СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ТЛИ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/16 

Изобретение относится к биохимии, в частности к получению бутирилхолинэстеразы из гомогената персиковой тли. Фермент, получаемый предлагаемым способом, может быть использован для оценки антихолинэстеразных свойств фосфорорганических и карбаматных соединений.

Известные способ получения частично очищенной бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади.

Недостатком этого способа является то, что бутирилхолинэстераза выделяется методом высаливания сернокислым аммонием.

Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ выделения и частичной очистки бутирилхолинэстеразы злаковой тли.

Недостатком этого способа является метод подготовки биоматериала, наличие большого числа операций, использование непрочного сорбента для гель-хроматографии, длительность и трудоемкость операций.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа получения бутирилхолинэстеразы из нового источника - персиковой тли, Myzus persicarеSulz, а также уменьшение его трудоемкости.

Цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу можно получить частично очищенную растворимую форму бутирилхолинэстеразы персиковой тли.

Сущность предложенного способа заключается в том, что персиковая тля Mezus persicae Sulz является широким полифагом в отличие от злаковых и многих других видов тлей. Ее можно легко разводить в лабораторных условиях на различных и декоративных растениях, что способствует получению большого количества биомассы насекомых - смесь самок и личинок разных возрастов. Биомасса тлей лиофилизируется в лабораторном лиофилизаторе с целью увеличения концентрации бутирилхолинэстеразы в исходном материале. Высушенную тлю растирают в ступке, получают однородный порошок, который хранят в закрытых крышками бюксах и эксикаторе. Используют по мере необходимости. Из порошка при помощи гомогенизатора на натрийфосфатном буфере готовится гомогенат, соотношение ткани и растворителя 1: 15 мас. /объем. Отфильтрованный через капрон гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге в жестком режиме для отделения растворимых форм холинэстеразы от мембраносвязанных. Полученный надосадок является источником растворимой формы бутирилхолинэстеразы персиковой тли. Надосадочную жидкость используют для гельфильтрации на колонке, заполненной сефадексом С-75, сорбентом, удобным для работы, прочным и легко регенерируемым. Элюция энзима проводится тем же буфером. Полученные активные фракции объединяются и лиофилизируются. Выход активности 63,8% от исходной в гомогенате; выход белка 16,7 % . Удельная активность растворимой бутирилхолинэстеразы персиковой тли 0,1 мкмоль/мин. мг белка. После лиофилизации активность фермента снижается на 10% ; при хранении в течение 1 года при 4^оС активность энзима снижается на 50% .

Поскольку указанные отличительные признаки отсутствуют у прототипа, предлагаемое техническое решение отвечает критерию "новизна".

Способ очистки растворимой формы бутирилхолинэстеразы тли известен: в предлагаемом способе очистку растворимой формы бутирилхолинэстеразы производят из другого источника методом колоночной хроматографии, но с использованием прочного, удобного для работы и регенерируемого сорбента, что обеспечивает получение 3-4-кратно очищенный бутирилхолинэстеразы персиковой тли с удельной активностью 0,1(мкмоль)мин. мг белка.

Таким образом предлагаемое техническое решение соответствует критерию "существенные отличия".

Изобретение поясняется фиг. 1-2.

П р и м е р. С 1 м² листьев свеклы, картофеля и др. растений получают 18-20 г биомассы тлей (смесь самок и личинок разных возрастов), которую помещают в бюксы с закрытыми крышками; бюксы ставятся в морозильную камеру при -4^оС и хранят для накопления достаточного количества биоматериала. Замороженную тлю лиофилизируют. Лиофилизацию проводят в чашках Петри в лабораторном лиофилизаторе типа ОЕ 950 (Венгрия) в течение 24 ч при температуре плиты 40^оС. Высушенную тлю растирают в охлажденной ступке и получают однородный порошок в количестве 8,5-10 г. Порошок можно хранить длительное время в закрытых бюксах и эксикаторе при 4^оС, используя по мере надобности.

Для приготовления гомогената на 0,05М натрийфосфатном буфере рН 7,5 в соотношении 1: 15 мас/объем 2,6 г порошка смешивают с 36,4 мл буфера и гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с пришлифованным пестиком при скорости его вращения 200 об/мин. Для удаления грубых частиц гомогенат фильтруют через капрон.

Для разделения растворимой формы БуХЭ от мембраносвязанной гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге типа Spinco L7-55 при 100000g, в течение 1 ч. Надосадочная жидкость содержит 2-кратно очищенную БуХЭ с удельной активностью 0,0373 мкмоль/мин. мг белка.

Частичная очистка БуХЭ персиковой тли выполнялась методом жидкостной хроматографии на колонке размером 360х25 мм, заполненной прочным и удобным для работы сорбентом, который можно использовать многократно - сефадексом G-75 (фирма Pharmacia Швеция), уравновешенной 0,05М натрий-фосфатным буфером рН 7,5. Высота столбика геля 260 мм. Элюция БуХЭ проводилась тем же буфером со скоростью 30 мл/ч. Для обеспечения равномерной скорости протекания буфера через колонку использовался перистальтический насос S_-31 (Польша).

На колонку наносится 25 мл надосадка. Первая фракция, соответствующая свободному объему, равна 50 мл; объем последующих 12 фракций одинаково, по 5 мл.

На фиг. 1 представлена кривая элюция БуХЭ персиковой тли. Фермент появляется уже во второй фракции и пик его активности совпадает с выходом основной массы белка: фракции с 2 по 8.

В табл. 1 представлены данные по выделению и частичной очистке БуХЭ персиковой тли из надосадка. Фракциям 2-8 принадлежит 63% от исходной активности БуХЭ гомогената. Выход белка 16% . Степень очистки БуХЭ - 3-4-кратная, удельная активность 0,1 мкмоль/мин. мг белка. Активные фракции объединяются, лиофилизируются и используются для различных целей.

Для коррекции данных в табл. 2 представлен баланс белка и активности БуХЭ персиковой тли при ее выделении и частичной очистке на колонке с сефадексом G-75. Сходимость результатов удовлетворительная. Данный сорбент характеризуется стабильностью, удобством в работе и возможностью многократного использования. Кривые элюции белка и активности по повторным экспериментам близки между собой, что дает возможность рассчитать средние показатели и их отклонения.

Изучены каталитические свойства БуХЭ персиковой тли. Установлено, что рН-оптимум имеет широкие пределы - от 6,75 до 8,25. При изменении температуры в диапазоне от 4 до 50^оС потери активности энзима не наблюдается. Энзимный препарат БуХЭ персиковой тли относительно стабилен: после лиофильной сушки наблюдается потеря активности фермента на 10% , а при хранении в холодильнике при 4^оС в течение 1 года активность снижается на 50% .

В отличие от БуХЭ теплокровных растворимая БуХЭ персиковой тли, подобно БуХЭ злаковой тли, катализирует гидролиз только двух тиохолиновых субстратов: с наибольшей скоростью БуТХ (V = 2,0 ± 0,12 мкмоль/мин. мг белка) и в два раза меньше - ПрТХ (V = 1,0 ± 0,075 мкмоль/мин. мг белка). Константы Михаэлиса, К_м соответственно равно 0,08 ± 0,089М по БуТХ и 0,01 ± 0,0015М по ПрТХ.

Растворимая БуХЭ персиковой тли чувствительна к эзерину К_п = (6,72 ± 0,49) ˙ 10⁴ М^-1 мин^-1 и ДФФ - К_п = (4,72 ± 0,5). 10⁴ М^-1 мин^-1. В отличие от БуХЭ теплокровных БуХЭ тли малочувствительная ко многим другим тестовым ингибиторам: ГД-7, ГД-42, ГТ-165 и ГТ-231. Низкая ингибирующая активность в отношении БуХЭ персиковой тли катион-содержащего ингибитора ГД-42 и его бескатионного аналога ГД-7 свидетельствует об отсутствии анионного пункта на активной поверхности этого энзима и отличает его от типичных холинэстераз. Подобным свойством обладает и БуХЭ злаковой тли.

Представленные данные свидетельствуют о том, что растворимую БуХЭ персиковой тли можно классифицировать как ацилгидролазу ацилхолинов КФ 3.1.1.8.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение эстеразных фракций, обнаруженных методом диск-электрофореза в препарате, содержащем 3-4-кратно очищенную растворимую БуХЭ персиковой тли. Видим, что БуХЭ тли катализирует гидролиз двух тиохолиновых субстратов: с наибольшей интенсивностью БуТХ и меньшей - ПрТХ, Rf, соответственно , равны 0,19 ± 0,02 и 0,175 ± 0,01. Фермент оказался гомогенным; он выявлен только в одной молекулярной форме, с невысокой электрофоретической подвижностью. В энзимном препарате выявлено 4 эстеразных фракции, катализирующих гидролиз альфа-нафтилацетата. Одна из них с Rf 0,18 ± 0,03 соответствует БуХэ тли. Вторая, третья и четвертая эстеразные фракции имеют Rf соответственно 0,295 ± 0,02, 0,48± 0,03 и 0,585 ± 0,02. Растворимая БуХЭ персиковой тли, гидролизующая БуТХ, ПрТХ, альфа-нафтилацетат, полностью ингибируется 1˙ 10^-4М эзерином и нечувствительна к 1˙ 10^-5М ГД-42.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить 3-4-кратно очищенную растворимую форму бутирилхолинэстеразы персиковой тли, КФ 3.1.1.8, с удельной активностью 0,1 мкмоль/мин. мг белка. Выход активности фермента от исходной активности гомогената 63,8% выход белка 16,7% . Фермент, получаемый предлагаемым способом, может быть использован для оценки антихолинэстеразных свойств фосфорорганических и карбаматных соединений.

Баланс белка и активности БуХЭ персиковой тли при очистке на колонке с "сефадексом G-75" (среднее из 6 повторений) приведен в табл. 2. (56) Авторское свидетельство СССР N 944338, кл. С 12 N 9/18, 1981.

Моралев С. Н. Выделение и свойства холинэстераз злаковой тли Schizaphis gramina Rond в связи с проблемой избирательности действия пестицидов". Диссертация на соискание ученой степени к. б. н. Санкт-Петербург 1983.

Использование: биохимия и может быть использовано для оценки антихолинэстеразных свойств фосфорорганических и карбаматных соединений. Сущность изобретения: способ включает получение растворимой формы путем ультрацентрифугирования гомогената с последующей очисткой фермента методом гельфильтрации на колонке с сефадексом G-75. В качестве источника энзима используют персиковую тлю, биомассу тли лиофилизируют, а частичную очистку растворимой формы бутирилхолинэстеразы тли выполняют методом гельфильтрации с использованием прочного и регенерируемого сорбента - сефадекса G-75. 2 ил. , 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ТЛИ, предусматривающий приготовление гомогената из замороженной биомассы тли, получение растворимой формы фермента центрифугированием гомогената с последующей частичной очисткой фермента гельфильтрацией на колонке с сефадексом и лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, в качестве источника фермента используют персиковую тлю, замороженную биомассу тли лиофилизируют, а очистку ведут на колонке с сефадексом G-75.