Способ выделения гликозидаз Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗИДАЗ розу, вьздепшот 5-кратно очшценную ft «галактозидазу из экстракта E. с вы ходом 6О%. Однако известный способ выделения и очистки гликозидаа методом гидрофобной хроматографии на пропиламиноагарозе не пгэзволяет одновременно вьщелить полный набор гликозидаз из лизата E.co.Ei а йа от возможность, получить только один пре ставитель этого класса ферментов - -галактоаидазу. Вьщеленный препарат уЗ галактозидазы не является однородным, а содержит дополнительно два друг11х белка, что снижает эффективность выделения и степень очистки. Кроме того, используемый сорбен-г, пропиламиноагароза, не пригоден для многократного применения лабильности N -ацилзамещенной имидокарбонатной группы в присутствии сильных нуклеофильных буферных систем, использование которых необходимо для регенерации сорбента. , Целью изобретения-является разработка нового способа выделения и очистки гликозвдаз методом гидрофобной хроматрграфин для одновременного получения пол ного набора этих ферментов, псфышения их ферментативной активности и чистоты. Для достижения указанной цели гликозидазы вьщеляют из объекта животного происхождения (печень морского молюска Acmaea pa&Kida ) с использованием в качестве избирательного гидрофобного сорбента 2-М -бензоютамидогептиламино- -4-окси-симм-триазинилагарозы. П оследнюю получают несложным четырёхстадийным синтезом через ежтивацию сефарозы 4В трихлортриазином. Высокая избирательность связывания и большое сродст во гликозидаз к 2-N -бензиламидогептил амино-4-окси-сймм триазиннлагарозе (10-15 мг ферментов на 1 мл сорбента/ ПОЗ.ВОЛЯЮТ методом гидрофобной хроматографии одновременно вьщелить полный набор этих ферментов и осуществить их ЗО-кратную очистку непосредственно из экстракта тканей животного происхождения с выходом 62%. Предлагаемый способ, вьщеления гликоаидаз методом гидрофобной хроматогра- фии, позволяющий проводить одновременное вьщеление полного набора гликозидаз с высокой ферментативной активностью и чисготой, заключается в том, что экстракт ферментов из объекта животного происхож дения (печень морского моллюска Асгтюеа paeEida ) подвергают хроматографии на 2-N -бe зoIшaмидoгeптилa fинo-1-оксн -симм-триазинилагарозе. Предпочтительно процесс выделения гликозидаз из указанного объекта проводить следующим образом. Адсорбцию гликозидаз на 2-N -бензоиламидогентиламино-4-окси-симМ-гриазинилагарозе ведут в О,О5 М фосфатном буфере, рН 4,0 6,5, желательно рН 5, а элюацию ферментов с хроматографической колонки осуществляют с использованием 50%-ного раствора этиленгликоля в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0, содержащего 1 М хлористый натрий. Органический растворитель (этиленгликоль) и избыток хлористого натрия из препарата гликозидаз уда-ляют гель-фильтрацией препарата на сефа- дексе Г-50. Пример. Гидрофобная хроматография. 7 г сырой печени Морского моллюска Астаео paBPida гомогенизируют в 35 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 5,0. Осадок центрифугируют при 6000 об/мин и отбрасывают. Надосадочную жидкость подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 4,0 при 0,2-1,, выдерживают 10-15 мин при этой температуре и выпавшие белки удаляют центрифугированием. Полученные 30 мл экстракта гликозидаз (107 мг ферментов с удельной активностью 0,34 ед/мг по п -нитрофенил-N-ацетил - /3 D г;1юкозаминиду) доводят до рН 5,0 и хроматографируют на колонке- с -бензоипамидогептипамино-4-окси-сймм- триазинилагарозой. Раствор гпикозйдаз пройускают через колонку (0,8 х X 1О см)с гидрофобным сорбентом, промывают исходным буфером до полного удаления несорбированного белка, а затем раст вором этиленгликоля с линейным градиентом (0- 45% по объему) в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0. Гликозидазы элюируют с колонки 50%ным раствором этиленгликоля в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0, содержащем 1 М хлористый натрий. Обессоливание и удаление органического растворителя. Во избежание инактива ции гликозидаз элюированный раствор ферментов, быстро хроматографируют на колонке с сефадексом Г-5О, уравновешенной. , 0,05 М фосфатным буфером, рН 5,0. Характеристика препарата гликозидаэ. Таким образом выделяют 4,8 мг гликоэидаз с удельной активностью по п нит рофенил« Ы «сщегил -В-глюкозаминиду

56532056

ВД ец/мг ирн 25С, выход 62%. Гликози- альиых гликолнтИческих ферм«нгои, как и даэы, очишенпые этим методом 30 раз,в исходном экстракте, что видно из прчсодержаг такое же количество индивиду-веденной табЛ1щы.

Соотношение гликозидаз в экстракте и препарате