СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ У БЕРЕМЕННЫХ ВО 2-3 ТРИМЕСТРЕ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и найдет использование для своевременного выявления нарушений свертывающей системы крови и выбора адекватной акушерской тактики.

Оптимальный уровень трансплацентарного обмена, рост и развитие плода в значительной степени зависит от функционирования системы крови при беременности (Персианинов Л.С., Демидов В.Н., 1977; Аршавский И.А., Железнякова Е.В., 2003), однако существующие данные литературы не учитывают характер изменений в этой системе, происходящих на фоне гестации с позиции полового диморфизма.

Особый интерес для клинического акушерства представляет изучение особенностей тромбоцитарного звена гемостаза, в связи с его патогенетической «вовлеченностью» в целый ряд акушерских осложнений (плацентарная недостаточность, ЗРП, гестоз второй половины беременности), а также, увеличившимся в последние годы, титром тромбоцитопатий (Каширина Т.Н., Макацария А.Д., Мищенко А.Д., Нестерова С.Г., 1982; Зазерская И.Е., 1991.; Алуятдинова О.С., Смирнова Л.М., Брагинская С.Г., 1999; Ascarelli М.Н., Emerson E.S., Bigelow C.L., Martin J.N., 1998).

В связи с вышеизложенным значительный интерес представляет изучение особенностей системы крови и кислотно-щелочного состояния материнского организма на различных этапах физиологической беременности с учетом полового диморфизма и на их основе выявление предикторов акушерских осложнений.

Известен способ прогноза развития геморрагических осложнений в родах по данным системы гемостаза (патент РФ №2156469, 20.09.2000), отличающийся тем, что во второй половине беременности, а именно во II триместре, на основании информативных признаков гемостазиограмм, а именно тромбинового времени, концентрации фибриногена, с помощью метода распознавания образов определяют значение функции F по формуле

F=0,96А-0,042Б-2,51,

где А - концентрация фиброногена в плазме, г/л,

Б - тромбиновое время, с,

при значении функции F больше 0,31 прогнозируют физиологическую кровопотерю, при значении функции F меньше -0,27 прогнозируют патологическую кровопотерю в родах, значение функции F в диапазоне от -0,27 до 0,31 принимают за зону неопределенного прогноза, затем в III триместре на основании информативных признаков гемостазимограмм, а именно концентрации фибриногена B в плазме, уровня Д-димеров, числа тромбоцитов, параметра K тромбоэластограммы, регистрируемого в условиях высококонтактной активации гемокоагуляции с помощью метода распознавания образов, определяют значение функции P по формуле:

P=-0,89C-0,59Д+0,014E+0,012G-1,14,

где C - концентрация фибриногена B в плазме, г/л;

Д - уровень Д-димеров, нг/мл;

E - число тромбоцитов, 109/мг;

G - параметр K тромбоэластограммы, мм,

и при значении функции P больше 0,2 прогнозируют физиологическую кровопотерю, при значении функции меньше -0,2 прогнозируют патологическую кровопотерю, значение функции P в диапазоне от -0,2 до 0,2 принимают за зону неопределенного прогноза.

Предложенный метод позволяет определять вероятность развития кровотечения непосредственно во время родов и не позволяет прогнозировать нарушения в системе гемостаза на различных этапах беременности.

Известен способ диагностики внутрисосудистого тромбообразования (тромбоза глубоких вен нижних конечностей или ТЭЛА) путем определения уровня D-димера в плазме крови, и высокое содержание D-димера (более 250 нг/мл) указывает на наличие внутрисосудистого тромба, а его нормальное значение исключает наличие венозных тромбозов (Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Издание 2-е дополненное. - М.: «Ньюдиамед», 2001. - С. 43).

Предложенный метод не ориентирован на беременных женщин и не учитывает динамику изменения показателей системы гемостаза по мере увеличения гестационного срока.

Однако однократное определение уровня D-димера не позволяет выявить скрытого внутрисосудистого фибринообразования.

Известен способ раннего прогнозирования риска развития сосудистых поражений в дебюте эндокринопатий (патент РФ №2426123, 10.08.2011), сущность которого заключается в том, что в пробе крови определяют интегральный показатель тромбоцитарной активности (S) планиметрическим методом или по формуле: S=-0,263+1,029A-0,286B, где A - степень агрегации (%), B - скорость агрегации за 30 с (%/мин), и значение S>14 см², оценивают как повышенную степень риска тромбообразования и необходимость его предупреждения.

Недостатком предложенного метода является отсутствие клинических параллелей с изменениями в системе гемостаза у беременных женщин, что не позволяет оценить его прогностическую и диагностическую эффективность при использовании в акушерской практике.

Известен способ диагностики скрытого внутрисосудистого фибринообразования (патент РФ №2431841, 20.10.2011), заключающийся в определении уровня D-димера в плазме крови, отличающийся тем, что определение уровня D-димера проводят дважды: до и через 24 ч после проведения 30-минутного сеанса последовательно перемежающейся пневматической компрессии нижних конечностей и повышение уровня D-димера в плазме крови во второй пробе свидетельствует о наличии скрытого внутрисосудистого фибринообразования, а отсутствие повышения уровня D-димера или его снижение свидетельствует об отсутствии скрытого внутрисосудистого фибринообразования.

Недостатком предложенного метода является отсутствие клинических параллелей с изменениями в системе гемостаза у беременных женщин, что не позволяет оценить его прогностическую и диагностическую эффективность при использовании в акушерской практике.

Известен способ диагностики тромбоэмболических заболеваний вен путем определения содержания D-димеров и растворимого фибрина (патент РФ №2475760, 20.02.2013), который включает определение содержания растворимого фибрина и D-димеров, образующихся в процессе фибринолиза, активированного в пробе крови. В способе согласно настоящему изобретению сравнивают уровень D-димеров, соответствующий разрушению растворимого фибрина, и уровень D-димеров в пробе с граничными значениями нормы. Тест согласно настоящему изобретению можно применять также для определения того, является ли достаточным противодействие свертыванию крови у пациента.

Недостатками предложенного метода являются его прогностическая эффективность только при наличии заболеваний венозной системы и отсутствие сведений о возможности получения прогноза о состоянии системы гемостаза во время беременности.

Прототипом заявляемого изобретения нами выбран (патент РФ №2189045, 10.09.2002) способ прогноза развития полиорганной недостаточности (ПОН) в третьем триместре беременности путем исследования ключевых констант гомеостаза, отличающийся тем, что у женщины исследуют систему острофазных белков, определяя уровень фибронектина, исследуют систему гемостаза, подсчитывая в крови уровень D-димеров и число "активных" тромбоцитов, определяют показатель гематологической системы - количество фетальных эритроцитов в периферической крови, показатель системы гемодинамики - структурную точку АД и вычисляют диагностический индекс F по формуле:

F=K1 0,0018-K2 0,2021865+K3 0,42014-K4 0,00301+K5 0,01114+0,04018,

где K1 - структурная точка АД, усл. ед.;

K2 - уровень D-димеров, нг/мл;

K3 - количество активных тромбоцитов, 109/л;

K4 - количество фетальных эритроцитов в периферической крови, %;

K5 - уровень фибронектина, г/л.

И при F менее 0,05 судят об отсутствии угрозы развития ПОН, а при F более 0,05 прогнозируют развитие ПОН, при этом, если F равно 0,07-0,1, прогнозируют повреждение двух систем жизнеобеспечения: сердечно-сосудистой, гепатолиенальной, если F равно 0,1-0,2, прогнозируют повреждение трех систем: сердечно-сосудистой, гепатолиенальной, гемостаза и максимальный риск развития тромбогеморрагических осложнений, если же F равно 0,2-0,4, прогнозируют развитие необратимых состояний с летальным исходом.

Основным недостатком указанного метода является то, что отдельные показатели свертывающей системы используются для достижения совершенно иной клинической цели «прогнозирование полиорганной недостаточности у беременных в III триместре», тогда как в заявляемом способе преследуется цель по определению нарушений в самой системе гемостаза на различных этапах беременности.

Таким образом, можно констатировать, что известные методы исследований являются сложными для исполнения и их не всегда можно реализовать достаточно быстро.

В акушерстве существует постоянная потребность в методе, который позволит быстро диагностировать тромбоэмболическое заболевание у беременной женщины, при этом указанная диагностика заболевания должна исключить необходимость применения дополнительных исследований.

Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.

Задача заявляемого изобретения - разработать эффективный способ выявления нарушения свертывающей системы крови у беременной женщины за счет определения особенности системы гемостаза крови матери с учетом половой принадлежности плода в динамике беременности.

Поставленная задача решается тем, что в венозной крови беременной определяют методом иммунотурбидиметрии уровень Д-димера, и если его уровень у беременных с плодами мужского пола выше 350 нг/мл, а у беременных с плодами женского пола выше 520 нг/мл, диагностируют нарушение свертывающей системы крови.

Технический результат, полученный в ходе использования изобретения, состоит в упрощении способа и в повышении точности диагностики нарушения гемостаза до появления клинических признаков в результате оценки в сыворотке крови уровня Д-димера, что позволяет своевременно провести профилактические терапевтические мероприятия и предотвратить осложнения беременности.

D-димер - это продукт распада фибрина, небольшой фрагмент белка, присутствующий в крови после разрушения кровяного сгустка (тромба), возникающего при свертывании крови. Он является маркером тромбообразования, так как при этом процессе вместе с возникновением тромбов запускается и их растворение с образованием D-димеров. Он называется «димер», так как содержит два соединяющихся D фрагмента белка фибриногена.

Для диагностики тромбоза можно определить концентрацию D-димеров в крови - тест на D-димеры. С момента своего появления в 1990-х годах тест на D-димеры стал важным исследованием для пациентов с подозрением на тромботические нарушения (Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1999; Ridker P.M., Bernardi Е. et al., 1997). В то время как отрицательный результат практически исключает тромбоз, положительный результат может быть вызван как тромбозом, так и другими возможными причинами. Его главная польза, таким образом, - исключение тромбоэмболии. Кроме того, он используется в диагностике такого нарушения, как ДВС-синдром (синдром внутрисосудистого свертывания). D-димеры обычно не присутствуют в плазме крови человека, кроме случаев, когда свертывающая система была активирована, например, в случае состоявшегося тромбоза или ДВС-синдрома.

Тромбы в сосудах встречаются при целом ряде заболеваний: варикозная болезнь вен нижних конечностей, мерцательная аритмия, осложненное течение инфекционных заболеваний, осложнения после проведенного хирургического вмешательства. Организм при тромбозе запускает механизмы, способствующие разрушению тромбов, в ходе их работы фибрин начинает разрушаться плазминогеном и образуются D-димеры. Таким образом, количество D-димеров в крови указывает на активность процессов разрушения тромбов и косвенно позволяет оценить активность тромбообразования. Наиболее часто данный тест используют для диагностики синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС), а также для мониторинга терапии тромбозов антикоагулянтами (например, гепарином) (Carr J.M. et al., 1989; Wada Н. et al., 1999; Wada H. et al., 2000).

Количество D-димеров может быть повышено при беременности, обычно оно постепенно нарастает к III триместру. Норма показателя Д-димера в крови при беременности должна быть не выше 248 нг/мл (http://womanadvice.ru/d-dimer-pri-beremennosti#ixzz2oZL6b7xV).

До недавнего времени высокие показатели считались признаком угрозы развития тромботических осложнений при беременности, однако исследования последних лет показали, что четкой связи между уровнем D-димера и патологией беременности нет (Chan W.-S., Chunilal S.A. Lee et al. A Red Blood Cell Agglutination D-Dimer Test to Exclude Deep Venous Thrombosis in Pregnancy, 2007).

Таблица (H.A. Оганесян, Л.С. Бут-Гусаим, С.В. Юркевич, 2011)

Неделя беременности Референтные значения До 13-й 0-0,55 мкг FEU/мл 13-21-я 0,2-1.4 мкг FEU/мл 21-29-я 0,3-1,7 мкг FEU/мл 29-35-я 0,3-3 мкг FEU/мл 35-42-я 0,4-3,1 мкг FEU/мл

В рамках функциональной системы «мать-плацента-плод» (ФСМПП) принято различать две подсистемы, взаимодействующие друг с другом на разных уровнях: функциональную систему материнского организма (ФСМ), обеспечивающую условия для нормального развития плода, и функциональную систему организма плода (ФСП), деятельность которой направлена на поддержание его нормального гомеостаза (Савенков Ю.И., Лобынцев К.С., 1980). Главным связующим звеном между матерью и плодом является плацента, которая вместе с маткой образует дополнительное коммуникативное звено ФСМГШ.

Между тем, существующая концепция не учитывает важного аспекта: подсистема «плод» в ФСМПП является носителем генетически детерминированного признака - пола плода. Установлено, что мужской пол плода является независимым фактором риска для неблагоприятного исхода беременности, а у плодов женского пола чаще регистрируется благоприятное течение перинатального периода и реже наступают преждевременные роды (Di Renzo et al., 2007).

Беременные плодами мужского пола имеют большую предрасположенность к преждевременному излитию околоплодных вод, вызванных наличием инфекционного агента, в то время как для женщин, вынашивающих девочек, характерны преждевременные роды, сопровождающиеся гипертензией (Zeitlin J., Ancel P.Y., baroque В., Kaminski M., 2004). Хроническая фетоплацентарная недостаточность значительно чаще сопровождает течение беременностей с плодами мужского пола, чем женского, что может быть объяснено нарушением инвазии трофобласта в результате иммунного ответа со стороны материнского организма (Chidini A, Salafia С.М., 2005).

Известно, что оптимальный уровень трансплацентарного обмена, рост и развитие плода в значительной степени зависит от функционирования системы крови при беременности (Персианинов Л.С., Демидов В.Н., 1977; Аршавский И.А., Железнякова Е.В., 2003), однако существующие данные литературы не учитывают характер изменений в этой системе, происходящих на фоне гестации, с позиции полового диморфизма. Значительный интерес для практического акушерства представляет исследование функции тромбоцитарного звена гемостаза в связи с его клиническим значением для гестационных осложнений (плацентарная недостаточность, ЗРП, гестоз второй половины беременности), а также увеличившимся в последние годы титром тромбоцитопатий (Каширина Т.Н., Макацария А.Д., Мищенко А.Д., Нестерова С.Г., 1982; Зазерская И.Е., 1991; Алуятдинова О.С., Смирнова Л.М., Брагинская С.Г., 1999; Ascarelli М.Н., Emerson E.S., Bigelow C.L., Martin J.N. 1998).

Подробное описание способа

С целью осуществления постоянного контроля за состоянием беременной врачи ежемесячно назначают несколько анализов - одни исследования делаются только один раз, другие назначают к сдаче ежемесячно. Одним из таких исследований является анализ крови на Д-димер при беременности, который помогает определить его уровень и выявить наличие или отсутствие тромбов, чтобы предотвратить появление тромбозов, а следовательно закупоривание вен. При отрицательном результате теста врач исключает тромбоз. При положительном результате назначают дополнительные исследования с целью поиска возможной причины. Для своевременной диагностики и предупреждения тромбоэмболии и ДВС-синдрома (синдрома сосудистого свертывания) нужно проводить тест на D-димер каждой женщине во время беременности. Особенно важно данное исследование для диагностики нарушений в свертывающей системе крови у беременных во 2-3 триместре.

В заявляемом способе предварительно беременной методом двумерного ультразвукового исследования с использованием ультразвуковых приборов (VOLUSON 730 Expert, Toshiba (Ессосее) SSA-340) определяют пол плода.

Для исследования уровня Д-димера у беременной осуществляют утром натощак забор венозной крови. Для того чтобы правильно подготовиться к исследованию необходимо:

- исключить из рациона жирную пищу за 24 часа до анализа,

- исключить физическое и эмоциональное перенапряжение за 30 минут до исследования,

- не курить в течение 30 минут до сдачи крови.

Исследование осуществляют методом иммунотурбидиметрии - это метод количественного выявления Д-димера (аппаратура Tecan Cunrise, тест-наборы Technozym D-dimer ELISA, производитель Technoclone GmbH Вена, Австрия). Исследование проводят в соответствии с инструкцией к используемой аппаратуре. TECHNOZYM® Д-димер ELISA может быть использован для определения концентрации Д-димера в плазме. Д-димер генерируется как специфический растворимого продукта деградации во время фибринолиза. Материал пробы: Плазма. Должна использоваться плазма с цитратом. Получение плазмы: мешайте 9 частей венозной крови с 1 частью раствора цитрата натрия (0,11 моль/л) и центрифугируйте в течение 15 минут при минимуме 2500 г (DIN 58905). Образец плазмы можно хранить в течение 3 часов при комнатной температуре, в противном случае образец должен быть заморожен сразу после центрифугирования. Стабильный при -20°C в течение 6 месяцев.

Кровь для анализа отбирали из локтевой вены с использованием шприц-пробирок Monovette, содержащих стандартное количество цитрата натрия. В качестве биологического материала для определения протромбинового времени, АЧТВ, содержания фибриногена и Д-димера использовали цитратную бестромбоцитарную плазму, получаемую центрифугированием цитратной крови при 3000 g в течение 15 минут. Время от момента отбора крови до проведения исследований не превышало 2 часов. Единицы измерения: нг/ мл.

Построение калибровочной кривой:

по оси X: Концентрация D-димер, нг/мл

по оси Y: поглощение

График строится на миллиметровой бумаге с линейными осями с аппроксимацией от точки к точке, или кубической.

Оценка эталонной кривой

- Коэффициент поглощения наивысшего калибратора должно быть между 1,0 и 2,5.

- Валидность теста может быть проверена на основе расчетных контрольных значений.

Пример кривой

Измерение концентрации образцов

- Считать концентрации от эталонной кривой.

- Если есть образцы с коэффициентом поглощения выше, чем у самой высокой точки, они должны быть предварительно разбавлены в инкубационном буфере. Измеренная концентрация затем должна быть умножена на коэффициент разбавления.

Диапазон значений

Нормальный диапазон для D-димера определяли в диапазоне от 0-250 нг/мл.

Если уровень концентрации D-димера у беременных с плодами мужского пола 350 нг/мл и выше, а у беременных с плодами женского пола 520 нг/мл и выше, диагностируют нарушение гемостаза-свертывающей системы крови.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1

Пациентка Е-ова Е.Г., 28 лет. Наблюдается по программе «Акушерский мониторинг». Было проведено полное клинико-лабораторное обследование.

Диагноз: Беременность 24 недели, не осложненное течение беременности. По результатам двумерного ультразвукового исследования установлен мужской пол плода.

Проведено исследование свертывающей системы крови матери (венозная кровь) с целью определения уровня D-димера: 381 нг/мл. Увеличение уровня D-димера выше 350 нг/мл свидетельствует о наличии активного фибринолиза на фоне повышенного тромбообразования.

Пример 2

Пациентка С-ова Е.М. 23 лет. Наблюдается по программе «Акушерский Мониторинг» Было проведено полное клинико-лабораторное обследование.

Диагноз: Беременность 30 недель, не осложненное течение беременности. По результатам двумерного ультразвукового исследования установлен мужской пол плода.

Проведено исследование свертывающей системы крови матери (венозная кровь) с целью определения уровня D-димера: 348нг/мл.

Изменения уровня D-димера ниже 350 нг/мл, что свидетельствует об отсутствии повышения внутрисосудистого фибринообразования с низким риском развития тромбоза.

Пример 3

Пациентка У-ова И.В., 32 года. Наблюдается по программе «акушерский мониторинг» Было проведено полное клинико-лабораторное обследование.

Диагноз: Беременность 34 недели, не осложненное течение беременности. По результатам двумерного ультразвукового исследования установлен мужской пол плода.

Проведено исследование свертывающей системы крови матери (венозная кровь) с целью определения уровня D-димера: 350 нг/мл. Увеличение уровня D-димера 350 нг/мл свидетельствует о наличии активного фибринолиза на фоне повышенного тромбообразования.

Пример 4

Пациентка Г-ова Ю.С., 29 лет. Наблюдается по программе «Акушерский мониторинг» Было проведено полное клинико-лабораторное обследование.

Диагноз: Беременность 30 недель, не осложненное течение беременности. По результатам двумерного ультразвукового исследования установлен женский пол плода.

Проведено исследование свертывающей системы крови матери (венозная кровь) с целью определения уровня D-димера: 519 нг/мл. Изменения уровня D-димера ниже 520 нг/мл свидетельствует об отсутствии повышения внутрисосудистого фибринообразования с низким риском развития тромбоза.

Пример 5

Пациентка К-ко И.Д., 33 года. Наблюдается по программе «Акушерский мониторинг» Было проведено полное клинико-лабораторное обследование.

Диагноз: Беременность 20 недель, не осложненное течение беременности. По результатам двумерного ультразвукового исследования установлен женский пол плода.

Проведено исследование свертывающей системы крови матери (венозная кровь) с целью определения уровня D-димера: 525 нг/мл. Увеличение уровня D-димера выше 520 нг/мл свидетельствует о наличии активного фибринолиза на фоне повышенного тромбообразования.

Пример 6

Пациентка Ш-ер Е.И., 31 год. Наблюдается по программе «Акушерский мониторинг» Было проведено полное клинико-лабораторное обследование.

Диагноз: Беременность 32 недели, не осложненное течение беременности. По результатам двумерного ультразвукового исследования установлен женский пол плода.

Проведено исследование свертывающей системы крови матери (венозная кровь) с целью определения уровня D-димера: 520 нг/мл. Увеличение уровня D-димера 520 нг/мл свидетельствует о наличии активного фибринолиза на фоне повышенного тромбообразования.

Заявляемым методом обследовано 350 женщин с физиологическим протеканием беременности, из них 183 с плодами мужского пола и 167 с плодами женского пола. Верификация полученных данных осуществлялась с использованием лабораторного исследования венозной крови матери, ультразвукового исследования плаценты, допплерометрии маточных и фетальных сосудов, а также наружной кардиотокографии, позволяющей судить о состоянии плода.

Преимуществом заявляемого способа является повышение информативности лабораторных критериев внутрисосудистого тромбообразования и диагностика скрыто протекающего внутрисосудистого фибринообразования, что позволяет определить высокий риск развития тромбозов и дифференцировать подходы к назначению терапии у таких беременных.

Ни один из известных методов не ориентирован на беременных женщин и не учитывает динамику изменения показателей системы гемостаза по мере увеличения гестационного срока.

Заявляемый способ может быть использован в лечебно-профилактических учреждениях акушерского профиля, включая поликлиники, способ прост в исполнении и интерпретации показателей.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для выявления нарушений свертывающей системы крови у беременных во 2-3 триместре. Для этого предварительно методом двумерного ультразвукового исследования устанавливают пол плода. Затем в венозной крови беременной методом иммунотурбидиметрии определяют уровень D-димера. Если его уровень у беременных с плодами мужского пола 350 и выше нг/мл, а у беременных с плодами женского пола 520 нг/мл и выше, диагностируют нарушение свертывающей системе крови. Использование данного способа позволяет проводить диагностику скрыто протекающего внутрисосудистого фибринообразования, что дает возможность определить высокий риск развития тромбозов и дифференцировать подходы к назначению терапии у таких беременных. 6 пр.

Способ диагностики нарушений свертываемости крови у беременных во 2-3 триместре путем исследования в крови беременной уровня D-димера, отличающийся тем, что предварительно методом двумерного ультразвукового исследования устанавливают пол плода, затем в венозной крови методом иммунотурбидиметрии определяют уровень D-димера, и если его уровень у беременных с плодами мужского пола 350 и выше нг/мл, а у беременных с плодами женского пола 520 нг/мл и выше, диагностируют нарушение свертывающей системе крови.