Способ лечения злокачественных опухолей суспензией нейтрофилов, обработанной вне организма ( EX VIVO) гелеобразующими препаратами λ- или k-каррагинана Российский патент 2024 года по МПК A61K31/731 A61K35/15 A61P35/00 

Область техники.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине.

Уровень техники.

Ранее было показано, что различные виды каррагинанов при введении их непосредственно в живой организм либо внутрибрюшинным , либо внутривенным способом могут проявлять противоопухолевые свойства ( 1,2,3,4,5,6,7)

Сходными признаками с прототипами способа является , то что действующий агент - каррагинан, введенный в организм животного либо вутривенно либо внутрибрюшинно, также способен проявлять противоопухолевую активность.

Недостатками способов- прототипов является то, что гель каррагинана вводят на прямую в организм животного, а поскольку это гель (плохо растворимое в воде вещество, ибо молекулы каррагинана не растворяются в воде , а лишь набухают в ней) то применение его в экспериментальных условиях еще допустимо, а в клинических категорически запрещено! Введенный таким образом гель каррагинана непосредственно входит в контакт с биохимическими и форменными элементами крови, а также с эндотелиальной стенкой сосудов, вызывая всевозможные крайне нежелательные побочные эффекты - это нарушение в системе свертывания крови (фибринолиз, тромбоз) , нефротоксичность, тромбоз мелких сосудов сердца и легких, последние возникают от осаждения каррагинана на стенках мелких сосудов кровоснабжающих эти органы (8,9,10). Кроме того, при в вышеупомянутых прототипах используются значительно большие дозировки препарата, чем в предлагаемом способе, что само по себе является неоспоримым преимуществом как с экономической так и токсикологической точек зрения.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является: снижение токсичности, затратности, минимизирование используемых доз и связанных с этим побочных эффектов, решение проблемы растворимости препарата и наконец получение реальной возможности к инициации начала клинический испытаний препарата.

Осуществление изобретения

Тест на противоопухолевую активность.

В эксперименте были использованы мыши (CBA x C57Bl/6) F1 в возрасте 6 месяцев. Тестировался препарат k- каррагинан и λ- каррагинан.

1-й Этап. Получение суспензии каррагинин- обработанных нейтрофилов.

За 10 часов до выделения каррагинан- обработанных нейтрофилов в брюшную полость мыши вводили 1,0 мл 10% раствора протеозо-пептона с целью элиситации (вызова из кровеносного русла в брюшную полость чистой популяции нейтрофилов в ответ на введение туда воспалительного агента каким и является раствор протеозо-пептона). Через 7 часов после введения указанного раствора в брюшной полости скапливается достаточное количество нейтрофилов и именно в это время в брюшную полость вводилось 1,5 мл забуференного физиологического раствора содержащего гель (в дозе 400мкг/мл, растворение проводилось в кипящей водяной бане при 100°С) k- или λ- каррагинана и в течении последующих 3 часов в брюшной полости происходила обработка нейтрофилов указанными препаратами, то есть, фактически, происходило поглощение ( фагоцитоз ) нейтрофилами макромолекул каррагинана.

Выделение и отмывка из брюшной полости каррагинан- обработанных нейтрофилов.

По истечении времени процесса обработки (3 часа) в брюшную полость мыши внутрибрюшинно вводили 10 миллилитров забуференного физиологического раствора охлажденного до 4 °С , затем наполненное раствором брюшко мышки подвергали 1 минутному интенсивному массированию (для смыва нейтрофилов со стенок брюшной полости). Далее, с помощью шприца откачивали перитонеальную жидкость с находящимися в ней каррагинан -обработанными нейтрофилами. Полученную таким образом клеточную суспензию с остатками нефагоцитированного каррагинана сливали в центрифужные пробирки для последующего их центрифугирования при1500 об\мин в течении 8 минут (отмывка). По окончании центрифугирования супернатант сливали и находящийся на дне пробирки осадок ресуспендировали в 10 миллилитрах охлажденного физиологического раствора и вновь проводили центрифугирование пробирок, чтобы отмыть клетки от остатков геля каррагинана (такую процедуру проводили троекратно). Таким образом, суспензия каррагинан -обработанных нейтрофилов была готова к использованию. Далее суспензию клеток доводили до нужной концентрации нейтрофилов для последующего ее использования в противоопухолевом тесте.

2-й Этап.

Схема эксперимента с внутрибрюшинным введением каррагинан- обработанных нейтрофилов.

А) Контрольная группа-1 (на интактный рост опухоли) - вводили 30 000 клеток мышиной меланомы В16 в обьеме 0,3 мл внутрибрюшинно.

Б) Контрольная группа-2 ( на влияние интактных нейтрофилов на рост опухоли) - внутрибрюшинно вводили суспензию клеток состоящую из 30000 клеток мышиной меланомы В16 + 12млн нейтрофилов в общем обьеме 0,3 мл.

В) Опытная группа -1(влияние λ-каррагинан- обработанных нейтрофилов на рост опухоли) - внутрибрюшинно вводили суспензию клеток состоящую из 30000 клеток мышиной меланомы В16 + 12 ⋅ 10⁶ λ-каррагинан- обработанных нейтрофилов.

Г) Опытная группа-2 (влияние k-каррагинан- обработанных нейтрофилов на рост опухоли) - внутрибрюшинно вводили суспензию клеток состоящую из 30000 клеток мышиной меланомы В16 + 12 ⋅ 10⁶ k-каррагинан- обработанных нейтрофилов.

Таблица. Влияние k- и λ - каррагинан-обработанных нейтрофилов (КОН) на рост мышиной меланомы В16 в брюшной полости. Контроль - 1
(меланома В16)
(мг) Контроль - 2
(нейтрофилы)
(мг) Опыт -1
(меланома В16 + k-КОН)
(мг) Опыт -2
(меланома В16 + λ-КОН)
(мг) 1081 ± 366 855 ± 55 146 ±94 * 130 ± 117* * - Р < 0.001

Данные таблицы указывают на наличие достоверного противоопухолевого влияния обоих исследованных видов карргинанов на рост мышиной меланомы В16, так, k-каррагинан- обработанные нейтрофилы подавляли рост меланомы в 7,4 раза, а λ-каррагинан -обработанные нейтрофилы в 8,3 раза.

Схема эксперимента с внутриселезеночным введением каррагинан- обработанных нейтрофилов

А) Контрольная группа-1 (на интактный рост опухоли) - вводили 30 000 клеток мышиной меланомы В16 в обьеме 0,3 мл внутриселезеночно.

Б) Контрольная группа-2 ( на влияние интактных нейтрофилов на рост опухоли) - внутриселезеночно вводили суспензию клеток состоящую из 30 000 клеток мышиной меланомы В16 + 12млн нейтрофилов в общем обьеме 0,3 мл.

В) Опытная группа -1(влияние λ-каррагинан- обработанных нейтрофилов на рост опухоли) - внутриселезеночно вводили суспензию клеток состоящую из 30 000 клеток мышиной меланомы В16 + 12⋅10⁶ λ-каррагинан- обработанных нейтрофилов в общем обьеме 0,3 мл.

Г) Опытная группа-2 (влияние k-каррагинан- обработанных нейтрофилов на рост опухоли) - внутриселезеночно вводили суспензию клеток состоящую из 30000 клеток мышиной меланомы В16 + 12 ⋅ 10⁶ k-каррагинан- обработанных нейтрофилов в общем обьеме 0,3 мл.

Таблица 2. Влияние k- и λ-каррагинан-обработанных нейтрофилов (КОН) на вес мышиной меланомы В16 в селезенке. Контроль-1
веса опухоли
(3000 клеток меланомы В16)
(мг) Контроль-2 веса опухоли
(нейтрофилы +3000 клеток меланомы В16)
(мг) Опыт
(меланома В16 + k-КОН)
(мг) Опыт
(меланома В16 + λ-КОН)
(мг) 54 ± 16 46 ± 22 5 ±6 * 1 ± 12* * - Р < 0.01

Данные Таблицы 2 также указывают на наличие достоверно выраженного противоопухолевого эффекта у обоих видов каррагинанов, которые практически полностью подавляли рост мышинной меланомы В16 в селезенке мышей - опухоленосителей.

Список литературы

1) Patent number 5,541,166 . Jul. 30,1996. Inventors: Christopher R. Parish, Macquarie; John M. Snowden, Leeming, both of Australia “sulphated polysaccharides having anti-metastatic and/or antlinflammatory activity”.

2) R. L. Wu and R. Kearney. «Effect of carrageenan on the non-specific resistance of mice to injected syngeneic tumour cells, alone or in mixtures». Br. J. Cancer (1979) 39, 241

3) Gefei Zhoua,b,c, YuePing Sunc, Hua Xinc, Yuna Zhangc, Zhien Lia, Zuhong Xua,*

4) In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus. Pharmacological Research 50 (2004) 47-53

5) Souza RB, Frota AF, Silva J, Alves C, Neugebauer AZ, Pinteus S, Rodrigues JAG, Cordeiro EMS, de Almeida RR, Pedrosa R, Benevides NMB (2018) In vitro activities of kappa-carrageenan isolated from red marine alga Hypnea musciformis: antimicrobial, anticancer and neuroprotective potential. Int J Biol Macromol 112:1248-1256

6) Huamao Yuana, Jinming Songa,*, Xuegang Lia, Ning Lia,b, Jicui Daia,b immunomodulation and antitumor activity of k-carrageenan

Oligosaccharides. Cancer Letters 243 (2006) 228-234.

7) T. Sakemi, A. Kuroiwa* & K. Nomoto

Effect of carrageenan on the induction of cell-mediated cytotoxic responses in vivo. Immunology 1980 41297

8) (A. W. Thomson and P. H. Whiting*A comparative study of renal and hepatic function in sprague-dawley rats following systemic injection of purified carrageenans (kappa, lambda and iota). Br. J. exp. Path. (1981) 62, 207

9)P. R. M. Steele and J. R. lowes* A histopathological study of the effects of intravenously administered lambda carrageenan in the mouse, with particular reference to the macrophage system .Br. J. exp. Path. (1979) 60, 358). )

10) R. J. L. Davidson, J. G. Simpson, P. H. Whiting*, J. I. Milton and A. W. Thomson

Haematological changes following systemic injection of purified carrageenans (kappa, lambda and iota). Br. J. exp. Path. (1 981) 62, 529-639

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способу получения суспензии каррагинан-обработанных нейтрофилов против мышиной меланомы В16. Способ получения суспензии каррагинан-обработанных нейтрофилов против мышиной меланомы В16 заключается в том, что: вводят мыши внутрибрюшинно воспалительный агент; через 7 часов после введения воспалительного агента внутрибрюшинно вводят 1,5 мл забуференного физиологического раствора геля 400 мкг/мл k- или λ-каррагинана для обработки нейтрофилов в течение 3 часов; внутрибрюшинно вводят 10 мл забуференного физиологического раствора, охлажденного до 4°С, затем наполненное раствором брюшко мышки подвергают 1-минутному интенсивному массированию; шприцем откачивают перитонеальную жидкость; отмывают каррагинан-обработанные нейтрофилы с использованием центрифугирования при 1500 об/мин в течение 8 минут, далее осадок ресуспендируют в 10 мл охлажденного физиологического раствора и вновь проводят центрифугирование для отмывания клеток от остатков геля каррагинана. Вышеописанный способ позволяет получить суспензию нейтрофилов с заданными свойствами. 2 табл.

Способ получения суспензии каррагинан-обработанных нейтрофилов против мышиной меланомы В16, заключающийся в том, что: вводят мыши внутрибрюшинно воспалительный агент; через 7 часов после введения воспалительного агента внутрибрюшинно вводят 1,5 мл забуференного физиологического раствора геля 400 мкг/мл k- или λ-каррагинана для обработки нейтрофилов в течение 3 часов; внутрибрюшинно вводят 10 мл забуференного физиологического раствора, охлажденного до 4°С, затем наполненное раствором брюшко мышки подвергают 1-минутному интенсивному массированию; шприцем откачивают перитонеальную жидкость; отмывают каррагинан-обработанные нейтрофилы с использованием центрифугирования при 1500 об/мин в течение 8 минут, далее осадок ресуспендируют в 10 мл охлажденного физиологического раствора и вновь проводят центрифугирование для отмывания клеток от остатков геля каррагинана.