СОЕДИНЕНИЯ ГЕКСЕНОНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЯХ Российский патент 2015 года по МПК C07D295/03 C07C275/20 C07C335/14 A61K31/17 A61K31/5375 A61P9/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицинской химии и, в частности, к гексеноновому соединению и фармацевтической композиции. Настоящее изобретение также относится к применению соединений и его фармацевтических композиций для борьбы с апоптозом, профилактики или лечения заболеваний или расстройств, связанных с апоптозом, и, в частности, для защиты клеток миокарда и для профилактики или лечения заболеваний или расстройств, связанных с апоптозом клеток миокарда.

Уровень техники

Апоптоз обычно относится к запрограммированной клеточной гибели клеток организма, происходящей регуляцией внутриклеточных генов и их продуктов в процессе развития или под действием некоторых факторов. Апоптоз обычно существует в биосфере в физиологическом состоянии и патологическом состоянии. Он играет важную роль в развитии эмбриона и морфогенеза, стабильности нормальных клеток в тканях, защиты и иммунной реакции организма, повреждении клеток, вызванном заболеванием или отравлением, старении, образование и развитие опухолей и является одной из самых горячих точек в биомедицинских исследованиях.

Некоторые исследования показывают, что возникновение многих серьезных заболеваний относится к чрезмерному апоптозу клеток, например, редукция CD4⁺ Т-клеток в процессе развития ADIS; гибель клеток, опосредованная цитотоксическими Т-клетками при реакции отторжения трансплантата; апоптоз клеток миокарда и нервных клеток при ишемии и реперфузионном повреждении, болезни с деградацией нервной системы (такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т.д.); апоптоз, вызванный воздействием ионизирующего излучения во многих тканях.

Некоторые свидетельства указывают, что апоптоз кардиомиоцитов тесно связан с возникновением, развитием и прогнозом многих заболеваний сердца. В исследовании апоптоза кардиомиоцитов было установлено, что инфаркт сердечной мышцы не эквивалентен некрозу миокарда и апоптоз является одним из механизмов развития инфаркта миокарда, и является основным механизмом смерти от инфаркта раннего инфаркта миокарда и смерти от ишемии/реперфузии, и апоптоз кардиомиоцитов в большом количестве при этом усугубляет повреждение миокарда. В 1989 году Nepomniashchikh и др. обнаружили при наблюдении ультраструктуры при атрофии миокарда, что синтез кардиомиоцитов структурного белка снижается и количество клеток снижается, но не сопровождается пропорциональным снижением клеточных ядер, таким образом, предварительно предложили, что атрофия миокарда вызвана апоптозом. 1994 году Gottlieb и Kawano и др. получили прямые доказательства апоптоза кардиомиоцитов с помощью электронного микроскопа в сочетании с гель-электрофорезом ДНК, в котором первый раскрыл реперфузионные повреждения, индуцированные апоптозом кардиомиоцитов кроликов, а последний подтвердил, что у пациентов с миокардитом имелся сопутствующий апоптоз кардиомиоцитов. Tanaka и др. также подтвердили существование апоптоза кардиомиоцитов у мышей-сосунков. С развитием методологии и исследования апоптоза, патологические функции апоптоза кардиомиоцитов были установлены при многих заболеваниях сердца. Некоторые исследования указывают, что заболевание сердца у спонтанно гипертензивных крыс (SHR) имеет отношение к апоптозу; переход от патологического утолщения сердца до сердечной недостаточности на поздней стадии вызван апоптозом кардиомиоцитов; острый инфаркт миокарда также вызывает апоптоз в ранней стадии миокарда и реперфузии, кроме некроза; апоптоз кардиомиоцитов также обнаружен в пересаженном сердце и при недоразвитии правого желудочка миокарда и также кислородное голодание вызывает апоптоз кардиомиоцитов.

Апоптоз до некоторой степени может быть рекуперирован и апоптоз при инфаркте миокарда и ишемии/реперфузии имеет свои особенности и закономерности, так что особенности могут быть использованы для профилактики и ослабления апоптоза и могут дать информацию для клинической профилактики ишемии/реперфузии, в процессе реперфузии, апоптоз в области полосы сокращения (вокруг локализации травмы) индуцируется некоторыми провоцирующими факторами, так что ингибиторы апоптоза, такие как лекарственные препараты, могут быть использованы для предотвращения апоптоза и лечения соответствующего заболевания, вызванного апоптозом.

Однако в настоящее время существует несколько видов и много лекарственных препаратов, которые могут быть клинически использованы для борьбы с апоптозом и защиты клеток и их селективность и направленность не являются удовлетворительными, и поэтому большое значение имеет непрерывная разработка новых, безопасных и эффективных лекарственных препаратов по борьбе с апоптозом клеток и защиты и, в частности, лекарственных препаратов с новым механизмом действия.

Раскрытие изобретения

Для разработки новых, безопасных и эффективных лекарственных препаратов для борьбы с апоптозом и защиты клеток, после проведения обширных экспериментальных исследований в течение длительного срока изобретатели обнаружили группу гексеноновых соединений, которые являются эффективными в борьбе с апоптозом и защите клеток миокарда и.могут быть использованы для профилактики или. лечения заболеваний или расстройств, связанных с апоптозом кардиомиоцитов. В частности, первый аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы I, или его изомеру, фармацевтически приемлемой соли или сольвату.

где А представляет =S, -SR₄ или =O;

X представляет F, Cl, Br или I;

R₁ представляет фенил, фенил-C₁-C₆-алкил-, где фенил является незамещенным или замещенным 1-4 (например, 1-2, 1, 2, 3 или 4) заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, гидрокси, амино, циано, C₁-C₆-алкила, C₁-C_6-алкокси, C₁-C₆-галогеналкила, где алкил, алкокси и галогеналкил может быть необязательно замещен гидроксилом, -O-(C₁-C₄)-алкилом, оксо, амино, -NH-(C₁-C₄)-алкилом или -N-[(C₁-C₆)-алкилом]₂ или алкилом, алкокси и галогеналкилом необязательно включающим -O-,-S-, -NH-, -COO- или -CONH-; 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо; или замещенное гетероциклическое кольцо, в котором гетероциклическое кольцо является незамещенным или замещенными 1-3 (например, 1-2, 1, 2, или 3) заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, гидрокси, амино, циано, C₁-C₆-алкила, C₁-C₆-алкокси, C₁-C₆-галогеналкила, где алкил, алкокси и галогеналкил может быть необязательно замещен гидроксилом, -O-(C₁-C₄)-алкилом, оксо, амино, -NH-(C₁-C₄)-алкилом или -N-[(C₁-C₆)-алкилом]₂, или алкилом, алкокси и галогеналкилом, необязательно включающим -O-, -S-, -NH- или -COO-, и гетероциклическое кольцо может быть гетероциклом с двумя атомами азота в кольце, гетероциклом с атомами азота и кислорода, или гетероциклом с атомами серы и азота;

R₂ и R₃ представляют водород, C₁-C₆ алкил, C₃-C₆ циклоалкил, замещенный C₃-C₆ циклоалкил, C₁-C₆-алкокси, C₁-C₆-алкил, амино C₁-C₆ алкил, монозамещенный или ди-замещенный амино C₁-C₆ алкил, фенил C₁-C₆ алкил, замещенный фенил C₁-C₆ алкил, гетероциклический C₁-C₆ алкил, замещенный гетероциклический C₁-C₆ алкил, фенил, замещенный фенил, или C₁-C₆ гетероциклическую или замещенную C₁-C₆ гетероциклическую группу, в которой R₂ и R₃ могут быть связаны вместе с образованием кольца; и

R₄ представляет C₁-C₆ алкил.

Предпочтительно соединение настоящего изобретения является соединением формулы (I), или его изомером, фармацевтически приемлемой солью и сольватом, где:

А представляет =S, -SR₄ или =O;

X представляет F, Cl, Br или I;

R₁ представляет фенил, фенил-C₁-C₆ алкил-, где фенил является незамещенным или замещенным 1-4 (например, 1-2, 1, 2, 3 или 4) заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, гидрокси, амино, циано, C₁-C₆ алкила, C₁-C₆ алкокси, C₁-C₆ галогеналкила, где алкил, алкокси и галогеналкил может быть необязательно замещен гидроксилом, -O-(C₁-C₄)-алкилом, оксо, амино, -NH-(C₁-C₄)-алкилом или -N-[(C₁-C₆)-алкилом]₂ или алкилом, алкокси и галогеналкилом, необязательно замещенным -О-,-S-, -NH-, -COO- или -CONH-; тиенил, тиазолил, где тиенил, тиазолил являются незамещенными или замещенными 1-3 (например, 1-2, 1,2 или 3), заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из: галогена, нитро, гидрокси, амино, циано, C₁-C₆ алкила, C₁-C₆ алкокси и C₁-C₆ галогеналкила, где алкил, алкокси и галогеналкил может быть необязательно замещен гидроксилом, -O-(C₁-C₄)-алкилом, оксо, амино, -NH-(C₁-C₄)-алкилом или -N-[(C₁-C₆)-алкилом]₂, или алкилом, алкокси и галогеналкилом, необязательно включающим -O-, -S-, -NH- или -COO-;

R₂ и R₃ представляют водород, C₁-C₆ алкил, C₃-C₆ циклоалкил, замещенный C₃-C₆ циклоалкил, C₁-C₆ алкокси C₁-C₆ алкил, амино C₁-C₆ алкил, моно-замещенный или ди-замещенный амино C₁-C₆ алкил, фенил C₁-C₆ алкил, замещенный фенил C₁-C₆ алкил, гетероциклический C₁-C₆ алкил, фенил, замещенный фенил, или гетероциклическую или замещенную гетероциклическую группу, где R₂ и R₃ могут быть связаны вместе с образованием насыщенного циклоалкила, азот- или кислородсодержащего гетероциклического кольца; и

R₄ представляет метил, этил, пропил, изопропил, бутил или пентил.

В частности, соединение настоящего изобретения представляет соединение формулы (I), или его изомер, фармацевтически приемлемую соль и сольват, где:

А представляет =S, -SR₄ или =O;

X представляет Cl;

R₁ представляет фенил или 2-тиенил;

R₂ и R³ представляют водород, метил, изопропил, 2-метоксиэтил, 3-изопропоксипропил, 2-N,N-диметилэтил, циклогексил, циклогептил, орто-метоксифенил, орто-фторфенил, орто-хлорфенил, пара-хлорфенил, бензил или 8 - хинолил, где R₂ и R₃ могут быть связаны вместе с образованием пиперидина, морфолина или N-метилпиперазина; и

R₄ представляет метил или этил.

В частности, соединение формулы (I), предпочтительно является следующим соединением:

(1Е)-1 -фенил-5-(1-морфолинилтиокарбоксамидо)-6,6,6-трихлор-1-ен-3-гексанон, или его изомером, фармацевтически приемлемой солью и сольватом.

Соединение формулы (I) настоящего изобретения может быть получено следующим способом:

Принимая соединения (1) в качестве примера, соединение настоящего изобретения синтезировано с использованием бензальдегида в качестве исходного материала путем взаимодействия бензальдегида с ацетоном в растворе гидроксида натрия в метаноле для получения (1Е)-1-фенил-1-ен-3-ацетона, который затем реагирует с трихлорацетальдегидом при катализе LDA для получения интермедиата 1, хлорированием интремедиата 1 тионилхлоридом и взаимодействием его с тиоцианатом калия для получения интремедиата 2 и, в заключение, кипячением с обратным холодильником интремедиата 2 с морфолином в тетрагидрофуране для получения соединения (1).

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) или его изомер, фармацевтически приемлемую соль и сольват, и наполнитель или разбавитель.

Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, фармацевтически приемлемой соли и сольвата в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения для изготовления лекарственного средства для борьбы с апоптозом или для профилактики или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом.

Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, фармацевтически приемлемой соли и сольвата в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения для изготовления лекарственного средства для защиты кардиомиоцитов и предотвращения или лечения болезни или расстройства, связанного с апоптозом кардиомиоцитов. Настоящее изобретение относится к способу борьбы с апоптозом или для профилактики или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом, способ включает назначение при необходимости пациенту, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его изомера, фармацевтически приемлемой соли и сольвата в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к способу защиты кардиомиоцитов или для профилактики или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом кардиомиоцитов, способ включает назначение при необходимости пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его изомера, фармацевтически приемлемой соли и сольвата.

Болезни или расстройства, связанные с апоптозом в соответствии с настоящим изобретением включают: сердечнососудистые заболевания, нервные дегенеративные заболевания, рассеянный склероз, вирусные инфекции и т.д.

Болезни или расстройства, связанные с апоптозом кардиомиоцитов в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничены: (i) атрофией миокарда, (ii), миокардитом, (iii), сердечной недостаточностью, (iv) повреждением миокарда, вызванным первичной гипертензией, (v) повреждением миокарда, вызванным ранней стадией острого инфаркта миокарда, (vi), повреждением миокарда, вызванным реперфузией при остром инфаркте миокарда, (vii), патологическими изменениями кардиомиоцитов, вызванные трансплантацией сердца или (viii) диспластическим миокардозом; или апоптозом кардиомиоцитов, вызванного гипоксией или склерозом сердечно-сосудистой системы.

В соответствии с настоящим изобретение, термин "гетероциклическое кольцо" включает, но не ограничивается: пиридином, пирролом, фураном, тиофеном, пиразолом, имидазолом, тиазолом, оксазолом, изоксазолом, индолом, бензофураном, бензимидазолом, карбазолом, пиридазином, пиримидином, пиразином, хинолином, изохинолином, пурином, фенотиазином и феназином.

Специалистам в данной области техники понятно, что в соединении формулы I имеется хиральный центр. Когда требуется один энантиомер соединения формулы I, он может быть получен с использованием реагентов, присутствующих в форме одного энантиомера на всех возможных стадиях, или получен проведением реакции в присутствии реагента или катализатора в форме одного энантиомера или получен разделением смеси стереоизомеров обычных методами. Некоторые предпочтительные методы включает разделение с использованием микроорганизмов, хиральных кислот, таких как любая подходящая кислота, например, миндальная кислота, камфорсульфоновая кислота, винная кислота, молочная кислота и т.д. в форме соли диастереомера, или разделение с хиральным основанием, таким как bracine (бруцин), алкалоид хинного дерева или их производные в форме соли диастереомера. С обычно используемыми методами можно ознакомиться в "Enantiomers, Racemates and Resolution" (Энантиомеры, рацематы и разделение) as edited by Jaques et al (Wiley Interscience, 1981).

Специалистам в данной области техники понятно, что соединения настоящего изобретения также могут быть использованы в форме его фармацевтически приемлемой соли или сольвата. Физиологически приемлемые соли соединения формулы I включают обычные соли, образованные с фармацевтически приемлемой неорганической кислотой или органической кислотой или неорганическим основанием или органическим основанием и кислотно-аддитивной соли четвертичного аммония. Более конкретные примеры подходящих солей кислот включают соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, азотной кислоты, хлорной кислоты, фумаровой кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, янтарной кислоты, гликолевой кислоты, муравьиной кислоты, молочной кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, памовой кислоты, малоновой кислоты, гидроксималеиновой кислоты, фенилуксусной кислоты, глутаминовой кислоты, бензойной кислоты, салициловой кислоты, фумаровой кислоты, толуолсульфокислоты, метилсульфоновой кислоты, нафталин-2-сульфокислоты, бензолсульфокислоты, гидроксинафтойной кислоты, йодистоводородной кислоты, яблочной кислоты, steroic (стеариновая), дубильной кислоты и т.д. Что касается других кислот, таких как щавелевая кислота, хотя они сами не являются фармацевтически приемлемыми, они могут быть использованы для получения солей в качестве интермедиатов для получения соединения настоящего изобретения и его фармацевтически приемлемых солей. Более конкретные подходящие щелочные соли включают соли натрия, лития, калия, магния, алюминия, кальция, цинка, N,N-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, N-метилглюкозамина и новокаина. Соединения настоящего изобретения, указанные далее, включают соединение формулы I и его фармацевтически приемлемую соль и сольват.

Настоящее изобретение дополнительно включает пролекарство соединения настоящего изобретения и после введения пролекарства оно химически превращается метаболическим путем в активный лекарственный препарат.В общем, этот вид пролекарства является функциональным производным соединения настоящего изобретения, которое может быть легко превращено в искомое соединение формулы (I). Например, "Design Of Prodrugs" (Разработка пролекарств), edited by Н Bund Saard, Elsevier, 1985, описывает обычные способы выбора и получения подходящих производных пролекарства.

Настоящее изобретение также включает любые активные метаболиты соединения настоящего изобретения.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей рацемат или оптический изомер соединения настоящего изобретения, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, и являющейся пригодной для лечения в организме и обладающей биосовместимостью. Фармацевтическая композиция может быть изготовлена в различных формах для различных путей введения. Соединение настоящего изобретения также может быть изготовлено в виде различных фармацевтически приемлемых солей.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит эффективное количество соединения формулы I настоящего изобретения или его фармацевтически приемлемой соли или гидрата и один или более подходящих фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничены: ионитами, оксидом алюминия, стеаратом алюминия, лецитином, сывороточным белком, таким как альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфат, глицерин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов растительных насыщенных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соль цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, целлюлозные вещества, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза натрия, полиакрилаты, пчелиный воск и ланолин.

Фармацевтическая композиция соединения настоящего изобретения может быть введена любым из следующих способов: пероральным введением, ингаляцией распыляемого раствора, ректальным введением, назальным введением, буккальным введением, местным введением, парентеральным введением, например, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной, интратекальной, внутрижелудочковой, внутригрудинной, внутричерепной инъекцией или перфузией, или введением с помощью эксплантированного депо, предпочтительно пероральным введением, внутрибрюшинным или внутривенным введением.

Для перорального введения соединение настоящего изобретения может быть получено в любой приемлемой формы для перорального применения, включая, но без ограничения, таблетки, капсулы, водные растворы или водные суспензии. Таблетки используют носитель, обычно включающий лактозу и кукурузный крахмал, дополнительно включающий смазывающее вещество, такое как стеарат магния. Капсулы используют разбавитель, обычно включающий лактозу и сухой кукурузный крахмал. Водные суспензии обычно используют смесь активных компонентов и подходящий эмульгатор и суспендирующее средство. При необходимости вышеуказанные пероральные лекарственные формы могут дополнительно включать некоторое количество подсластителей, ароматизаторов или красителей.

Для местного применения, особенно при лечении местным наружным применением нейрогенной болезни легко доступной пораженной поверхности или органа, таких как глаза, кожа или нижний отдел желудочно-кишечного тракта, соединение настоящего изобретения может быть изготовлено в различных лекарственных формах для местного применения для соответствующих различных пораженных поверхностей или органов, которые проиллюстрированы следующим образом:

Для местного применения на глазах соединение настоящего изобретения может быть изготовлено в лекарственной форме в виде мелкодисперсной суспензии или раствора, в которых использованный носитель является изотоническим стерильным физиологическим раствором с определенным pH, к которым может быть добавлен или не добавлен консервант, такой как соль хлорбензилалканола. Для использования для глаз, соединение может быть изготовлено в форме мази, такой как вазелиновая мазь.

Для местного применения на коже, соединение настоящего изобретения может быть изготовлено в соответствующих лекарственных формах, таких как мази, лосьоны или кремы, в которых активный компонент суспендирован или растворен в одном или нескольких носителях. Носители, пригодные для мазей, включают, но не ограничены: минеральным маслом, жидким парафином, белым вазелином, пропиленгликолем, полиэтиленоксидом, полипропиленоксидом, эмульгированным воском и водой; носители, используемые в лосьонах или кремах, включают, но не ограничены: минеральным маслом, моностеаратом сорбита, Tween 60, воском сложного эфира гексадекана, ароматическим гексадециленовым спиртом, 2-октилдодеканолом, бензиловым спиртом и водой.

Соединение настоящего изобретения также может быть введено в лекарственной форме стерильных инъекций, в том числе водные или масляные суспензии для стерильной инъекции или стерильных растворов для инъекции. Используемые носители и растворители включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильное нелетучее масло также может быть использовано в качестве растворителя или суспензионной среды, такое как моноглицериды или диглицериды.

Следует также отметить, что дозы и способы использования соединения настоящего изобретения зависят от многих факторов, включая возраст, масса тела, пол, природного состояния здоровья, питания, активности соединения, время введения, скорость обмена веществ, тяжести болезни и субъективная оценка врача при диагнозе. Положительные эффекты изобретения

Настоящее изобретение относится к группе гексеноновых соединений, и было показано, что такие соединения эффективны в борьбе с апоптозом и в защите клеток и таким образом предлагают новый способ и подход в лечении заболеваний или расстройств, вызванных апоптозом, и, в частности, в лечении заболеваний или расстройств, вызванных апоптозом кардиомиоцитов.

Осуществление изобретения

Осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы следующим образом в сочетании с последующими примерами, но специалистам в данной области техники понятно, что последующие примеры служат только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение изобретения. Методики в примерах, которые не детализированы осуществляется в обычных условиях или условиях, предложенных производителями. Все реагенты или приборы, производители которых не указаны, являются обычными коммерчески поставляемыми продуктами.

Температуру плавления соединений измеряют прибором для измерения температуры плавления RY-1, и термометры не калибруют. Масс-спектры регистрируют с использованием Micromass ZabSpec масс-спектрометра высокого разрешения (разрешение: 1000). ¹Н ЯМР измеряют с использованием JNM-ECA-400 сверхпроводящего ЯМР спектрометра, рабочая частота: ¹Н ЯМР 400 МГц, ¹³С ЯМР 100 МГц.

Пример 1. (1Е)-1-фенил-5-(1-морфолинилтиокарбоксамидо)-6,6,6-трихлор-1 -ен-3-гексанон

3 мл ацетона добавляют к 4,80 г 10% водного раствора NaOH, и смесь перемешивают при 30°C в течение 5 минут, добавляют по каплям 1 мл бензальдегида, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем реакционный раствор разделяют и органический слой элюируют петролейный эфир:этилацетат=20:1 в качестве вытесняющего растворителя для получения 1,00 г (1Е)-1-фенил-1-ен-3-бутанона в виде желтых кристаллов. 0,64 г диизопропиламина растворяют в 10 мл ТГФ под защитой газообразного азота и раствор охлаждают до -40°C, добавляют по каплям 0,40 г n-бутиллития, перемешивают в течение 30 минут, и затем охлаждают до -78°C. 0,84 г (1Е)-1- фенил- 1-ен-3-бутанона растворяют в 15 мл ТГФ и раствор добавляют по каплям к раствору LDA, и затем проводят реакцию при -78°C в течение 40 мин. 1,19 г трихлорацетальдегида растворяют в 15 мл ТГФ и раствор добавляют по каплям к вышеуказанному реакционному раствору, и затем проводят реакцию при -78°C в течение 12 часов. После того как температура повышается до -40°C, к реакционной смеси добавляют 20 мл насыщенного водного раствора NH₄Cl, перемешивают в течение 30 мин, нагревают до комнатной температуры и затем добавляют 20 мл этилацетата для экстракции. Органический слой элюируют петролейный эфир: этилацетат=6:1 в качестве вытесняющего растворителя для получения 1,49 г (1Е)-1-фенил-5-гидрокси-6,6,6-трихлор-1-ен-3-гексанона в виде светло-желтых кристаллов. Его растворяют в 20 мл ТГФ и к раствору добавляют 1,1 мл тионилхлорида и кипятят в течение 6 часов. Растворитель отгоняют и остаток растворяют в 20 мл ацетона, затем добавляют 0,74 г KSCN и перемешивают при 40°C в течение 1,5 часов. Петролейный эфир-этилацетат=30:1 используют в качестве вытесняющего растворителя для элюирования после окончания реакции для получения 1,2 г (1Е)-1-фенил-5-изотиоцианат-6,6,6-трихлор-1-ен-3-гексанона в виде светло-желтого твердого вещества. 0,33 г твердого вещества и 0,06 мл морфолина кипятят с обратным холодильником в ТГФ в течение 1 ч для осаждения белого твердого вещества, которое перекристаллизовывают из ТГФ для получения 0,10 г чистого продукта. ¹П-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 3,28-3,43 (м, 4Н); δ 3,46-3,58 (м, 4Н); δ 3,68-3,74 (м, 2Н); δ 3,81-3,87 (м, 2Н); δ 6,27-6,29 (м, 1H); δ 7,02-7,06 (д, 1Н); δ 7,43-7,46 (т, 3Н); δ 7,60-7,64 (д, 1Н); δ 7,21-7,74 (м, 2Н); δ 8,03-8,05 (д, 1Н). MS (TOF) 421,7 (М+).

Пример 2. Экспериментальное определение активности соединения в защите кардиомиоцитов

Первичная культура кардиомиоцитов

Изоляцию и культуру кардиомиоцитов проводят методом дифференциальной адгезии (Kreider, A. Messing, Н. Doan, S.U. Kim, R.P. Lisak and D.E. Pleasure, Enrichment of Schwann cell cultures from neonatal rat sciatic nerve by differential adhesion (Обогащение культур шванновских клеток седалищного нерва новорожденных крыс дифференциальной адгезией), Brain Res 2 (1981), pp.433-444). Используют грудных новорожденных мышей линии Wistar в течение 24 часов, стерилизуют кожу живота настойкой йода и этанолом, проводят торакотомию с помощью ножниц на подгрудинной срединной линии с отклонением влево, сердце извлекают после наклонной торакотомии и помещают в PBS, предварительно охлажденный льдом; в сердце осторожно закачивают и удаляют 0,01 М PBS для удаления клеток крови и других тканей, и затем разрезают на куски размером 0,5 мм³, промывают 0,01 М PBS 2-3 раза; части помещают в коническую колбу, добавляют 4 мл 0,125% панкретин, 1 мл 0,1% коллагеназы II (конечная концентрация соответственно 0,1% и 0,02%), встряхивают на водяной бане при 37°C в течение 10 минут, маточник отбрасывают; затем снова 4 мл 0,125% панкретин и 1 мл 0,1% коллагеназы II встряхивают на водяной бане при 37°C для расщепления в течение 10 минут, маточник отделяют и переносят в центрифужные пробирки и к маточнику добавляют DMEM, содержащую 10% FBS для завершения расщепления; стадию встряхивания и расщепления на водяной бане повторяют 3-4 раза, до полного расщепления частей ткани, собранную суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, маточник удаляют, затем культуральную среду добавляют для ресуспендирования; ресуспендированные клетки высевают в колбу для культуры клеток, помещают в CO₂ инкубатор при температуре 37°C для инкубации в течение 1,5 ч, затем культуральную среду отделяют, пересчитывают под микроскопом, затем DMEM культуральную среду, содержащую 10% FBS, используют для регулировки плотности клеток, высевают в количестве 1×10⁴ в планшете с 96 ячейками, помещенным в инкубатор с 5% CO₂ при температуре 37°C в течение 24 ч, затем половину среды заменяют, дополнительно добавляют культуральную среду, содержащую 0,1% Brdu, затем среду заменяли один раз за 48 часов, и первичные кардиомиоциты получают после 4 дней культивирования.

Измерение степени подавления клеток (МТТ)

Изолированную первичную культуру кардиомиоцитов высевают в количестве 10⁴ клеток на ячейку в планшете с 96 ячейками и объем каждой ячейки составляет 100 мкл (краевые ячейки заполняют стерильным PBS). После культивирования в инкубаторе с 5% CO₂ и 37°C в течение 4 дней, в них добавляют соединение формулы I примера 1 до различных концентраций (0,3 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ, 30 мкМ, 100 мкМ), 3 двойных ячейки используют для каждой концентрации, при этом также используют нулевые ячейки (культуральная среда, МТТ, ДМСО), и контрольные ячейки (культуральная среда, ДМСО). После непрерывного культивирования в течение 48 часов в каждую ячейку добавляют 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл, смешанного с PBS (рН=7,4), т.е. 0,5% МТТ) и культивирование продолжают в течение 4 часов. После окончания культивирования, культуральную среду из ячеек тщательно удаляют. В каждую ячейку добавляют 150 мкл ДМСО, встряхивают при низкой скорости на плоском встряхивателе в течение 10 минут, так чтобы кристаллы достаточно растворились. Величину оптической плотности (ОП) каждой ячейки измеряют при длине волны 550 нм устройством для иммуноферментного анализа, и каждую ячейку измеряют 5 раз, и результаты регистрируют. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Эффект воздействия соединения при различных концентрациях на коэффициент выживаемости кардиомиоцитов по определению методом МТТ Группа Степень подавления кардиомиоцитов (%) Контрольная группа 100 Соединение примера 1 Группа 100 мкМ 2,91±1,88 Группа 300 мкМ 0,76±0,42

Результаты показывают, что соединение примера 1 при концентрации 300 мкМ не оказывают воздействия на коэффициент выживаемости нормальных кардиомиоцитов

Определение активности в защите кардиомиоцитов: активность в защите от апоптоза кардиомиоцитов, вызванного TG

Кардиомиоциты подвергаются первичной культуре вышеуказанным методом и к ним добавляют тапсигаргин (TG) для индуцирования апоптоза. Соединение настоящего изобретения добавляют для предварительной обработки за 30 мин до индуцирования апоптоза. Клетки делят случайным образом на 5 групп: (1) контрольная группа растворителя (ДМСО); (2) TG промежуточная группа (0,4 мкМ); (3) TG (0,4 мкМ)+промежуточная группа соединения (0,3 мкМ); (4) TG (0,4 мкМ)+промежуточная группа соединения (1 мкМ); TG (0,4 мкМ)+промежуточная группа соединения (3 мкМ). TG смешивают с ДМСО, содержание в маточнике составляет 4 мМ; и соединение настоящего изобретения смешивают с ДМСО и содержание в маточнике составляет 150 мМ. Коэффициент выживаемости клеток определяют вышеуказанным методом МТТ для тестирования защитного эффекта соединения настоящего изобретения от TG-индуцированного апоптоза кардиомиоцитов и результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Эффект воздействия соединения при различных концентрациях на TG-индуцированный апоптоз кардиомиоцитов по определению методом МТТ Группа Коэффициент выживаемости кардиомиоцитов (%) Контрольная группа 100 TG промежуточная группа 59±1.1 Соединение примера 1 Группа 0,3 мкМ 76,3±7,6 Группа 1 мкМ 83,3±7,1 Группа 10 мкМ 92,2±5,6

Примечание: коэффициент выживаемости клеток=1 - степень подавления клеток

Экспериментальные результаты: по сравнению с группой с добавлением только TG коэффициент выживаемости кардиомиоцитов значительно увеличивается, когда TG и соединение примера добавлены вместе, указывая, что соединение примера, как указано в таблице 2, может значительно нормализовать TG-индуцированный апоптоз и обладает защитным действием по отношению к кардиомиоцитам.

Хотя конкретные варианты осуществления изобретения описаны подробно, специалистам в данной области техники понятно, что в соответствии с раскрытым существом изобретения эти детали могут быть модифицированы и заменены и все эти изменения входят в объем притязаний настоящего изобретения. Объем притязаний настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

Изобретение относится к соединению структурной формулы I, которое может быть использовано для защиты кардиомиоцитов или для профилактики или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом кардиомиоцитов. В формуле I А представляет =S, -SR₄ или =О, X представляет F, Cl, Br или I, R₁ представляет фенил, R₂ и R₃ связаны вместе с образованием морфолина и R₄ представляет C₁-С₆-алкил. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей указанные соединения, к применению соединения для изготовления лекарственного средства для защиты кардиомиоцитов или для профилактики, или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом кардиомиоцитов, и к способу получения указанных соединений. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

(I)

1. Соединение формулы I

или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, где
А представляет =S, -SR₄ или =О;
X представляет F, Cl, Br или I;
R₁ представляет фенил;
R₂ и R₃ связаны вместе с образованием морфолина;
и R₄ представляет C₁-С₆-алкил.

2. Соединение по п. 1, где
R₄ представляет метил, этил, пропил, изопропил, бутил или пентил.

3. Соединение по п. 1, где
X представляет Cl;
R₄ представляет метил или этил.

4. Соединение по п. 1, которое представляет (1) (1Е)-1-фенил-5-(1-морфолинилтиокарбоксамидо)-6,6,6-трихлор-1-ен-3-гексанон,
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.

5. Фармацевтическая композиция для защиты кардиомиоцитов или для профилактики или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом кардиомиоцитов, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп. 1-4 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

6. Применение соединения по любому из пп. 1-4 для изготовления лекарственного средства для защиты кардиомиоцитов или для профилактики, или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом кардиомиоцитов.

7. Соединение по любому из пп. 1-4 для применения для защиты кардиомиоцитов или профилактики, или лечения заболевания или расстройства, связанного с апоптозом кардиомиоцитов.

8. Способ получения соединения по любому из пп. 1-4 из бензальдегида в качестве исходного материала, включающий взаимодействие бензальдегида с ацетоном в растворе гидроксида натрия в метаноле для получения (1Е)-1-фенил-1-ен-3-ацетона, затем взаимодействие (1Е)-1-фенил-1-ен-3-ацетона с трихлорацетальдегидом при катализе LDA для получения интермедиата 1, который хлорируют тионилхлоридом, и затем взаимодействие с тиоцианатом калия для получения интермедиата 2 и в заключение кипячение с обратным холодильником интермедиата 2 с морфолином в тетрагидрофуране для получения целевого соединения.