СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА LEPTOTRICHIA - РЕЗИДЕНТОВ МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к медицине, разделу медицинской микробиологии, и может быть использовано в бактериологии для культивирования и непродолжительного хранения бактерий рода Leptotrichia - резидентов оромикробиоценоза полости рта человека.

Проблема выделения и идентификации микроорганизмов из клинического материала является актуальной для практического здравоохранения и остается «золотым стандартом» микробиологической диагностики инфекционных заболеваний в определении этиологической значимости возбудителя. Одной из важных задач клинико-бактериологической службы становится своевременное распознавание микроорганизма, исследование его фенотипических свойств, определение чувствительности к антибиотикам, что лежит в основе правильно подобранной этиотропной терапии, и, следовательно, успешной эрадикации.

Лептотрихии из рода Leptotrichia относятся к категории резидентной микрофлоры тела человека и способны вызывать инфекционные процессы. Leptotrichia - нормальные обитатели полости рта человека, кишечника и генитального тракта женщин [Krywolap GN, Page LR. Oral Fusobacterium, Leptotrichia, and Bacterionema: II. Pathogenicity: a review of the literature. // J Baltimore Coll Dent Surg 1977; 32:26-32; Зеленова Е.Г. и др. 2004; Eribe, E.R.K., Olsen I. 2008; Ivanova N., Gronow S., Lapidus A. et al. 2009]. Лептотрихии - неспорообразующие анаэробные бактерии /НАБ/, грамотрицательные, неподвижные палочки [Воробьев А.А., Миронов А.Ю., Пашков Е.П. и др. // Вестник РАМН. 1996. №2. С.3-7]. По современной классификации Bergey's manual 2005, основанной на данных молекулярно-генетических исследований - секвенировании 16S rDNA /рибосомальной ДНК/ генов микроорганизмов, род Leptotrichia отнесен к царству Bacteria, типу Fusobacteria, классу Fusobacteria, порядку Fusobacteriales, семейству Fusobacteriaceae, включает шесть видов: Leptotrichia buccalis, который является типовым, Leptotrichia trevisanii, Leptotrichia goodfellowii, Leptotrichia hofstadii, Leptotrichia shahii, Leptotrichia wadei [“Bergey's Manual of Systematic Bacteriology". By David R. Boone, Richard W.Castenholz, Don J.Brenner, George M.Garrity, Noel R. Krieg, James T.Staley. Springer, 2005. 2 vols. (ISBN 9780387241456)] The Trust is currently based at the University of Georgia in Athens, GA, USA. [http://www.bergeys.org Bergey's Manual Trust.]; [Eribe ERK, Paster BJ, Caugant DA, Dewhirst FE, Stromberg VK, Lacy GH, et al. // Genetic diversity of Leptotrichia and description of Leptotrichia goodfellowii sp. nov., Leptotrichia hofstadii sp. nov., Leptotrichia shahii sp. nov. and Leptotrichia wadei sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2004; 54:583-92].

При определенных условиях способны вызывать воспалительные процессы слизистых полости рта, урогенитального тракта, периодонтальной области. Описаны случаи лептотрихиозного сепсиса у больных лейкозом [Vemelen К, Mertens I, Thomas J, Vandeven J, Verhaegen J, Verbist L. Bacteraemia with Leptotrichia buccalis: report of a case and review of the literature. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001 Nov; 20(11):765-9], бактериемия у больных раком [Weinberger M, Wu T, Rubin M, Gill VJ, Pizzo PA. Leptotrichia buccalis bacteremia in patients with cancer: report of four cases and review. Rev Infect Dis. 1991 Mar-Apr; 13(2):201-6], случаи серьезных инфекций, вызванных лептотрихиями [Morgenstein AA, Citron DM, Orisek В, Finegold SM. Serious infection with Leptotrichia buccalis. Report of a case and review of the literature. // Am J Med 1980; 69:782-5].

Установлено, что считавшиеся сапрофитами Leptotrichia вызывают патологические изменения в тканях миндалин, корня языка, передней и задней дужек мягкого неба, трахеи, глаз [Ариевич A.M., Степанищева З.Г. // Вестник оториноларингологии. 1964. - №5. - С.48-53]. Патогенный потенциал Leptotrichia недооценен по той причине, что описаны случаи Leptotrichia инфекции при эндокардитах, абсцессах печени и легких у иммунокомпетентных пациентов [Duperval, R., Béland, S. & Marcoux, J.A. Infective endocarditis due to Leptotrichia buccalis: a case report. Can Med Assoc J 1984. - 130, 422-424]; [Messiaen Т, Lefebvre С, Geubel A. Hepatic abscess likely related to Leptotrichia buccalis in an immunocompetent patient. // Liver 1996; 16: 342-3].

В отечественных публикациях, посвященных проблемам лептотрихиоза, заболевание называют «лептотрихоз», а возбудителя нередко ошибочно называют Leptothrix. Лептотриксы - свободноживущие формы, сапрофиты, не обладающие патогенным потенциалом [9]; [Хоулт Дж. Криг Н., Снит П. и др.// Краткий определитель бактерий Берги. Москва: Мир, 1980. - 496 с.; Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. и др.// Определитель бактерий Берджи. Москва: Мир, 1997. - 780 с.].

Существуют способы культивирования бактерий рода Leptotrichia, состоящие в использовании жидких и твердых питательных сред. Но известные способы обладают рядом недостатков, которые не позволяют их использовать для изоляции и культивирования Leptotrichia из клинического материала, взятого из ротовой полости в связи с высокой обсемененностью биотопа, а также в связи с недоступностью коммерческих питательных сред производства Швеции и США. Наиболее близким аналогом-прототипом является, например, изоляция и культивирование Leptotrichia на сердечно-мозговом агаре (Difco) с добавлением 0,2% дрожжевого экстракта [Marion N. Gilmour, Arden Howell, Jr., and Basil G. Bibby // The classification of organisms termed Leptotrichia (Leptothrix) buccalis. Bacteriol Rev. 1961 June; 25(2): 131-141] или использование сердечно-печеночно-мозгового агара (Difco) с добавлением 0,2% дрожжевого экстракта [Gilmor, M.N., and P.A.Hanter // Isolation of an oral filamentous microorganism. J. Bacteriol., 76, 330-331].

Недостатком этих способов является:

- незначительная эффективность высеваемости/всхожести лептотрихий в первичной изоляции.

- при дальнейших пересевах штаммы теряются, всхожесть их ослабевает и утрачивается.

- многие штаммы Leptotrichia относят к трудно культивируемым формам, большинство - 109 из 179 депонированных в GenBank штаммов Leptotrichia являются «некультивируемыми» формами и идентифицированы молекулярно-генетическими методами (ПЦР, 16S rDNA секвенирование) до рода.

- в отечественной литературе встречаются малочисленные упоминания о культивировании лептотрихий, в рамках исследования качественного и количественного состава микрофлоры полости рта рутинными методами и методом ПЦР-диагностики биоматериала.

- большинство авторов ссылаются на трудности бактериологической диагностики в связи с прихотливостью Leptotrichia, сложными ростовыми потребностями, малоизученными свойствами.

- упоминаний о питательных средах для бактериологической верификации Leptotrichia в отечественных источниках не найдено.

Задача исследования: предложить способ культивирования бактерий рода Leptotrichia - резидентов микрофлоры полости рта, лишенный вышеперечисленных недостатков.

Технический результат состоит в том, что новый способ культивирования лептотрихий позволяет повысить эффективность изоляции Leptotrichia из клинического материала, повысить качество культивирования микроорганизмов, упростить предварительную предположительную идентификацию Leptotrichia по изменению цвета субстрата, окрашиванию и характерной морфологии колоний, снизить потери штаммов при повторных пересевах, проводить накопление чистой культуры, увеличить срок хранения штаммов Leptotrichia в условиях холодильника при 4°С, применить «золотой стандарт» для трудно культивируемых организмов, исследовать фенотипические свойства изолятов дополнительными методами исследования и аргументировано подтверждать этиологический фактор инфекционной патологии - Leptotrichia путем использования стандартной хромогенной среды «Уриселект». Заявляемый способ прост в осуществлении и не требует дорогостоящей аппаратуры.

Технический результат достигается тем, что современная коммерческая питательная среда «Уриселект» является неселективной, агаризированной средой для изолирования и подсчета уропатогенных микроорганизмов Е.coli, Enterococcus, Proteus, KES-группы, из мочевого тракта и их непрямой идентификации фирм «BIO-RAD», Biomerieux (Франция), богатая пептоном и триптофаном, в состав которой входит крахмал. Хромогенные среды были введены в клиническую микробиологическую практику для предположительного определения микроорганизмов на одной среде за счет отчетливых цветов колоний. Эта технология основана на инкорпорировании хромогенного субстрата в культуральную среду, богатую пептоном и триптофаном. Наличие специфической ферментной активности организма обнаруживается изменением цвета субстрата. Среда содержит индикаторы метаболической активности, позволяющие идентифицировать 4 группы микроорганизмов. Предполагаемое определение изолятов основывается на цветовой схеме и нескольких дополнительных простых тестах. Красные колонии - подозрение на кишечную палочку (требуется допроверить по реакции с индолом, некоторые рекомендуют дополнительно ставить реакцию Фогеса Проскауэра, либо целесообразно сделать пересев на среду Эндо или использовать тест-системы API). Для определения триптофоназы (индольное образование) на изолированную колонию помещается капля реагента Ковача. Если за 15 секунд колония становится розовой, реакция считается положительной. Наличие β-глюкуронидазы у бактерий отмечалось окрашиванием колоний в цвета от розового до пурпурного. Синие колонии - подозрение на наличие бактерий родов клебсиелла, энтеробактер, серация, сальмонелла. Активность β-глюкозидазы (эскулиназы) проявляется в изменении цвета колоний на зеленовато-синие. Фиолетовые колонии - энтерококкус. Активность триптофан дезаминазы отмечалась саморазвивающимся оранжево-коричневым цветом колонии, который усиливался депонированием капли перхлорида железа на изолированную колонию. Коричневые колонии с прокрашиванием среды вокруг колонии - протеус, провиденция, морганелла (среда содержит ингибитор подвижности Р. vulgaris) [8]. Использование сред такого типа необходимо для высева культур патогенных и условно-патогенных бактерий, находящихся в ассоциациях с широким спектром видов энтеробактерий, а также удобны для контроля роста анаэробов полости рта в сочетании с микротестами на анаэробные бактерии и прежде всего на лептотрихии. Идентификация анаэробных бактерий и изучение их биохимических свойств осуществлялась с использованием коммерческих стрип-тестов ANAEROtest 23 и тест-систем API 20A (Biomerieux), Франция.

Колонии Leptotrichia на пластинчатой среде «Уриселект» по морфологии мелкие, диаметром от 0,3 до 3 мм, как правило, яркого голубого цвета, матовые, в проходящем свете непрозрачные. R-формы колоний напоминают вросшие в агар фигуры цветов, колонии приподняты над поверхностью около 0,1-0,2 мм, не выпуклые, плоские, шероховатые, суховатые, бактериальная петля скользит по колонии, забор материала части колонии проводится с трудом. После снятия материала колонии с поверхности среды в агаре остается небольшое углубление. Край колонии неровный, фестончатый, структура колонии мелко волокнистая, при световой микроскопии колоний (увеличение 40) наблюдаются фигуры в форме окружности, по структуре и характеру напоминающие одуванчик голубого цвета. Примерно в 20% случаев колонии Leptotrichia имели красно-пурпурный цвет или его оттенки. При этом морфологические свойства колоний были идентичны как по макро-, так и по микроскопическим признакам. Красного цвета колонии чаще при микроскопическом исследовании имели схожесть с розовым одуванчиком, из центра которого исходили 3-4 извива. Выросшие колонии идентифицировали с использованием коммерческих стрип-тестов ANAEROtest 23 и тест-систем API 20A (Biomerieux), Франция. Проводили дополнительные исследования в соответствии с вышеизложенным. Пересевы после 48-72 часового инкубирования в термостате помещали в холодильник и изучали выживаемость бактерий в этих условиях.

На хромогенной среде «Уриселект» вырастали колонии других микроорганизмов оромикробиоценоза от темно-голубого до сине-зеленого цвета. По отличающейся морфологии колоний, тинкториальным свойствам изолятов, характерной морфологии бактерий и расположении в мазках для микроскопии, по дополнительным тестам, пересевам на селективные среды дифференцировали между Leptotrichia, Veilonella, Lactobacillus, Streptococcus. Колонии Enterococcus имели темно-фиолетовый цвет, от 1 до 5 мм, по морфологии круглые, с ровным краем, гладкие, блестящие. Микроскопически крупные грам-позитивные кокки, в скоплениях или цепочках. Колонии Veilonella мелкие, круглые, голубого цвета, выпуклые, гладкие. Микроскопически крупные грам-негативные кокки в упорядоченных скоплениях. Лактобактерии микроскопически крупные, тонкие регулярно грам-позитивные полиморфные палочки, расположенные дискретно и/или в коротких цепочках, концы палочек тупые. Данный способ прост в использовании, укладывается в стандартные рамки бактериологического исследования с повышенным коэффициентом эффективности и качества. Безвреден. Экономичен. Доступен.

Технический результат достигается тем, что после забора клинического материала из полости рта пациента в кабинете стоматолога его помещают в транспортную среду для анаэробов и в течение 1-2 часов доставляют в бактериологическую лабораторию. Из полученного материала делают разведения 10^-3-10^-5 стерильным 0,85% раствором NaCl. Первичный посев материала из приготовленных разведений осуществляют калиброванной бактериологической петлей (0,2 мм, емкость 0,005 мл) на поверхность пластинчатой среды «Уриселект» методом секторных посевов на четыре сектора, каждый раз обжигая петлю, в 90 мм чашки Петри и далее инкубируют первичные посевы в анаэробных и микроаэрофильных (5%-10% СО₂) условиях, t_opt=+35+37°С в течение 48-72 часов. В случае отсутствия роста чашки повторно выдерживались еще 24 часа для исключения ложно-отрицательных результатов, вызванных недостаточной инкубацией.

При повторных посевах: культивировании изолятов лептотрихий, после идентификации Leptotrichia, выделенных из клинического материала, осуществляют посев части изолированной колонии калиброванной бактериологической петлей (0,2 мм) на поверхность пластинчатой среды «Уриселект» методом штрихования в чашки Петри и далее инкубируют посевы в микроаэрофильных (5%-10% CO₂) и/или аэробных условиях, t_opt=+35+37°С в течение 48-72 часов.

При повторных посевах: культивировании изолятов лептотрихий, для временного сохранения чистой культуры, осуществляют посев части изолированной колонии стерильным ватным тампоном на поверхность пластинчатой среды «Уриселект» методом газона в чашки Петри и далее инкубируют посевы в микроаэрофильных (5%-10% СО₂) и/или аэробных условиях, t_opt=+35+37°С в течение 48-72 часов.

Из таблицы №1 видно, что эффективность культивирования Leptotrichia в результате первичного посева клинического материала из различных биотопов полости рта, высеваемость/всхожесть лептотрихий достигала около 30% (36,02%±5,61%), в сравнении с литературными данными, когда на 200 посевов из полости рта было получено 2 устойчивых клинических изолята.

Преимуществом предлагаемого способа являются:

- стандартизация культивирования Leptotrichia путем использования хромогенной коммерческой питательной среды «Уриселект» от известных производителей, зарекомендовавшей себя на рынке клинико-бактериологических услуг как высококачественный, эффективный продукт;

- простота приготовления среды, длительный срок ее хранения в холодильнике и, возможно, при комнатной температуре (до 6 мес.) без изменения ростовых и диагностических свойств среды;

- обогащение среды, содержащей триптофан и пептон, растворимым крахмалом (стабилизатор и питательный субстрат), который лептотрихии могут ферментировать, что придает среде дополнительные преимущества;

- простота определения колоний лептотрихии по изменению цвета среды под колонией и окрашивание самой колонии в ярко-голубой цвет, по характерной морфологии колоний, выросших на поверхности среды «Уриселект»: мелкие, суховатые, шероховатые, приподняты над поверхностью, плоские, с неровным краем, зрелые колонии имеют более интенсивно окрашенный центр, старые колонии темнеют;

- повышение эффективности изоляции Leptotrichia из клинического материала;

- снижение потерь штаммов при повторных пересевах;

- возможность проводить накопление чистой культуры на пластинчатой среде;

- возможность увеличить срок хранения штаммов Leptotrichia в условиях холодильника при 4°С до 8-10 дней (по данным литературы - в среднем выживаемость штаммов без трансфера - около 5 дней);

- применить «золотой стандарт» для трудно культивируемых организмов;

- исследовать фенотипические свойства изолятов дополнительными методами;

- возможность более качественно исследовать нормофлору различных биотипов тела человека;

- наличие стандартной среды и возможность получать чистые культуры Leptotrichia даст преимущество для изучения роли лептотрихии в инфекционной патологии человека, аргументировать этиологическую роль оппортунистического патогена в различных областях медицинских знаний;

- простота применения;

- экономичность.

Пример 1. Больная С., 65 лет. Обратилась с жалобами на чувство увеличения языка, першение в горле, сухость, жжение и дискомфорт в полости рта, сухость губ. Отмечает появления данных жалоб через три дня после протезирования зубов. Больна в течение трех лет. Эффект от терапии отмечает временный, не более недели. Во время обращения предъявляет жалобы на постоянный дискомфорт и изменение качества жизни. Объективно: на поверхности красной каймы губ отмечаются мелкие корочки, шелушение, сухость. На слизистой оболочке щек имеется нежный, полупрозрачный налет белого цвета, снимается с трудом, после удаления налета слизистая кровоточит. Язык обложен плотным бело-серым налетом по спинке языка, у корня языка - налет желто-коричневого цвета, выраженная складчатость языка, налет полностью не снимается. Проведена микроскопия соскобов с корня языка, слизистой оболочки щек, красной каймы губ. Обнаружены: лептотрихии в большом количестве и кандиды. Одновременно выполняли посев на специальные питательные среды для выращивания грибов и анаэробных бактерий. На хромогенной среде «Уриселект» через 48 часов анаэробного культивирования имеется значительный рост лептотрихии, КОЕ=10⁶/1 см². Идентификация проведена микро-тестами ANAEROtest 23. Изолят изучен в соответствии с планом научной работы.

Пример 2. Ребенок Г., 12 лет, из категории часто болеющих детей с рецидивами ОРВИ. Диагностирован кариес зубов, индекс КПУ 9, Гигиенический индекс по Федорову-Володкиной составил 2,3 балла, что характеризует неудовлетворительную гигиену полости рта. Из кариозного зуба был взят биоматериал с последующим посевом на среду «Уриселект», инкубация в микроаэрофильных условиях в эксикаторе 48 часов. Наблюдается хорошо видимый рост 5 видов колоний, из них по стандартной методике идентифицированы лептотрихии, стафилококки, стрептококки, лактобактерии. Сделаны пересевы лептотрихий на пластинчатый «Уриселект». После 48-часовой инкубации в термостате посевы помещены в холодильник, где хранились при 4°С 8 дней. Контрольный высев на «Уриселект» дал видимый рост лептотрихии через 48 часов.

Таблица 1 Эффективность культивирования Leptotrichia Биотоп ротовой полости Количество исследований,
n= Идентифицированные изоляты Leptotrichia,
L= Утраченные штаммы,
l= Эффективность культивирования*
(L-I)÷n×100% корень языка 324 121 28 28,7% слюна 322 88 18 21,74% десневой желобок 304 185 35 49,34% кариозная полость зуба 212 137 43 44,33% М±m 290,5±22,99 132,75±17,48 31±4,59 36,02%±5,61% Примечание: * Использована формула, по которой рассчитана эффективность культивирования: (L-l)÷n×100%, где L = идентифицированные изоляты Leptotrichia, l = утраченные штаммы, n = количество исследований/посевов

Способ по изобретению осуществляют путем посева клинического материала из разведений на поверхность пластинчатой хромогенной среды «Уриселект», представляющей собой неселективную, агаризированную, богатую пептоном и триптофаном среду производства «Bio-Rad» (Франция), методом секторных посевов. Чашки с посевами инкубируют в анаэробных и микроаэрофильных (5%-10% CO₂) условиях, t_opt=+35+37°C, в течение 48-72 часов. При необходимости осуществляют повторные пересевы выросших колоний изолятов лептотрихий, при этом пересев проводят методом штрихования и/или стерильным ватным тампоном и инкубируют пересевы в тех же условиях. Способ культивирования лептотрихий на среде «Уриселект» позволяет повысить эффективность изоляции Leptotrichia из клинического материала, проводить предположительную идентификацию Leptotrichia по изменению цвета субстрата, снизить потери штаммов при повторных пересевах. Эффективность культивирования трудно культивируемых лептотрихий - резидентов оромикробиоценоза полости рта человека - составляет более 30%, при этом способ прост в осуществлении и не требует дорогостоящей аппаратуры. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ культивирования бактерий рода Leptotrichia - резидентов микрофлоры полости рта, отличающийся тем, что осуществляют посев клинического материала из приготовленных разведений 10^-3-10^-5 калиброванной бактериологической петлей (0,2 мм, емкость 0,005 мл) методом секторных посевов в чашки Петри на поверхность пластинчатой среды «Уриселект», представляющей собой стандартную хромогенную агаризованную среду, богатую пептоном и триптофаном, инкубируют посевы в анаэробных и микроаэрофильных (5-10% СО₂) условиях, t_opt=35-37°C в течение 48-72 ч и далее при необходимости осуществляют повторные пересевы выросших колоний изолятов лептотрихий.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что повторные пересевы изолятов лептотрихий осуществляют из части изолированной колонии бактериологической петлей на поверхность пластинчатой среды «Уриселект» методом штрихования в чашки Петри и инкубируют посевы в тех же условиях.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что повторные пересевы для временного сохранения чистой культуры лептотрихий осуществляют путем посева части изолированной колонии стерильным ватным тампоном на поверхность пластинчатой среды «Уриселект» методом газона и инкубируют посевы в тех же условиях.