СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДЕЛИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-НЕАКТИВНЫХ МАКРОФАГОВ В УСЛОВИЯХ "in vitro" Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Макрофаг является ключевой клеткой в инициации и развитии иммунного ответа. Именно с его открытием связано начало развития и формирования иммунологии как науки. Макрофаг определяет стратегию организма по отношению к его реагированию на тот или иной антиген. В настоящее время известно, что действие исследуемого препарата на макрофаги зависит от его изначального функционального состояния. Последнее может быть определяющим в решении вопроса о наличии или отсутствии у него тех или иных иммуномодулирующих свойств. Это состояние влияет не только на величину исследуемой у макрофага активности, но и на ее «знак» (активация или депрессия). В связи с этим крайне важным является выбор тест-системы для выявления тех или иных свойств у предполагаемого иммуномодулятора. В большинстве случаев для таких исследований используются резидентные перитонеальные макрофаги. Однако давняя история их использования выявила у них ряд недостатков. Во-первых, из брюшной полости одной мыши их можно выделить всего от 500 тысяч до 1 миллиона (для проведения одного теста на фагоцитоз или противоопухолевую активность этого иногда крайне недостаточно). Положение значительно осложняется, когда эксперимент проводится в стерильных условиях: в среднем на один эксперимент порой уходит от 7 до 20 мышей, поскольку это становится затратным и трудоемким; во-вторых, резидентные макрофаги фенотипически не отличаются хорошими функциональными способностями, например: а) способностью к фагоцитозу довольно крупных тест-частиц, поэтому исследователи начинают использовать в экспериментах очень маленькие частицы, которые порой визуально трудно идентифицировать, что приводит к увеличению трудоемкости и некомфортности работы с ними; б) неспособностью отвечать на некоторые общеизвестные активаторы макрофагов, например MAF (макрофаг активирующий фактор). Еще большие трудности встречает экспериментатор при работе по выделению резидентных макрофагов печени и легких (добавляется кропотливая препаративная работа по выделению вначале самого органа, а затем процедура выделения из них соответствующих клеток с использованием ферментных препаратов); в-третьих, не исключено, что выделенные резидентные макрофаги в организме животного уже находились в условиях измененной функциональной активности (латентная инфекция или продромальный период). Учитывая эти недостатки резидентных макрофагов, большинство исследователей используют в своих экспериментах элиситированные с помощью различных воспалительных агентов (протеозо-пептон, тиогликолят натрия, минеральное масло, крахмал, акриламидные бусы, вакцину БЦЖ и так далее) перитонеальные макрофаги, иначе говоря, они прибегают к искусственной стимуляции притока в брюшную полость большого количества функционально активных макрофагов.

Безусловно, это позволяет экспериментатору сразу решить две задачи: а) получить с одной мыши в несколько раз большее количество макрофагов; б) получить макрофаги с выраженной функциональной способностью. Однако сегодня накоплено достаточно данных, которые позволяют сделать вывод о том, что все перечисленные воспалительные агенты изменяют функциональное равновесие макрофага, а полученные с их использованием экспериментальные данные требуют переосмысления. В настоящий момент самым идеальным способом для получения функционально-интактных макрофагов является выращивание последних из моноцитов крови в присутствии GM-CSF (Andreesen R, Scheibenbogen C, Brugger W, Krause S, Meerpohl HG, Leser HG, Engler H, Löhr GW. Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating blood monocytes: a new approach to cancer immunotherapy. Cancer Res. 1990 Dec 1; 50(23):7450-6). Однако этот метод неплохо зарекомендовал себя только в работе с моноцитами крови человека, выделить достаточное количество моноцитов от экспериментальных животных проблематично и крайне трудоемко, и поэтому этот метод не нашел своего широкого применения в работе с экспериментальными животными. Использование моноцитов крови человека также является трудоемким и затратным. Кроме того, дифференцировка моноцитов в макрофаги требует большей длительности культивирования: 7-9 дней.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что функционально неактивные макрофаги получают из воспалительных макрофагов, элиситированных в брюшную полость животного введением либо гранул крахмала, либо раствора протеозо-пептона, подвергая их процессу длительного (96 часов) культивирования. Последнее позволяет функционально разбалансированному макрофагу катаболизировать воспалительный раздражитель и вновь приобрести функциональные характеристики, предшествующие моменту введения биодеградабельного ирританта.

Предлагаемый способ предусматривает несколько стадий.

В основе способа получения перитонеальных макрофагов лежит давно известная общепринятая методика (Hogg N, Parish CR. Surface antigens of the murine cytostatic peritoneal macrophage. Immunology. 1980 Sep; 41(1):187-93). По этой методике в качестве элиситирующего агента используют 4% картофельный крахмал (прокипяченный и автоклавированный), который вводится в брюшную полость мыши в объеме 1 мл. В предлагаемом способе крахмал лишь доводят (на 3-5 секунд) до состояния кипения, не прибегая к автоклавированию, - это не позволяет раствору крахмала превращаться в гель, который проявляет значительно меньшие ирритантные свойства. Добавленная стадия быстрого замораживания (-20°C) имеет целью приостановить процесс гелеобразования. Перед непосредственным применением раствор крахмала подвергают гомогенизации (в стеклянном коническом гомогенизаторе), для того чтобы гранулы крахмала стали однородными по размеру и свободно проходили через иглу шприца.

1) Приготовление 4% суспензии крахмала.

В коническую термостойкую колбу заливают 250 мл забуференного физиологического раствора и доводят его до кипения. В отдельном стаканчике с 50 мл забуференного раствора (при комнатной температуре) готовят суспензию крахмала, предназначенную для получения 4% раствора крахмала в 300 миллилитрах забуференного раствора. Затем при постоянном помешивании приготовленную суспензию выливают в колбу с кипящим раствором. Дождавшись первых признаков кипения (образование пузырей сопровождающиеся характерным «потрескивающим» звуком), быстро разливают по флакончикам (по 10 мл), поместив немедленно последние в морозильную камеру (-20°C), чтобы избежать процесса гелеобразования. Использовать такую суспензию лучше через несколько дней, но можно и через сутки.

2) Получение элиситированных перитонеальных макрофагов.

Размороженную суспензию 4% крахмала гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе до тех пор, пока суспензия свободно не будет ресуспендироваться шприцем с насаженной иглой для внутримышечного введения. Затем по 1 мл такой суспензии быстро (гранулы крахмала быстро оседают) вводят внутрибрюшинно мыши с весом примерно 25 грамм и более. После введения суспензии необходимо помассировать брюшко в течение нескольких секунд. Через 4 суток мышь забивают декапитацией, чтобы обескровить тушку. Затем с области брюшка снимают шкурку. Далее шприцем с объемом в 10 мл через мышцы бедра вводят очень холодный забуференный физиологический раствор (либо раствор любой питательной среды для культивирования клеток). После 1 минуты интенсивного массирования (взбалтывания) наполненного раствором брюшка пальцем руки начинают откачивать жидкость, предварительно введя в брюшную полость 1-2 мл воздуха, вводя иглу вдоль мышц бедра. Для выделения большего количества макрофагов желательно повторить эту процедуру дважды. Откаченную жидкость заливают в центрифужные пробирки и откручивают при 1000 об/мин в течение 7 минут. Такой способ позволяет получить от одной мыши от 15 до 25 миллионов макрофагов, а это в несколько раз превышает их количество, получаемое с помощью вышеупомянутой оригинальной методики.

3) Для получения перитонеальных макрофагов элиситацией раствором протеозо-пептона за 4 дня до выделения из брюшной полости перитонеальных макрофагов мыши внутрибрюшинно вводят 1 мл стерильного 10% раствора протеозо-пептона (Difco). Далее по вышеописанной методике.

4) Все тесты проводят в 24-луночных планшетах фирмы «Linbro». Клетки перитонеального эксудата в концентрации 800 тысяч в 1 миллилитре (именно такая плотность клеток является оптимальной для процесса распластывания макрофага по поверхности лунки от воздействия активирующего агента) ресуспендируют в культуральной среде RPMI 1640 с добавлением: 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 тМ L-глютамина, 10 mM HEPES-буфера, 5×10-5 M 2-меркаптоэтанола и 80 мкг/мл гентамицина. В каждую лунку заливают по 1 мл суспензии. После чего закрывают крышкой и оставляют в ламинаре (не сдвигая с места) на 10 минут для того, чтобы макрофаги равномерно осели и распределились по поверхности лунки (равномерность распределения клеток контролировать на инвертированном микроскопе). Основным критерием должно быть наличие между рядом расположенными и уже распластанными макрофагами расстояния, примерно равного диаметру одной клетки (около 15 микрон), так как через несколько часов эти макрофаги, распластываясь, будут увеличиваться в размерах. Через 60 минут инкубирования в инкубаторе с 5% CO₂ и температуре 37°C промывают каждую лунку 2 мл теплой среды RPMI 1640 для удаления неприлипаюших клеток. Затем лунки вновь заливают полной культуральной средой и планшет вновь помещают в CO₂-инкубатор на 4 суток. Только по прошествии этого времени можно приступать к исследованию влияния какого-либо агента на функциональную активность макрофага, ибо этого времени хватает ему, чтобы полностью метаболизировать гранулы крахмала и вернуться в исходное функциональное состояние.

В качестве испытуемого вещества авторы использовали известный активатор многих функций макрофага - МАФ (макрофаг-активирующий фактор), действующим началом которого является гамма-интерферон (Yoshimura Fukazawa, Keiko Kagaya, Hiroshi Miura, Takako Shinoda et al. Biological and biochemical characterization of macrophage activating factor (MAF) in murine lymphocytes: physicochemical similarity of MAF to gamma interferon (INF-γ). Microbiol. Immunol. V.28 (6), 691-702, 1984). Последний получали, используя общепринятую методику (Satoshi Muto, Akihito Yamasaki, Naoyuki Yamamoto and Hidetaka Yuki. Rapid effect of lymphokines on macrophage activities determined by measuring chemiluminescence. Chem. Pharm. Bull. - V.33. - Р.4041-4044, 1985). Время обработки монослоя макрофагов 10% раствором МАФ составляло 48 часов. В качестве исследуемых функций взяли Fc-зависимый фагоцитоз эритроцитов барана, определямый спектрофотометрическим способом (Rummage J.A and Leu R.W Photometric microassay for quantitation of macrophage Fc and C3b receptor function // J. Immunol. Meth. http://-1985.-v.77. - P.155-163) и продукцию супероксидного радикала, которую оценивали с помощью реакции восстановления п-нитросинего тетразолия (Amano D., Kagosaki G., Usui Т. Inhibitory effects of superoxide dismutases ans various other proteins on the nitroblue tetrasolium reduction by phagizitizing guinea pig polymorphonuclear leucocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1975. - V.1. - Р.272-279).

Полученные результаты показали следующее.

Таблица 1.

  Макрофаги, элиситированные протеозо-пептоном Макрофаги, элиситированные крахмалом Показатель 48 часов 144 часа 48 часов 144 часа Реакция восстановления p-нитросинего тетразолия ↓ 16.7% (P<0,05) ↑ 60.5% (P<0,01) ↓ 65% (P<0,01) ↑ 14.9% (P<0,05) Fc-зависимый фагоцитоз ↓ 17.2% (P<0,05) ↑ 19.1% (Р<0,05) ↓ 38.1% (P<0,01) ↑ 70.8% (P<0,01)

Через 48 часов экспозиции с MAF свежевыделенных элиситированных макрофагов отмечалась достоверная (P<0.01) супрессия Fc-зависимого фагоцитоза на 38% по сравнению с контролем, с такой же достоверностью проявлялась супрессия продукции супероксидного радикала, достигавшая разницы с контролем в 47%. По прошествии 96 часов интактного культивирования был добавлен 10% MAF (конечная концентрация). После экспозиции с активатором вновь были определены величины исследуемых ранее функций. Результаты экспериментов выявили у MAF уже активирующие свойства на Fc-зависимый фагоцитоз и продукцию супероксидного радикала с достоверностью P<0,01.

Поскольку процесс прилипания иногда может привносить в функциональное состояние макрофага свои коррективы, например отмечено значительное снижение базальной (не стимулированной) продукции супероксидного радикала у макрофагов, подвергшихся процессу длительного культивирования, то предлагаемый способ следует проводить в планшетах с гидрофобными свойствами поверхности пластика.

Основными преимуществами такого способа получения функционально неактивных макрофагов являются:

а) дешевизна;

б) снижение трудоемкости;

в) способность полученных макрофагов проявлять значительно большее число активностей по сравнению с резидентными перитонеальными макрофагами, что указывает на высокую степень их дифференцировки;

г) количество полученных с одной мыши функционально интактных макрофагов в несколько десятков раз превышает количество резидентных макрофагов;

д) предлагаемая модель позволяет более объективно и дифференцированно (в динамике процесса трансформации функционального состояния) подойти к исследованию свойств различных иммуномодулирующих агентов.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано получения функционально неактивных макрофагов из перитонеального экссудата мыши. Для этого используют функционально-активные воспалительные макрофаги, полученные при введении в брюшную полость животного воспалительного агента, в качестве которого используют крахмал или протеозо-пептон. Причем суспензию крахмала предварительно доводят до кипения и немедленно замораживают. Перед применением размораживают, гомогенизируют и ресуспендируют для внутрибрюшинного введения. Полученные перитонеальные макрофаги подвергают культивированию в течение 96 часов. Использование данного способа позволяет получить в условиях «in vitro» функционально неактивных или покоящихся (resting) макрофагов, близких по своим свойствам к резидентным, и способ может быть использован в скрининговых работах для выявления иммуномодулирующих свойств у различных по происхождению агентов. 1 табл.

Способ получения функционально неактивных макрофагов из перитонеального экссудата мыши, отличающийся тем, что используют функционально-активные воспалительные макрофаги, полученные при введении в брюшную полость животного воспалительного агента, в качестве которого используют крахмал или протеозо-пептон, причем суспензию крахмала предварительно доводят до кипения и немедленно замораживают, а перед применением размораживают, гомогенизируют и ресуспендируют для внутрибрюшинного введения; полученные перитонеальные макрофаги подвергают культивированию в течение 96 часов.