СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КАТИОНОВ ЦИНКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ОДНОВРЕМЕННЫМ ОПРЕДЕЛЕНИЕМ СООТНОШЕНИЯ КАТИОНОВ ЦИНКА И МЕДИ В ТОЙ ЖЕ ПРОБЕ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/52 G01N33/48 

Настоящее изобретение относится к области медицинской биохимии и может быть использовано для клинической диагностики.

По современным представлениям цинк играет важную роль в метаболизме. Это связано с тем, что катионы цинка входят в состав более 150 ферментов, формируют распознающие нуклеотидные последовательности области факторов транскрипции, участвуют в проведении нервных импульсов и модулируют чувствительность нейронов к нейромедиаторам. Катионы цинка необходимы для нормального функционирования эндокринной системы, в частности, поджелудочной и щитовидной железы, защищают мембраны от окислительного повреждения (Mann U. The Role of Minerals and Vitamins in Mental Health. - 2000; Bettger W, O'Dell BA Critical physiological role of zinc in the structure and function of biomembranes. Life Sciences. - 1981. - v.28. - p.1425-1438). В связи с этим определение концентрации цинка в биологических жидкостях, в частности в крови, широко используется в современной медицинской практике, в частности, при диагностике онкологических, кожных заболеваний, нарушений репродуктивных функций, диагностике нарушений обоняния и вкуса и др.

Нормальные значения концентрации цинка в крови взрослого человека колеблются в пределах 10,7-18,4 мкмоль/л (Цинк в педиатрической практике. Учебное пособие. Под ред. Л.А. Щелягиной. М., 2001, 84 с.).

В тоже время по клиническим данным значение имеет не только абсолютное значение концентрации цинка, но и его соотношение с другим незаменимым микроэлементом - медью. По данным литературы в норме отношение молярного содержания цинка к содержанию меди в крови должно составлять 10:1-8:1 (Jacob RA, 1981. Zinc and copper. Clinics in Laboratory Medicine. - v.1. - p.743-750; O. Akinloyei, F.M. Abbiyesuku. The impact of blood and seminal plasma zinc and copper concentrations on spermogram and hormonal changes in infertile Nigerian men. Reproductive Biology. - v.11, N2. - 2011. - p.83-98).

Из существующего уровня техники известен способ колориметрического определения концентрации цинка в водных растворах. Метод основан на образовании окрашенного в красный цвет соединения цинка с дитизоном с дальнейшим извлечением дитизоната цинка в слой четыреххлористого углерода при pH=4,5-1,8 и колориметрированием в области 535 нм (Патент РФ 2125724, опубл. 27.01.1999).

Недостатками данного технического решения применительно к определению цинка в сыворотке крови является необходимость экстракции окрашенного продукта органическим растворителем, что существенно увеличивает время однократного определения концентрации цинка в пробе.

Известен способ определения цинка в водных растворах по реакции родамина С с ионами цинка с образованием окрашенного комплексного соединения, которое экстрагируют диэтиловым эфиром и измеряют светопоглощение образующегося коллоидного водного раствора (Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984, С.164).

Недостатками способа являются высокая погрешность и длительность определения.

Известен способ определения цинка в водных растворах при его концентрациях, превышающих 0,1 мг/л, атомно-абсорбционной спектрометрией (Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984, С.22).

Известен способ определения меди в водных растворах атомно-абсорбционной спектрометрией (Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984, С.23).

Отношение концентраций цинка и меди при определении этим методом может быть получено вычислением полученных численных значений концентраций.

Недостатком способа атомно-абсорбционной спектрометрии является необходимость наличия дорогостоящего прибора, а также длительность и трудоемкость.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому техническому решению является метод количественного определения катионов цинка в сыворотке крови человека, который разработан на основе качественного варианта дитизонового метода определения цинка (Ильина О.С. Изменение содержания цинка в крови человека при сахарном диабете типа I и особенности гипогликемического действия цинкосодержащего комплекса инсулин-хондроитинсульфат. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Уфа, 2012). К 2 мл пробы крови добавляли 0,1 мл 10% NaOH и 0,2 мл раствора 1% раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле вместо сыворотки крови добавляли 2 мл дистиллированной воды, в положительном контроле - 2 мл 20 мкмоль раствора сульфата цинка (молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка). Пробы фотометрировали при 535 нм.

Расчет концентрации катионов цинка в пробе проводили по формуле: C_Zn=20 мкмоль × ОП₅₃₅ Пробы/ОП₅₃₅ Стандарта,

где ОП₅₃₅ Пробы - оптическая плотность пробы, измеренная при 535 нм;

ОП₅₃₅ Стандарта - оптическая плотность стандартного 20 микромолярного раствора сульфата цинка, измеренная при 535 нм.

Недостатком известного технического решения является определение только одного диагностического показателя, описывающего содержание микроэлемента в сыворотке крови.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является высокая чувствительность способа, расширение спектра определяемых диагностических показателей из одной пробы, описывающих содержание металлов, в частности при заболеваниях сахарным диабетом, а именно определение наряду с концентрацией катионов цинка в сыворотке крови также соотношения катионов цинка с катионами меди в той же пробе без применения дополнительных реактивов.

Данная задача решается за счет того, что полученные дитизонаты цинка и меди фотометрируют в областях спектра, соответствующих их максимумам поглощения. Реакция проводится в щелочной среде, в которой дитизон присутствует в водорастворимой енольной форме и диффундирует в водную фазу из четыреххлористого углерода. В водной фазе образуются дитизонат цинка, имеющий максимум поглощения 535 нм, и дитизонат меди, имеющий максимум поглощения 435 нм. Органическую фазу удаляют и фотометрируют образующийся коллоидный раствор дитизонатов цинка и меди при 535 нм и 435 нм соответственно с использованием в качестве стандарта растворов, содержащих 20 мкмоль/л сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди.

Предлагаемый метод основан на образовании при щелочном значении pH окрашенного в красный цвет соединения цинка с дитизоном и окрашенного в желто-коричневый цвет соединения меди с дитизоном. Образовавшиеся коллоидные растворы дитизонатов цинка и меди фотометрируют при 535 нм и 435 нм соответственно. Полученные результаты сравнивают с оптической плотностью дитизонатов цинка и меди, образовавшихся в ходе реакции со стандартными растворами, содержащими 20 мкмоль/л сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди.

Концентрацию катионов цинка рассчитывают по формуле:

C_Zn=С_станд.*ОП₅₃₅ Пробы/ОП₅₃₅ Стандарта,

где С_станд. - молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка;

ОП₅₃₅ Пробы - оптическая плотность пробы сыворотки крови, измеренная при 535 нм;

ОП₅₃₅ Стандарта - оптическая плотность стандартного раствора сульфата цинка, измеренная при 535 нм.

Отношение концентрации катионов цинка к концентрации катионов меди определяют по формуле:

$$C_{Zn/}{C}_{Cu}=\frac{\left(О{П}_{535}/О{П}_{435}\right)Пробы*{С}_{станд.ZnSO4}}{\left(О{П}_{535}/О{П}_{435}\right)Стандарта*{С}_{станд.CuSO4}},$$

где С_{станд.ZnSО4} - молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка;

С_{станд.CuSО4} - молярная концентрация стандартного раствора сульфата меди;

(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅) Пробы - отношение оптических плотностей пробы, измеренных при 535 нм и 435 нм;

(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅) Стандарта - отношение оптических плотностей стандартных растворов сульфата цинка и сульфата меди, измеренных при 535 нм и 435 нм соответственно.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является определение концентрации катионов цинка в сыворотке крови с параллельным определением соотношения катионов цинка и меди в той же пробе без применения дополнительных реактивов.

Пример 1

В пробирку с 2 мл сыворотки крови здорового донора добавляют 0,1 мл 10% NOH и 0,2 мл раствора 1% раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле вместо сыворотки крови добавляют 2 мл физиологического раствора, в положительном контроле - 2 мл раствора, содержащего 20 мкмоль/л раствора сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди (стандартные растворы). Пробы выдерживают при комнатной температуре 30 минут, органическую фазу удаляют. Пробы с коллоидными растворами дитизонатов цинка и меди фотометрируют при 535 и 435 нм.

Полученный результат: ОП₅₃₅ Пробы = 0,230

ОП₅₃₅ Стандарта = 0,255

ОП₄₃₅ Пробы = 0,098

ОП₄₃₅ Стандарта = 0,112

(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Стандарта = 2,276

(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Пробы = 2,346

Расчет концентрации катионов цинка проводят по формуле:

C_Zn=20 мкмоль/л * ОП₅₃₅ Пробы/ОП₅₃₅ Стандарта = 18,03 мкмоль/л

Отношение концентрации катионов цинка к концентрации катионов меди определяют по формуле:

$$C_{Zn/}{C}_{Cu}=\frac{\left(О{П}_{535}/О{П}_{435}\right)Пробы*10}{\left(О{П}_{535}/О{П}_{435}\right)Стандарта}=\mathrm{2,346}/\mathrm{2,276}*10=\mathrm{10,031}$$

Получено:

1. Концентрация цинка - 18,03 мкмоль/л;

2. Соотношение катионов цинка и меди - 10,031.

Пример 2

В пробирку с 2 мл сыворотки крови больного инсулинзависимым сахарным диабетом добавляют 0,1 мл 10% NOH и 0,2 мл раствора 1% раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле вместо сыворотки крови добавляют 2 мл физиологического раствора, в положительном контроле - 2 мл раствора, содержащего 20 мкмоль/л раствора сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди (стандартные растворы). Пробы выдерживают при комнатной температуре 30 минут, органическую фазу удаляют. Пробы фотометрируют при 535 и 435 нм.

Полученный результат:

ОП₅₃₅ Пробы = 0,343

ОП₅₃₅ Стандарта = 0,255

ОП₄₃₅ Пробы = 0,243

ОП₄₃₅ Стандарта = 0,112

(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Пробы = 1,412

(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Стандарта = 2,276

Расчет концентрации катионов цинка проводят по формуле:

C_Zn=20 мкмоль * ОП₅₃₅ Пробы/ОП₅₃₅ Стандарта = 26,9 мкмоль/л.

Отношение концентрации катионов цинка к концентрации катионов меди определяют по формуле:

$$C_{Zn/}{C}_{Cu}=\frac{\left(О{П}_{535}/О{П}_{435}\right)Пробы*10}{\left(О{П}_{535}/О{П}_{435}\right)Стандарта}=\mathrm{1,412}/\mathrm{2,276}*10=\mathrm{6,20}$$

Получено:

1. Концентрация катионов цинка - 26,9 мкмоль/л;

2. Соотношение катионов цинка и меди - 6,20.

Пример 3

С использованием приведенной методики обследовано 30 здоровых доноров 25-55 лет. Среднее значение общей концентрации катионов цинка в крови обследованных составило 23,6±1,32 мкмоль/л, среднее значение соотношения концентрации катионов цинка и меди - 9,4±0,6.

Пример 4

С использованием приведенной методики обследовано 30 больных с инсулинзависимым сахарным диабетом 25-55 лет. Среднее значение общей концентрации катионов цинка в крови обследованных составило 34,3±1,26 мкмоль/л, среднее значение соотношения концентрации катионов цинка и меди - 8,4±0,5.

Предлагаемый способ характеризуется высокой чувствительностью, достаточной для определения концентрации солей цинка и меди в диапазоне 1-100 мкмоль, что необходимо при исследовании проб крови.

Изобретение относится к области медицинской биохимии и представляет собой способ определения концентрации катионов цинка в сыворотке крови с одновременным определением соотношения катионов цинка и катионов меди, включающий использование в качестве основного реагента раствор дитизона в четыреххлористом углероде, инкубацию при комнатной температуре в щелочной среде, удаление органической фазы и колориметрию коллоидных растворов пробы сыворотки крови и стандартного раствора при 535 нм, расчет концентрации катионов цинка, колориметрию коллоидных растворов пробы сыворотки крови и стандартного раствора при при 435 нм и расчет молярного соотношения катионов цинка и меди. Изобретение обеспечивает определение наряду с концентрацией катионов цинка в крови также их соотношения с катионами меди в той же пробе без применения дополнительных реактивов. 4 пр.

Способ определения концентрации катионов цинка в пробе сыворотки крови с одновременным определением соотношения катионов цинка и катионов меди в той же пробе, включающий использование в качестве основного реагента раствор дитизона в четыреххлористом углероде, инкубацию пробы сыворотки крови и стандартного раствора при комнатной температуре в щелочной среде, удаление органической фазы и колориметрию коллоидных растворов пробы сыворотки крови и стандартного раствора, содержащего дитизонат цинка, при 535 нм, расчет концентрации катионов цинка по формуле: C_Zn=C_станд.∗ОП₅₃₅ Пробы/ОП₅₃₅ Стандарта, где С_станд. - молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка; ОП₅₃₅ Пробы - оптическая плотность пробы сыворотки крови, измеренная при 535 нм; ОП₅₃₅ Стандарта - оптическая плотность стандартного раствора сульфата цинка, измеренная при 535 нм, отличающийся тем, что колориметрию коллоидных растворов пробы сыворотки крови и стандартного раствора, содержащих дитизонат меди, повторно проводят при 435 нм и расчет соотношения катионов цинка и меди в той же пробе сыворотки крови осуществляют по формуле: C_Zn/C_Cu=С_{станд.ZnSO4}/С_{станд.CuSO4}∗(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Пробы/(ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Стандарта, где С_{станд.CuSO4} - молярная концентрация стандартного раствора сульфата меди; (ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Пробы - отношение оптических плотностей пробы сыворотки крови, измеренных при 535 нм и 435 нм; (ОП₅₃₅/ОП₄₃₅)Стандарта - отношение оптических плотностей стандартных растворов сульфата цинка и сульфата меди, измеренных при 535 нм и 435 нм соответственно.