АЛКИНИЛФОСФИНОВЫЕ ЗОЛОТОМЕДНЫЕ КОМПЛЕКСЫ КАК ЛЮМИНИСЦЕНТНЫЕ МЕТКИ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ Российский патент 2015 года по МПК C07F1/08 C07F1/12 C07F9/547 G01N21/64 

Изобретение относится к области химии металлорганических соединений, в частности к гетерометаллическим золотомедным комплексам, которые проявляют люминесцентные свойства и могут быть использованы в качестве меток для флуоресцентной микроскопии и в люминесцентном анализе. Изобретение может найти применение в аналитической химии, молекулярной биологии, биотехнологии, фармакологии и медицине для анализа in vitro.

В настоящее время известны комплексы переходных металлов (далее КПМ), которые проявляют люминесцентные свойства и используются в качестве меток в флуоресцентной микроскопии [1]. Такие комплексы обладают рядом преимуществ, по сравнению, например, с метками на основе органических люминофоров: их люминесценция характеризуется большими Стоксовыми сдвигами и большими временами жизни возбужденного состояния. Большой Стоксовый сдвиг упрощает разделение сигналов люминесценции и возбуждающего излучения и уменьшает самотушение в растворе. Большее время жизни возбужденного состояния люминесцентных КПМ позволяет, используя регистрацию времени затухания свечения образца (FLIM, fluorescence life time imaging), отсекать автофлюоресценцию биологических образцов, и тем самым повышать контрастность изображения и чувствительность детектирования.

Для практического применения наиболее интересны комплексы, способные к специфическому связыванию с определенными биомолекулами или клеточными структурами, и одним из типов меток на основе КПМ являются метки для ковалентного связывания белками [2].

К существенным недостаткам используемых в настоящий время меток на основе КПМ относится то, что люминесценция подавляющего большинства таких люминофоров подвержена тушению молекулярным кислородом и в присутствии воздуха квантовый выход люминесценции уменьшается на порядок по сравнению с дегазированным раствором.

Известны золотомедные алкинилфосфиновые комплексы, которые по решаемой технической задаче являются наиболее близкими к заявляемому изобретению и принятые в качестве прототипа [3]. Общее с заявленным изобретением является то, что комплексы-прототипы обладают интенсивной люминесценцией, микросекундными временами жизни и люминесценция комплексов незначительно снижается в присутствии кислорода.

Недостатком известных комплексов является относительно узкая область их применения за счет нерастворимости их в воде и физиологических средах, а также невозможности связывания их с белками.

Техническим результатом заявляемого изобретение является расширение области применения за счет возможности связывания с белками. Важным при этом в заявляемом изобретении является сохранение интенсивной люминесценции, в том числе и при наличии молекулярного кислорода.

Указанный технический результат достигается тем, что алкинилфосфиновые золотомедные комплексы, диссоциирующие в растворе с образованием ионов, способны образовывать ковалентные аддукты с аминогруппами, в частности с аминогруппами белков

что позволяет использовать их в качестве люминесцентных меток для флуоресцентной микроскопии.

Сущность заявляемого изобретения поясняется примерами конкретной реализации, которые иллюстрируются Фиг. 1-5.

На Фиг. 1 представлена схема синтеза комплекса [AuC₂C₆H₄-4-COONC₄H₄O₂].

На Фиг. 2 представлена схема синтеза комплекса [Au₂(С₂С₆Н₄-4-COONC₄H₄O₂)₂ PPh₂C₆H₄PPh₂].

На Фиг. 3 представлена схема синтеза комплекса [Au₆Cu₂(С₂С₆Н₄-4-COONC₄H₄O₂)₆(PPh₂C₆H₄PPh₂)₃](PF₆)²._.

На Фиг. 4 и 5 представлены спектры люминесценции.

Заявляемое изобретение было апробировано в Санкт-Петербургском государственном университете в режиме реального времени, и результаты апробации приведены в виде конкретных примеров.

Пример 1.

Комплекс [Au₆Cu₂(C₂C₆H₄-4-COONC₄H₄O₂)₆(PPh₂C₆H₄PPh₂)₃](PF₆)₂.

Комплекс [AuC₂C₆H₄-4-COONC₄H₄O₂] (Фиг. 1). К суспензии 0.45 ммоль комплекса [Au(тетрагидротиофен)С1] в 2 мл ацетона добавляли раствор 0.56 ммоль 2,5-диоксопирролидин-1-ил-4-этинилбензоата в 2 мл ацетона и 10 капель триэтиламина, после чего реакционную смесь перемешивали в темноте до образования белого осадка. Осадок отделяли центрифугированием и промывали водно-этанольной смесью 1:1 по объему, этанолом и пентаном. Выход 97%.

Комплекс [Au₂(C₂C₆H₄-4-COONC₄H₄O₂)₂PPh₂C₆H₄PPh₂] (Фиг.2). В раствор 0.15 ммоль 1,4-бис(дифенилфосфино)бензола в 5 мл дихлорметана добавляли 0.32 ммоль [AuC₂C₆H₄-4-COONC₄H₄O₂] и перемешивали до полного растворения осадка, затем добавляли 2.5 мл толуола, после чего раствор пропускали через колонку с нейтральным алюмогелем и отгоняли растворитель. Выход 65%.

Комплекс [Au₆Cu₂(C₂C₆H₄-4-COONC₄H₄O₂)₆(PPh₂C₆H₄PPh₂)₃](PF₆)₂ (Фиг.3) (1)

К раствору 0.33 ммоль [Au₂(C₂C₆H₄-4-COONC₄H₄O₂)₂PPh₂C₆H₄PPh₂] в 3 мл дихлорметана добавили 0.22 ммоль [Cu(NCMe)₄]PF₆ и перемешивали реакционную смесь до образования желто-оранжевого раствора, после чего этот раствор пропустили через целиты, отогнали растворитель и перекристаллизовывали методом газофазной диффузии пентана в ацетон. Выход 81%. ³¹P ЯМР (D[6]-ацетон): 44.4 (с, 6Р), -144.8 (септ 2Р, PF₆, J_PF 712 Гц). 1Н ЯМР (D[6]-ацетон): 8.00 (дм, J_HH=7.2 Гц, J_PH 13 Гц, 24Н, Н-орто), 7.85 (м, 12Н, {P-C₆H₄-P}), 7.67 (т, J_HH 7.4 Гц, 12Н, Н-пара), 7.51 (дд, J_HH 7.4 Гц, 24Н, Н-мета), 7.56 (д, J_HH 8.3 Гц, 12Н, C₆H₄), 7.05 (д, J_HH 8.3 Гц, 12Н, C₆H₄), 2.95 (с, 24Н, CH₂CH₂). ESI-масс-спектр (m/z): 2060 (М²⁺).

Пример 2.

Комплекс синтезированный, как описано в примере 1, с использованием 1-этинил-4-изотиоционатобензола в качестве ацетиленового лиганда.

³¹Р ЯМР (D[6]-ацетон): 44.6 (с, 6Р), -144.8 (септ 2Р, PF₆, J_PF 712 Гц). 1Н ЯМР (D[6]-ацетон): 7.87 (дм, J_HH=7 Гц, J_PH=13 Гц, 24Н, орто-Н), 7.58 (м, 24Н, {P-C₆H₄-P}, пара-Н), 7.41 (м, 24Н, мета-Н), 6.67 (д, J_HH=7.4 Гц, 12Н, С₆Н₄), 6.56 (с, J_HH=7.4 Гц, 12Н, С₆Н₄).

Пример 3.

Комплекс синтезированный, как описано в примере 1, с использованием 4-этинилбензальдегида в качестве ацетиленового лиганда.

³¹Р ЯМР (D[6]-ацетон): 44.9 (с, 6Р), -144.8 (септ 2Р, PF₆, J_PF 712 Гц). 1Н ЯМР (D[6]-ацетон): 9.83 (с, 6Н, СНО), 8.02 (дм, J_HH=7.2 Гц, J_PH 14 Гц, 24Н, Н-орто), 7.88 (м, 12Н, {Р-С₆Н₄-Р}), 7.67 (т, J_HH 7.4 Гц, 12Н, Н-пара), 7.49 (дд, J_HH 7.4 Гц, 24Н, Н-мета), 7.35 (д, J_HH 8.4 Гц, 12Н, C₆H₄), 7.02 (д, J_HH 8.4 Гц, 12Н, С₆Н₄).

Для комплексов (1)-(3) были измерены фотофизические свойства, а именно: при комнатной температуре были измерены электронные спектры поглощения и спектры люминесценции, а также определены времена жизни возбужденного состояния и квантовые выходы люминесценции (таблица 1). Соединения (1)-(3) демонстрируют высокие квантовые выходы люминесценции и времена жизни люминесценции в диапазоне 2.4-3.3 мкс, аналогично свойствам прототипа.

Таблица 1 Фотофизические свойства комплексов Соединение Растворитель λ_погл, нм λ_возбуд, нм λ_эмисс, нм τ, микросек Квантовый выход, % 1 2 3 4 5 6 7 (1) CH₂Cl₂ 265, 300 пл, 317, 350 пл, 409 330, 350 пл, 408 570 3.3 50 Ацетон 353 пл, 408 331, 414 580 3.0   Боратный буфер 265, 348, 412 300, 330, 403 580 0.5 (36%), 3.4 (64%)   1 2 3 4 5 6 7 (2) CH₂Cl₂ 267, 316, 355 пл, 410 310, 345, 407 596 2.4 23 (3) CH₂Cl₂ 266, 324, 338 пл, 360, 414 265, 335, 358 пл, 411 584 2.5 54

Было продемонстрировано, что комплексы (1)-(3) способны образовывать ковалентные конъюгаты с белками. Синтез конъюгатов осуществляли в 0.01 М Na-боратном буферном растворе, pH 8.4, в течение 1 часа. Удаление несвязавшейся метки осуществляли методом гель-хроматографии с использованием в качестве стационарной фазы геля Сефадекс-G75. В таблице 2 представлены результаты получения конъюгатов белков, а именно соевого ингибитора трипсина (СИТР), сывороточного альбумина человека (ЧСА), антител к ЧСА. При этом получающиеся конъюгаты являются растворимыми в воде и буферных растворах, в отличие от исходных меток.

Таблица 2 Мольные соотношения белок/комплекс при образовании конъюгатов Белок Мольное соотношение белок/комплекс, взятое для получения конъюгата Мольное соотношение белок/комплекс в полученном конъюгате (1) (2) (3) СИТР 1:3 1.0:1.3 1.0:2.1 1.0:1.7 СИТР 1:5 1.0:1.9 1.0:3.2 1.0:2.9 ЧСА 1:3 1.0:1.3 1.0:1.8 1.0:1.8 ЧСА 1:5 1.0:2.1 1.0:3.2 1.0:3.3 Антитела к ЧСА 1:5 1.0:2.6 1.0:3.3 1.0:3.0 Антитела к ЧСА 1:7 1.0:3.4 1.0:4.5 1.0:4.0 Антитела к ЧСА 1:10 1.0:4.8 1.0:6.7 1.0:6.0

При образовании ковалентных конъюгатов с белками спектры люминесценции меток практически не изменяются. Для примера на Фиг.4 представлены спектры люминесценции свободного комплекса (1) и его конъюгатов с белками. На Фиг.4: 1 - комплекс (1) в ацетоне, 2 - конъюгат 1-ЧСА в боратном буфере, 3 - конъюгат 1-антиЧСА в боратном буфере и 4 - конъюгат 1-СИТР в боратном буфере.

Как для меток-прототипов, люминесценция комплексов (1)-(3) не претерпевает существенного уменьшения в присутствии кислорода. Для примера на Фиг.5 представлены спектры люминесценции конъюгата (1) с ЧСА в дегазированном (кривая 1) и аэрированном (кривая 2) растворах.

Белки при образовании конъюгатов с комплексами также сохраняют свою структуру и биологическую активность, что было продемонстрировано на примере образования специфического комплекса «трипсин-ингибитор трипсина» и модельной реакции гидролиза трипсином специфического субстрата 4-нитроаналида N-бензоил-L-тирозина в присутствии нативного СИТР и СИТР меченного комплексами (1)-(3). Константы ингибирования были определены по методу Диксона и представлены в таблице 3.

Таблица 3 Константы ингибирования при использовании СИТР и его конъюгатов с комплексами Форма ингибитора Константа ингибирования (Ki), нМ Нативный СИТР 88 Конъюгат СИТР комплексом (1) 220 Конъюгат СИТР комплексом (2) 160 Конъюгат СИТР комплексом (3) 145

Константы Михаэлиса и удельные активности фермента реакции гидролиза представлены в таблице 4.

Таблица 4 Удельные активности и константы Михаэлиса для ферментативного гидролиза в присутствии СИТР и его конъюгатов с комплексами Ферментативный гидролиз Константа Михаэлиса (К_М), мМ Удельная активность, мкмоль/(мин·мг) Без ингибитора 0.37 1.01 В присутствии СИТР 0.34 0.54 В присутствии конъюгата 0.36 0.62 СИТР с комплексом (1)     В присутствии конъюгата 0.35 0.58 СИТР с комплексом (2)     В присутствии конъюгата 0.34 0.56 СИТР с комплексом (3)    

Полученные данные свидетельствуют о том, что ковалентное прикрепление меток (1)-(3) к белку не мешает его специфическому связыванию с аффинным партнером.

Технико-экономическая эффективность заявленного изобретения состоит, как показывают результаты приведенных примеров конкретной реализации, в существенном расширении области применения заявленных комплексов в качестве метки для флуоресцентной микроскопии за счет возможности связывания с белками. Важным при этом в заявляемом изобретении является сохранение интенсивности люминесценции при наличии молекулярного кислорода.

Заявленные комплексы проявляют люминесценцию с высоким квантовым выходом и микросекундными временами жизни. Люминесценция комплексов не подвергается существенному тушению кислородом воздуха, то есть заявленные комплексы демонстрируют люминесцентные характеристики не хуже прототипа. Существенное преимущество предлагаемых комплексов по сравнению с прототипом заключается в том, что они способны образовывать ковалентные конъюгаты с белками, переходя при этом в водорастворимую форму. При этом не наблюдается ни существенного изменения люминесценции комплекса, ни потери белком биологической активности, что позволяет использовать данные комплексы в качестве специфических меток в люминесцентном анализе и флуоресцентной микроскопии.

Список использованных источников информации

1. K.K.-W. Lo, A.W.-T. Choi, W.H.-T. Law. // Dalton Trans. 2012. V.41. P.6021-6047; Q. Zhao, C. Huang, F. Li. // Chem. Soc. ReV. 2011. V.40. P.2508-2524; V. Fernandez-Moreira, F.L. Thorp-Greenwood, M.P. Coogan. // Chem. Commun. 2010. V.46. P.186-202; K.L. Haas, K.J. Franz. // Chem. Rev. 2009. V.109. P.4921-4960; F.L. Thorp-Greenwood. // Organometallics 2012. V.31. P.5686-5692.

2. E. Ferri, D. Donghi, M. Panigati, G. Prencipe, L. D′Alfonso, I. Zanoni, C. Baldoli, S. Maiorana, G. D′Alfonso, E. Licandro. // Chem. Commun. 2010. V.46. P.6255-6257; K.W. Hubel, B.E. Henri // US 3280017 (A) 1966-10-18], иридия [D.-L. Ma, H.-J. Zhong, W.-C. Fu, D.S.-H. Chan, H.-Y. Kwan, W.-F. Fong, L.-H. Chung, C.-Y. Wong, C.-H. Leung. // PLoS ONE 2013. V.8. P.e55751], платины [D.R. McMillin, J.J. Moore. // Coordination Chemistry Reviews 2002. V.229. P.113-121; J.F. Hainfeld, F.R. Furuya, R.D. Powell // US 2005130207 (A1) 2005-06-16], а также комплексов лантаноидов [S. Mizukami, T. Yamamoto, A. Yoshimura, S. Watanabe, K. Kikuchi. // Angew. Chem. Int. Ed. 2011. V.50. P.8750-8752; K.N. Raymond, S. Petoud, S. Cohen, J. Xu // EP 1154991 (A1) 2001-11-21.

3. Koshevoy I.O. и др. Intensely luminescent alkynyl - Phosphine Gold(l)-Copper(l) complexes: Synthesis, characterization, photophysical, and computational studies // Inorg. Chem. 2009. T.48. №5. С.2094-2102 (прототип).

Изобретение относится к области химии металлорганических соединений, в частности к алкинилфосфиновым золотомедным комплексам, диссоциирующим в растворе с образованием ионов

.

Алкинилфосфиновые золотомедные комплексы способны образовывать ковалентные конъюгаты с белками, переходя при этом в водорастворимую форму, проявляют люминесцентные свойства и могут быть использованы в качестве меток для флуоресцентной микроскопии и в люминесцентном анализе. 5 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Алкинилфосфиновые золотомедные комплексы, диссоциирующие в растворе с образованием ионов

в качестве люминесцентной метки для флуоресцентной микроскопии.