СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРИСУТСТВИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Описание патента на изобретение RU2547573C2

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования, и может использоваться для оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны. Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol.89. P.1121-1132). Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell.Mol.Life Sci. 2005. Vol.62. P.971-988).

Лантан, являясь трехвалентным катионом, имеет высокое сродство к фосфатидилсерину и в низких концентрациях избирательно взаимодействует с отрицательно заряженным фосфатидилсерином (Bentz J., Alford О., Cohen J., Duzgunes N. Biophys J. 1988. Vol.53. P.593-607).

Принцип предлагаемого способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов основан на электростатическом взаимодействии положительно заряженного лантана с отрицательным фосфатидилсерином. В результате взаимодействия лантана с фосфатидилсерином происходит агрегация эритроцитов.

В качестве прототипа выбран способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флюоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флюоресценции с помощью проточного цитофлюориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua M. Et al. Blood. l996. Vol.87. P.1179-1183).

Однако для этого требуется дорогостоящее дефицитное оборудование (проточный цитофлюориметр) и дорогие дефицитные реактивы.

Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.

Технический результат - упрощение способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Технический результат достигается за счет того, что в способе? включающем фиксацию эритроцитов с помощью глутарового альдегида, их отмывание, помещение на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном, наблюдение за появлением агрегатов, по появлению агрегатов эритроцитов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 1%-ном растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 60 мин при комнатной температуре. После фиксации эритроциты трижды отмывают дистиллированной водой с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Отмытые эритроциты переносят на предметное стекло, обработанное 0.5 мМ раствором хлористого лантана, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа за образованием агрегатов клеток. Появление агрегатов свидетельствует о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Известно, что эритроциты кренатной формы (эхиноциты) в отличие от эритроцитов нормальной формы (дискоциты) имеют на поверхности мембраны высокое содержание фосфатидилсерина (Wolfs J.L.N., Comfurius Р., Bevers E.M., Swaal R.F.A. Molecular Membrane Biology. 2003. Vol.20. P.83-91).

В качестве примеров использовали дискоциты и эхиноциты. Эхиноциты получали путем истощения; по АТФ (Feo С., Mohandas N. Nature. 1977. Vol.265. P. 166-168) и после обработки лизофосфатидной кислотой (Chung S.M., Bae O.N., Lim K.M. et al. Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol. 2007. Vol.27. P.414-421).

Пример 1. Фиксированные дискоциты помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа. Наблюдается отсутствие агрегатов эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов фосфатидилсерин отсутствует.

Пример 2. Фиксированные эхиноциты, полученные после истощения по АТФ, помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью световой микроскопии. Наблюдаются агрегаты эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.

Пример 3. Фиксированные эхиноциты, полученные после обработки лизофосфатидной кислотой, помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью световой микроскопии. Наблюдаются агрегаты эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.

Таким образом, предлагаемый способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов не требует специального оборудования.

Преимуществом предлагаемого способа является простота, доступность, быстрота, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании и дорогих дефицитных реактивов.

Похожие патенты RU2547573C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРИСУТСТВИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ 2016
  • Шереметьев Юрий Александрович
  • Поповичева Александра Николаевна
  • Успенский Александр Николаевич
  • Александров Алексей Алексеевич
  • Успенская Ольга Александровна
RU2665171C2
СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ПРИСУТСТВИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ 2019
  • Шереметьев Юрий Александрович
  • Успенский Александр Николаевич
RU2701520C1
Способ оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов 2021
  • Шереметьев Юрий Александрович
  • Шагалова Полина Анатольевна
  • Соколова Элеонора Станиславовна
RU2768194C1
СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ РЕАГЕНТОВ НА ОБРАЗОВАНИЕ СТОМАТОЦИТОВ 2016
  • Шереметьев Юрий Александрович
  • Поповичева Александра Николаевна
  • Успенский Александр Николаевич
  • Александров Алексей Алексеевич
  • Успенская Ольга Александровна
RU2629609C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ К ВОЗДЕЙСТВИЮ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ 2006
  • Супрун Стефания Викторовна
  • Козлов Владимир Кириллович
  • Пивкина Татьяна Владимировна
RU2332668C1
СПОСОБ ПОКРЫТИЯ ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКОЛ ДЛЯ МИКРОСКОПИИ 2012
  • Фефелов Владимир Александрович
  • Шереметьев Юрий Александрович
RU2519731C2
Способ морфологической оценки агрегации эритроцитов, индуцированной высокомолекулярными полимерами 2018
  • Шереметьев Юрий Александрович
  • Рогозин Метхун Мадибронович
  • Поповичева Александра Николаевна
  • Успенский Александр Николаевич
RU2704969C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УПЛОТНЕННЫХ БЕЛКОВО-ЛИПИДНЫХ УЧАСТКОВ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ С ПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ BIO VISION 2008
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
RU2390020C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ 1991
  • Шереметьев Ю.А.
  • Суслов Ф.Ю.
RU2082968C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ПРИ СНИЖЕНИИ ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗА НА ФОНЕ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 2013
  • Луценко Михаил Тимофеевич
  • Андриевская Ирина Анатольевна
  • Довжикова Инна Викторовна
  • Кутепова Ольга Леонидовна
RU2549432C2

Реферат патента 2015 года СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРИСУТСТВИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования. Для оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов клетки фиксируют глутаровым альдегидом, отмывают дистиллированной водой и помещают на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном, перемешивают и с помощью световой микроскопии наблюдают за агрегацией клеток. Появление агрегатов эритроцитов свидетельствует о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. Изобретение обеспечивает создание простого, быстрого, не требующего специального оборудования и дефицитных реактивов способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. 3 пр.

Формула изобретения RU 2 547 573 C2

Способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, включающий фиксацию эритроцитов глутаровым альдегидом, отличающийся тем, что для оценки присутствия фосфатидилсерина фиксированные эритроциты помещают на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном, перемешивают и по появлению агрегатов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2547573C2

Kuypers FA et al
Detection of altered membrane phospholipid asymmetry in subpopulations of human red blood cells using fluorescently labeled annexin V
Blood
Предохранительное устройство для паровых котлов, работающих на нефти 1922
  • Купцов Г.А.
SU1996A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ 2005
  • Шереметьев Юрий Александрович
  • Успенский Александр Николаевич
  • Шереметьева Александра Васильевна
  • Смирнов Валерий Николаевич
  • Шевченко Елена Александровна
  • Смирнова Дарья Валерьевна
RU2309754C2
СПОСОБ ОЦЕНКИ СТАБИЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ 2004
  • Шереметьев Юрий Александрович
  • Леднев Антон Вениаминович
  • Шереметьева Александра Васильевна
  • Успенский Александр Николаевич
  • Смирнов Валерий Николаевич
RU2277711C1
Liu F, Burgess J et al
Sample preparation and imaging of erythrocyte cytoskeleton with the atomic force microscopy
Cell Biochem Biophys
Способ и приспособление для нагревания хлебопекарных камер 1923
  • Иссерлис И.Л.
SU2003A1

RU 2 547 573 C2

Авторы

Шереметьев Юрий Александрович

Успенский Александр Николаевич

Шевченко Елена Александровна

Ерёмин Сергей Петрович

Даты

2015-04-10Публикация

2013-04-15Подача