержал в 1 мл 50 мкг Р. Количество фосфата в пробе изменяли от 2,5 до 45 мкг. За единицу активности принято такое количество фермента, которое образует при гидролизе соответствующего субстрата за 1 ч при 30 1 мкмоль Р. Перед опытом ткань дефростировали на воздухе, после чего ее гомогенизировали в 9 объемах 0,1М хлористого калия: конечная концентрация ткани мг/мл. Активность определяли в широком диапазоне рН (от 2 до 10), оторое поддерживали буфером 0,2Н глицин - 0,2Н НС1 или О ,2м Vлидин - 0,2М NaOH, содержащим для стабилизации фермента раствор хлористого магния. В качестве субстратов использовали отечест.-венные коммерческие препараты - эфиры ортофосфорной кислоты: два алифатических эфира - глицерофосфаты с различным расположением сложно-эфирной фосфатной группы, at и р, изомеры (ft- глицерофосфат натрия, oi - глицерофосфат натрия и ароматический эфир-фенилфосфат натрия. Исходные растворы субстратов - фенилфосфата натрия в концентрации 1« 10 М и oi и Р глицерофосфаты - готовили на воде (с последующим доведением р11 раствора до соответствующего для опыта значения 0,2М раствором ПС1 или 0,2м раствором NaOH). Для каждого опыта готовили 3 пробы: первая (первый контроль) контролем на самопроизвольный (спонтанный) гидролиз используемого субстрата - к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл laopt t вторая (второй контроль) является контролем на содержание фосфора в исходной ткани - к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл и 0,5 мп гомогената, третья - рабочая - к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мг гомогената.. Удельную активность измеряли при оптимальной концентрации субстратов - 3-1СГ М. Пробы инкубировали 15 мин при 30 в термостате, а затем через равные промежутки времени (1 мин) в первый контроль и рабочую пробу добавляли по 0,5 мл субстрата, предварительно нагретого до 30 и инкубировали далее все три пробы в течение 2 ч, после чего реакцию останавливали введением в каждую пробу последовательно по 0,5 мл 30%-ной трихлоруксусной кислоты через те же промежутки времени (1 мин). ,Смесь центрифугировали на настольной центрифуге ЦУМ-1 при комнатной температуре в течение 15 мин при И 5000 об/мин., после чего 0,5 мл надосадочной жидкости добавля ли к 3,5 мл воды, туда же вносили 0,6 мл 2,5%-ного раствора молибдата аммония,в 6NH4.S04 и 0,4 мп 0,5%-ного раствора амидола в 5%-гном растворе . Амидол добавляли в каждую пробу через равные промежутки времен (1 мин) с тем, чтобы через это же время после проведения инкубации в течение 20 мин провести измерение оп тлческой плотности. Скорость гидролиза () рассчитывали по формуле: число, которое показывает какую часть от общей смеси брали на фотометрирова ние после центрифугирования 0,5 МП из 2 мл смеси ) ; количество фосфора неорга нического (мкмоль), образовавшегося в процессе ферментативной реакции

Таблица 1 после вычета сумк« количества Р первого и второе, го контроля, 2 - время инкубации, ч, 0,5 - количество внесенного гомогената, мл. По данным измерения скорости гидрелиза при различных концентрациях субстратов строили график субстратной специфичности (график 3) и находили Кд ,(xSo,i,Voт,(тaбл.2). Морфологические и биологические показатели, свидетельствуют о том, что данный кальмар является новозеландским (Nototodclrus Slodni Slodnl). .Пример- 4. Уточняли видовую принадлежность кальмара по методике, описанной в примере 03. Исследования морфологических признаков и биохимии показали, что этот кальмар относится к другому виду - командорскому (BerryteuthIs moglster) график W4, табл. 2. При отличии биохимических признаков кальмара от выие приведенных констатируют, что данная особь не относится к уже изученным видам по биохикмческим признакам и имеет свой таксономический статус, а полученные для данной особи показатели будут в дальнейшем являться критериями сравнения кпя других H3y4aef«dx кальмаров. С помощью предлагаемого способа можно определять те промысловые виды кальмаров, морфологическое определение которых затруднено, что имеет большое значение в промлшениом рыболовстве в связи с запретом перелова каждого отдельного вида кальмара.

1,4

0,7

0,8 0,5 5 70

0,9

20,0

5

0,24

3

0,5 0,15

10

0,35 0,13

0,4

10 0,15

0,2

100 0,15

100

0,22

Командорский (В.magister)

100 20

Новозеландский (N.Sloan i Sloan I)

100 35 Формула изобретения 1. Способ определения видовой тфй надпежности водных организмов, преимуесественно капьмгц ов по формологий .и биохимическим П{жзнакам, включающим исследование свойств ферментов, отличающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, пов1Д11ения воспрсжзводимости результатов и точности определения, для исследования свойств ферментов готовят гомогенат тканей и растворы субстратов для ферментов, содержащих ся в этих тканях, проводят гидролиз субстратов под действием ферментов и строят кривые гидролиза - графики субстратной специфичности, по которы находят кинетические параметры гидфо лиза - оптимальиую концентргихию субстрата, константу Михаэлиса, максимальную и относительную скорости гид ролиза, а определение видовой принад лежности осуществляют путем сопостав ления этих данных с заранее полученнымн аналогичными показателями, специфичныкш для каждого вида организмов.

Таблица 2

40 0,05 0,01 0,02 11,0 26,0 25,0

58 0,085 0,03 0,05 1Q,0 40,0 22,0 2.Способ по пЛ, отличаюи и с я тем, что проводят исслед нйя субстратной специфичности зоэ- линэстераэы. 3.Способ по П.1, отличаю-, щ и и с я тем, что проводят исследования субстратной специфичности, фосфатазы. 4.Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что для исследования использукгг гомогенаты тканей ганглиев и гонад. Источники информации, . принятые во внимание при экс1юртизе 1.Рычков Ю.Г. Особенности серологической дифференциации народов Сибири. Вопросы антропологии, 1965, 21, с. 18-33. 2.Логвиненко Б.М. и Кодолова О.П. О возможности дифференцирования видов двухстворчат1;1х моллюсков путем сравнения электрофореграмм м лцечных воднорастворикых белков. ЗоологичесКИЙ журнал, L 50, б, 1971, с. 923925.

Нобозеландскай кальмар

3I1

- ig концентрации cyScmpama Фиг.1

Командорский кальмар

3Z

ig КОНЦ ентраи uu cyffстрата Ax Ax Фиг.1

|ш

3

r°

|вв

3 itO

...

НоЬозеландский

32,521.5I

Отрицательный логарифн концентрации cyScmpama

Фиг.3