ИЗБИРАТЕЛЬНЫЙ ЛИЗИС КЛЕТОК Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/68 C12M1/34 C12N1/06 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к лизису эукариотических клеток, в частности животных клеток, таких как клетки крови. Настоящее изобретение далее относится к определению низких концентраций микроорганизмов, таких как бактерии, в образцах с высокой концентрацией других клеток.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Молекулярная диагностика нацелена на быстрое обнаружение минимального количества болезнетворных микроорганизмов (обычно бактерий) в образцах, например, крови. Тем не менее, кровь является комплексной матрицей и включает белые кровяные тельца (лейкоциты), выполняющие функцию адаптации иммунной системы, красные кровяные тельца (эритроциты), выполняющие функцию переноса кислорода, и кровяные пластинки (тромбоциты), выполняющие функцию заживления ран. Это усложняет непосредственное обнаружение болезнетворных микроорганизмов в образцах, таких как, например цельная кровь, которая имеет высокую концентрацию клеточного вещества.

Классические методы обнаружения включают рост бактерий, который обнаруживается при помощи задействования избирательных средств и/или средств с индикаторами. Обычно такие анализы требуют этап культивации, как минимум в течение 1 или 2 дней, перед тем как можно проводить само обнаружение.

Для методик на основе ПЦР количество бактерий в образцах свежей крови теоретически достаточно высоко для обнаружения без проведения последующей культивации бактерий, присутствующих в образце. Тем не менее, для того чтобы позволить раннее обнаружение количества бактерий необходимы большие объемы крови. Высокое количество ДНК, в частности в белых кровяных тельцах, значительно повышает фон в методах обнаружения на основе ДНК. Также присутствие гема гемоглобина в значительной степени уменьшает активность полимеразы ДНК. Микролитр человеческой крови содержит от 4000 до 11000 белых кровяных телец и от 150000 до 400000 кровяных пластинок. Концентрация ДНК в крови составляет от 30 до 60 мкг/мл. Поэтому чрезвычайно сложно обнаружить в объеме 10 мл цельной крови присутствие от 10 до 100000 разновидностей бактерий.

Значительное количество ДНК белых кровяных телец может стать причиной образования незначительных продуктов ПЦР или может поглотить праймеры, созданные для обнаружения бактериального ДНК. Это обуславливает необходимость тщательной очистки ДНК и отделения ДНК млекопитающих, перед тем как бактериальная ДНК может быть обнаружена посредством ПЦР или других методов.

Помимо вмешательства в саму реакцию ПЦР, количество ДНК млекопитающих повышает вязкость образца. При этом белки и оболочки клеток млекопитающих, подверженных лизису, образуют комплексы, которые препятствуют фильтрации образца. Это, в частности, является проблемой приборов уменьшенных габаритов. Дальнейшее растворение объема образца уже большого размера приводит к неприемлемо длительным этапам дальнейших манипуляций.

Ввиду вышеперечисленных причин необходимы методы извлечения человеческого ДНК из образцов крови.

Известны методы специального анализа бактериальной ДНК в присутствии ДНК млекопитающих. В приборе Looxter™ (Люкстер) компании SIRSLab (САйРСЛэб) используется метод обогащения метилированной ДНК из образца. Так как бактериальная ДНК является особо метилированной, этот подход приводит к обогащению бактериальной ДНК. В приборе Molysis™ (Молизис) компании Molzym (Молзим) используются хаотропные агенты и детергенты для избирательного лизиса клеток млекопитающих. За этим этапом лизиса следует переваривание ДНКазой, на которую не подействовал такой хаотропный агент/детергент. Альтернативные подходы, такие как коммерциализированный компанией Roche (Роше) (Septifast™) (Септифаст) прибор, работа которого основана на парах праймеров ПЦР, которые созданы специально для того, чтобы предотвратить аспецифическую привязку к человеческой ДНК и амплификацию человеческой ДНК.

В патенте США 6803208 описан метод, в котором сильно разбавленная взвесь кровяных пластинок, активированная бактериями, была подвержена лизису при температуре 37°С в течение 15 минут, после чего можно было отфильтровать небольшое количество образца, подверженного лизису, через 0,4 мкм фильтр для визуального наблюдения бактерий, которые остались на фильтре. Тем не менее, этот метод не позволяет обрабатывать большие объемы образцов при температуре окружающей среды.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Частные и предпочтительные варианты осуществления изобретения изложены в соответствующих прилагаемых зависимых и независимых формулах изобретения. Пункты зависимых формул изобретения могут быть связаны с пунктами независимых формул изобретения и с пунктами других зависимых формул изобретения, где применимо, и которые просто и как можно доходчиво изложены в таких формулах изобретения.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к методу избирательного лизиса эукариотических клеток, в частности животных клеток, в образце, в котором содержится или, возможно, содержаться микроорганизмы. Этот метод охватывает этапы обеспечения образца эукариотическими клетками, в частности животными клетками, содержащими или в которых, возможно, содержаться микроорганизмы, добавляя неионогенный детергент и буферный раствор в образец для получения раствора со значением рН в примерно 9,5 или выше, и инкубируя раствор в течение периода времени, достаточного для осуществления лизиса эукариотических клеток, в частности животных клеток, например от 30 секунд до 10 минут, но более предпочтительно от 2 до 6 минут. Лизис может быть осуществлен в рамках частных вариантов осуществления изобретения при температуре от 15 до 30°С, более предпочтительно при температуре, приближенной к комнатной температуре.

В частных вариантах осуществления изобретения образцом является образец крови млекопитающего, как, например, цельная кровь.

В других частных вариантах осуществления изобретения микроорганизмами являются бактерии или грибки.

В соответствии с частными вариантам осуществления изобретения соотношение между объемом добавленного детергента, буферного раствора и объема образца составляет от 2/1 до 1/10.

В частных вариантах осуществления изобретения неионогенный детергент отобран из группы, в которую входят Нонидент, Бридж, Твин, Игепал, восстановленный тритий, октил глюкозид, холат и Тритон. Наиболее предпочтительными примерами являются Тритон Х-100, Нонидент Р40, дезоксихолат натрия и/или Игепал СА 630.

В частных вариантах осуществления изобретения щелочной буферный раствор, который использовался в настоящем изобретении, имел значение КД свыше 9. Примерами такого являются борат, углекислая соль, CAPS (N-циклогексил-3-аминопропан сульфокислоты), CAPSO (М-циклогексил-2-гидроксил-3-аминопропан сульфокислоты), CHES (М-циклогексил-2-аминоэтансульфоновые кислоты), пирофосфат и этаноламин. Частным вариантом осуществления изобретения является углекислый натрий. Буферный раствор должен иметь достаточную буферную емкость, как при смешении с образом с соотношениями в соответствии с настоящим изобретением, а уровень рН окончательного раствора должен составлять около 9,5 или выше.

В частных вариантах осуществления изобретения метод далее включает этап фильтрации инкубационного раствора на фильтре с размерами пор, которые задерживают микроорганизмы на фильтре, такие как фильтры с размерами пор менее 0,7 мкм, более предпочтительно с размером пор менее 0,5 мкм. Метод настоящего изобретения способствует фильтрации больших объемов образца без этапов, связанных с процессами ферментации или нагрева.

В частных вариантах осуществления изобретения метод далее включает этап добавления после избирательного лизиса в соответствии с настоящим изобретением кислоты или кислотного буферного раствора для получения уровня рН между 7 и 9, а также «этап нейтрализации».

В частных вариантах осуществления изобретения за методами, описанными выше, следует этап обнаружение микроорганизмов. Примерами такого являются цитометрия, микроскопия, ПЦР или культивирование.

В частных вариантах осуществления изобретения за методами, описанными выше, следует лизис микроорганизмов.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к прибору (1) для обнаружения микроорганизмов в образце, в который входят: лизисная камера (2) для принятия жидкости образца объемом меньше 40 мл, предпочтительно меньше 20 мл и более предпочтительно от 1 до 20 мл, сосуд (3), в котором находится щелочной буферный раствор с уровнем рН около 9,5 и выше и неионогенный детергент, или сосуд, в котором находится щелочной буферный раствор (31) с уровнем рН около 9,5 или выше, сосуд, в котором находится неионогенный детергент (32), подсоединенный к лизисной камере, фильтр (4), подсоединенный к лизисной камере для фильтрации образца после лизиса, при этом фильтр имеет поры размером, который позволяет задержку бактерий на фильтре, и камеру индикации (5) для анализа присутствия ДНК.

В настоящем патенте щелочной буферный раствор обычно имеет значение КД выше 9,5, чтобы окончательный раствор имел уровень рН около 9,5 или выше, а неионогенным детергентом обычно является Тритон Х-100, дезоксихолат натрия, Нонидент Р40 и/или Игепал СА 630.

Методы, описанные в настоящем изобретении, позволяют осуществление избирательного лизиса белых и красных кровяных телец в образце, в то время как бактерии и грибы остаются в неизменном виде (либо мертвые, либо живые).

Методы, в соответствии с описанным в настоящем патенте, делают возможным обработку образца без значительного разбавления такого образца и, как результат, позволяют обработать более значительные объемы образца. При этом нет необходимости в ферментативном расщеплении ДНК, например ДНКазой, или применении термической обработки, что делает этот метод более сложным в сравнении с ранее известными в данной области.

Методы в соответствии с описанием, представленным в настоящем изобретении, приводят к получению образцов, подвергшихся лизису, с низкой вязкостью и минимальной массой, что делает возможным фильтровать большие объемы образца, прошедшего лизис, через фильтр, который задерживает бактерии. Дальнейшая обработка бактерий на таком фильтре может быть продолжена с объемами от 100 до 1000 мкл, что делает возможным обработку больших объемов образцов для последующих процедур и для осуществления необходимых манипуляций, таких как нейтрализация и промывка, которые полностью автоматизированы и заключены во встроенную кассету.

Вышеперечисленные и другие характеристики, особенности и преимущества настоящего изобретения более понятны из следующего подробного описания, представленного в связи с соответствующими рисунками, которые иллюстрируют посредством примеров принципы настоящего изобретения. Такое описание представлено только в целях примера, тем самым не ограничивая области применения настоящего изобретения. Ссылочные цифры, указанные ниже, относятся к прилагаемым рисункам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На Рис.1 отображена эффективность фильтрации больших объемов крови после избирательного лизиса при различном значении рН в соответствии с частным вариантом осуществления методов настоящего изобретения.

На Рис.2 отображен процесс восстановления различных бактерий после лизиса при различных значениях рН в соответствии с частным вариантом осуществления методов настоящего изобретения.

На Рис.3 изображен процесс восстановления различных бактерий после лизиса при различных значениях инкубационного периода в соответствии с частным вариантом осуществления методов настоящего изобретения.

На Рис.4 отображен процесс редукции человеческой фоновой ДНК избирательным лизисом в соответствии с настоящим изобретением.

На Рис.5 и 6 изображен процесс обнаружения различных типов болезнетворных микроорганизмов в 1 и 5 мл цельной крови соответственно.

На Рис.7 изображено сравнение ручного метода и метода, осуществленного при помощи прибора, в соответствии с настоящим изобретением.

На Рис.8 изображено сравнение метода в соответствии с настоящим изобретением с коммерчески доступными тестами обнаружения сепсиса.

На Рис.9 изображен лизис болезнетворных микроорганизмов после избирательного лизиса и задержки на фильтре в соответствии с настоящим изобретением.

На Рис.10 изображена эффективность лизиса болезнетворных микроорганизмов в сравнении с другими методами лизиса, осуществленными после избирательного лизиса и задержки на фильтре в соответствии с настоящим изобретением.

На Рис.11 изображен схематический вид варианта осуществления прибора для проведения избирательного лизиса, как описано в вариантах осуществления настоящего изобретения.

На Рис.12 изображен пример интегрированного прибора, в который входит блок избирательного лизиса, как описано в вариантах осуществления настоящего изобретения.

На различных рисунках те же ссылочные знаки относятся к тем же или подобным элементам.

Настоящее изобретение будет описано с учетом соответствующих вариантов осуществления и со ссылкой на определенные рисунки, при этом настоящее изобретение не ограничивается таковыми, но только указанными в формулах изобретения. Любые ссылочные знаки в формулах изобретения не будут толковаться как ограничивающие область применения настоящего изобретения. Описанные рисунки являются лишь схематическими и не ограничивающими область настоящего изобретения. На рисунках размер некоторых элементов может быть преувеличен и не указан в масштабе в иллюстративных целях. В случаях, когда словосочетание «который включает» используется в настоящем описание и формулах изобретения, оно не исключает другие элементы или этапы. В случаях, когда неопределенный или определенный артикль используется со ссылкой на существительное в единственном числе, например артикли «a», «an» или «the», при этом подразумевается множественное число такого существительного, если только отдельно не указано иного.

Более того, слова «первый», «второй», «третий» и подобные в описании и формулах изобретения используются для разграничения между подобными элементами и необязательно для описания последовательного или хронологического порядка. Следует понимать, что слова, использованные таким образом, являются взаимозаменяемыми при соответствующих обстоятельствах и что варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем патенте, можно применять в других последовательностях, помимо описанных или проиллюстрированных в настоящем патенте.

Следующие термины и определения представлены исключительно в целях помощи в понимании настоящего изобретения. Эти определения не должны истолковываться как имеющие область применения, меньшую, чем понимается специалистами в данной области.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО

ИЗОБРЕТЕНИЯ

«Клетки крови» в контексте настоящего изобретения относятся к клеткам млекопитающих, присутствующим в крови и включающим красные кровяные тельца (эритроциты), белые кровяные тельца (лейкоциты) и кровяные пластинки (тромбоциты).

«Цельная кровь» в контексте настоящего изобретения относится к необработанной крови, которая включает плазму крови и кровяные тельца, потенциально обработанные антикоагулянтом.

«Образец» относится к водной суспензии, которая включает клеточный материал и жидкости организма, такие как лимфу, спинномозговую жидкость, кровь (цельную кровь и плазму), слюну, а также включает, например, водную фракцию гомогенизированных суспензий, таких как, например мышцы, мозг, печень или другие ткани.

«Эукариот» в настоящем изобретении относится к любому типу эукариотических организмов, за исключением грибов, как, например, животные, в частности животные, у которых есть кровь, и включает беспозвоночных животных, таких как ракообразные, и позвоночных животных. Позвоночные животные включают как холоднокровных (рыбы, рептилии, амфибии), так и теплокровных животных (птицы и млекопитающие). Млекопитающие включают, в частности, приматов, а в особенности человека.

«Избирательный лизис» в контексте настоящего изобретения получен в результате того, что в образце (как например кровь) процент клеток микроорганизмов (как, например, болезнетворные клетки) в таком образце, которые остаются в неизменном виде, значительно выше (например, в 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 или 1000 раз) по сравнению с процентом эукариотических клеток организма, из которого был взят образец, который остался в нетронутом виде.

«Микроорганизм» в контексте настоящего изобретения относится к бактериям (грамположительным и грамотрицательным бактериям, а также спорам бактерий) и одноклеточным грибам, как, например, дрожжевые грибки и плесневые грибки, которые присутствуют в организме, из которого был взят образец, обычно такой организм является болезнетворным.

Первый вариант осуществления настоящего изобретения связан с методом избирательного лизиса эукариотических клеток, в частности клеток животных в образце, который содержит или предполагается, что содержит такие микроорганизмы, как бактерии. Целью метода является увеличение чувствительности теста для обнаружения минимального количества бактерий в образце (т.е. менее 10000, 1000, 100 или даже меньше микроорганизмов на мл образца). Как объяснялось в предпосылках изобретения, ДНК эукариотических клеток, в частности клеток животных, в образце препятствует осуществлению методов обнаружения на основании ПЦР, и данная ДНК вместе с белками и мембранами формирует комплекс, который увеличивает вязкость после лизиса и существенно влияет на фильтрацию образца, подвергшегося лизису. Для решения данной проблемы эукариотические клетки, в частности клетки животных, подвергают избирательному лизису, причем значительная часть (т.е. более 20%, 40%, 60%, 80%, 90% или даже более 95%) микроорганизмов остаются живыми или даже если были убиты при обработке, все еще содержат бактериальную ДНК в клеточной стенке. В методах, описанных в настоящем изобретении, решаются вышеупомянутые проблемы.

Методы, описанные в настоящем изобретении, в частности, применимы к любым видам образцов, в которых обнаружение ДНК микроорганизмов, а именно бактерий, нарушается наличием других клеток, содержащих ДНК, в частности клеток носителя, в котором микроорганизм присутствует в качестве болезнетворного микроорганизма.

Методы, описанные в настоящем изобретении, далее проиллюстрированы для вариантов осуществления изобретения, в которых исследуется наличие минимального количества бактерий в крови млекопитающих.

Образец крови можно хранить как цельную кровь или как обработанную фракцию, такую как плазма или тромбоцитный препарат. Обычно методы, описанные в настоящем изобретении, применяют к недавно отобранной цельной крови. Такие образцы обычно обрабатывают, например, гепарином, этилендиаминтетраацетатом или цитратом во избежание свертывания.

С другой стороны метод применяют к свежей крови путем забора крови непосредственно из вены в пробирку с детергентом и буферным раствором.

Соответственно, образец свежей крови или консервированной крови дополняется буферным раствором и неионогенным детергентом. Выбор буферного раствора и его концентрации осуществляется для того, чтобы компенсировать предоставленную буферную емкость образца крови и получить значение рН около 9,5 или выше, более точно от 9,5 до 11,5, еще более точно от 9,5 до 10,5. Значения рН выше 11,5 подходят для более сильных организмов, таких как грамположительные бактерии и грибки. В равной степени буферный раствор достаточно концентрированный, так что чаще всего объем буферного раствора 200%, 150%, 100%, 50%, 20% или 10% от объема образца добавляется в образец для получения необходимого изменения рН.

Подходящие буферные растворы в контексте настоящего изобретения обычно имеют КД выше 9, выше 9,5 или даже выше 10 и содержат бораты, карбонаты, N-циклогексил-3-аминопропан сульфокислоты, N-циклогексил-2-гидроксил-3-аминопропан сульфокислоты, N-циклогексил-2-аминоэтансульфоновые кислоты, пирофосфаты, этаноламины и другие часто используемые буферные растворы с оптимальной буферной емкостью в вышеупомянутых диапазонах рН.

Подходящими детергентами являются неионогенные детергенты, которые с одной стороны имеют литическое воздействие только на эукариотические клетки, в частности клетки животных, а с другой стороны имеют растворяющее воздействие на ДНК и белки.

В качестве примера неионогенного детергента можно привести алкилгликозиды, Бридж 35 (С12Е23 эфир полиоксиэтиленгликоль додецил) (15,7), Бридж 58 (С16Е20 эфир полиоксиэтиленгликоль додецил) (16), Генапол (13-19), глюциды, такие, как МЕГА-8, -9, -10, октилгликозид (12,6), Плюроник F 127, Тритон Х-100 (С₁₄Н₂₂О (C₂H₄O)_n) (13,4), Тритон Х-114 (С₂₄Н₄₂O₆) (12,4), Твин 20 (Полисорбат 20) (16,7) и Твин 80 (Полисорбат 80) (15) Нонидет Р40 дезоксихолат натрия, восстановленный Тритон Х-100 и/или Игепал СА 630. Особо наиболее предпочитаемым примером неионогенного детергента является Тритон-Х 100.

Наиболее эффективная концентрация детергента меняется от детергента к детергенту, но обычно находится в диапазоне от 0,1 до 5%, более точно от 0,1 до 1%. В зависимости от детергента (твердый или жидкий) % соответственно относится вес/объем % или объем/объем %.

Инкубация образца крови при наличии буферного раствора и детергента осуществляется в течение 10 минут, предпочтительно от 30 секунд до 10 минут, а еще более предпочтительно от 1 до 3, 1-5, 1-8, 2-6 или 1-10 минут, при температуре от 10 до 30°С, более предпочтительной является комнатная температура.

Методы в соответствии с настоящим изобретением имеют такое преимущество, что избирательный лизис происходит менее чем за 10 минут, при температуре ниже 30°С. Соответственно, методы обычно можно применять при температуре окружающей среды, не нагревая образец.

При желании после лизиса рН образца, подвергшегося лизису, доводится до нейтрального значения (например, между 7 и 9) путем добавления кислоты или кислого буферного раствора на этапе нейтрализации. Было установлено, что образец, подвергшийся лизису, при нейтральном рН можно хранить в течение длительного времени (до 1, 2, 6, 12 или даже 24 часов) без дальнейшего лизиса бактериальных клеток и без кардинальных изменений жидкостных свойств такого образца.

Еще одним параметром, исследуемым в методах настоящего изобретения, является оценка жидкостных свойств образца крови после лизиса. Их можно определить, проверив, какой объем крови, подвергшейся лизису, можно отфильтровать через 0,22 мкм фильтр. Методы в соответствии с настоящим изобретением позволяют отфильтровать как минимум 2, 5, 7,5 или даже 10 мл цельной крови, разбавленной добавлением 1 объема буферного раствора/раствора детергента к 1 объему образца.

Как правило, методы в соответствии с настоящим изобретением включают этап, на котором неповрежденные бактериальные клетки отделяют от образца, как правило, путем центрифугирования или фильтрации. В определенных вариантах осуществления изобретения неповрежденные бактерии выделяют из образца путем прохождения образца, подвергшегося лизису, через фильтр с размером пор менее 1 мкм, для сохранения бактерий, которые обычно имеют размер от 0,5 до 10 мкм, такие как, например, коммерчески доступные фильтры с размером пор 0,4 или 0,22 мкм. Для фильтрации образцов существует широкий спектр имеющихся в продаже устройств, таких как фильтры, адаптированные для насадки на шприц таким образом, что после лизиса в шприце жидкость может пройти через фильтр с помощью ручного нажима на поршень шприца.

Далее можно исследовать наличие бактерий (или грибков) на фильтре. В определенных вариантах осуществления изобретения наличие микроорганизмов исследуется с помощью ПЦР. Для этого бактерии (или грибки) можно вымыть из фильтра и далее обработать для амплификации ПЦР. Кроме того, фильтр промывают лизисным буферным раствором, чтобы освободить ДНК из микроорганизмов, которая в дальнейшем используется в реакции ПЦР.

Прочие этапы обнаружения можно осуществлять с помощью цитометрии, микроскопии, ПЦР или культивирования.

Лизис образца, фильтрацию и обнаружение микроорганизмов можно выполнить одним прибором (схематически изображен на Рис.11). Соответственно, одной из особенностей настоящего изобретения является прибор (1), включающий лизисную камеру (2) для приема жидкости образца объемом от 1 до 10 мл, сосуд (3), содержащий щелочной буферный раствор с ранее описанными поверхностно-активными веществами, или сосуд, содержащий вышеупомянутый щелочной буферный раствор (31), и сосуд, содержащий вышеупомянутые поверхностно-активные вещества (32), сосуды связаны с лизисной камерой (2). В приборе лизисная камера соединена с фильтром (4) для фильтрации образца после лизиса, благодаря чему микроорганизмы сохраняются на фильтре. Прибор также включает каналы для удаления микроорганизмов из фильтра и их лизиса в отдельной камере. Кроме того, прибор дополнительно содержит средства для лизиса микроорганизмов на фильтре, а также каналы для перехода ДНК от лизированных бактериальных или грибковых клеток с фильтра в отдельную камеру. Прибор может дополнительно содержать камеру очистки ДНК и камеру индикации (5) для определения наличия ДНК. Как правило, камера индикации является модулем ПЦР.

Пример прибора, в котором происходит избирательный лизис и последующая очистка и идентификация ДНК, представлен на Рис.12.

Другие механизмы систем и методов, осуществляющих изобретение, будут очевидны для специалистов в данной области.

Следует понимать, что хотя в соответствии с настоящим изобретением здесь описывались предпочтительные варианты осуществления изобретения, конкретные конструкции и конфигурации, а также материалы для устройств, различные изменения и модификации формы и деталей могут быть произведены без отступления от сущности и объема настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Воздействие рН на фильтрацию

Целью данного эксперимента является оценка влияния рН буферного раствора на эффективность фильтрации. Буферной емкости было достаточно, чтобы получить такой же рН в конечном растворе, что было подтверждено путем измерения рН конечного раствора с помощью обычных методов, известных специалистам в данной области.

Буферные растворы содержали:

- 1М борат натрия, рН 9,0+1% Тритон Х-100

- 1М борат натрия, рН 9,5+1% Тритон Х-100

- 1М карбонат натрия, рН 10,0+1% Тритон Х-100

- 1М карбонат натрия, рН 10,3+1% Тритон Х-100

- 1М карбонат натрия, рН 10,8+1% Тритон Х-100.

1 мл буферного раствора смешивают с 1 мл чистой крови и инкубируют в течение 3 минут. Далее добавляют буферный раствор нейтрализации и фильтруют смесь через фильтр с выбором размера 25 мм в диаметре и с размером пор 0,45 мкм с помощью установки вакуумной фильтрации. Был измерен объем крови, который смог пройти через фильтр, прежде чем он забился. Результаты представлены на Рис.1. Этот эксперимент показывает, что окончательное значение рН должно быть около 9,5 или выше, чтобы получить достаточные объемы отфильтрованной крови для анализа низких концентраций болезнетворных микроорганизмов.

ПРИМЕР 2

Показано влияние рН буферного раствора на восстановление неповрежденных болезнетворных микроорганизмов (кишечная палочка) после избирательного лизиса клеток крови.

Используемые буферные растворы содержали:

- 1М борат натрия, рН 9,0+1% Тритон Х-100

- 1М борат натрия, рН 9,5+1% Тритон Х-100

- 1М карбонат натрия, рН 10,0+1% Тритон Х-100

- 1М карбонат натрия, рН 10,5+1% Тритон Х-100.

Одинаковые количества бактерий вводят в 1 мл крови. Данный объем обрабатывается вышеупомянутыми буферными растворами в течение 3 мин. Далее кровь центрифугируют (10 мин, 4000 г) для сбора неповрежденных бактерий. Бактерии подвергают лизису с помощью стандартного метода щелочного лизиса, а ДНК очищают с помощью центрифужных колонок Qiagen (мини-комплект для выделения крови QiaAmp). Количество ДНК рассчитывается с помощью ПЦР в реальном времени. Результат показан на Рисунке 2.

На вышеупомянутом рисунке показано восстановление бактерий в зависимости от рН буферного раствора избирательного лизиса. При низких значениях рН белые кровяные тельца ДНК не разрушаются и сдерживают реакцию ПЦР. При высоких значениях рН бактерии начинают лизироваться во время избирательного лизиса и не восстанавливаются.

ПРИМЕР 3

Влияние времени инкубации на восстановление болезнетворных микроорганизмов

Этот пример демонстрирует влияние длительной инкубации крови с буферным раствором избирательного лизиса в соответствии с изобретением на восстановление неповрежденных болезнетворных организмов. Фиксированное число бактерий синегнойной палочки ввели в кровь. 1 мл введенной крови смешали с 1 мл буферного раствора избирательного лизиса (1 М карбонат натрия рН 10,0+1% Тритон Х-100) и инкубировали в течение 1, 2, 3, 5, 7 или 10 минут. Затем добавили 1 мл буферного раствора нейтрализации. Болезнетворные микроорганизмы были собраны путем центрифугирования (10 мин при 4000 г), а бактериальный осадок промыт. Наконец, клетки были подвержены лизису с помощью стандартного щелочного лизиса, за которым следовала очистка ДНК с помощью мини-комплекта для выделения крови QiaAmp. Количество восстановленной ДНК было измерено с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты представлены на Рис.3 и показывают, что предпочтительнее производить инкубацию от 30 секунд до 10 минут.

ПРИМЕР 4

Сокращение человеческого фона путем избирательного лизиса в соответствии с настоящим изобретением

Сокращение количества ДНК эукариотических клеток, в частности ДНК белых кровяных телец, в текущем методе является важным, так как при его наличии оно будет препятствовать следующей реакции ПЦР для выявления ДНК или РНК болезнетворного микроорганизма. Чтобы проверить количество оставшихся фоновых ДНК, различные образцы крови анализируют с протоколом избирательного лизиса в соответствии с настоящим изобретением, а количество ДНК белых кровяных телец в реакции ПЦР анализируется с помощью набора для обнаружения RNaseP (Applied Biosystems (Эпплаед Биосистемз)). Значения порогового цикла этих образцов сравнивают с данными, полученными с 200 мкл образца чистой крови, где присутствовали все ДНК белых кровяных телец. Из литературы известно, что ДНК человека, происходящая из 200 мкл чистой крови, является максимальным количеством фоновой ДНК, которая допускается реакцией ПЦР без подавления синтезирования ДНК болезнетворного микроорганизма. Результаты различных реакций ПЦР представлены на Рис.4.

На данном рисунке показана разница в количестве человеческого фона между 1 мл обработанных образцов крови в соответствии с методом настоящего изобретения ((1 М карбонат натрия рН 10,0+1% Тритон Х-100) и 200 мкл контрольных образцов чистой крови. Обрабатываются различные образцы, а результаты ПЦР представлены в виде отдельных точек данных. Эти результаты показывают, что количество фоновых ДНК значительно ниже (=наивысшие значения порогового цикла) в образцах 1 мл, обработанных в соответствии с настоящим изобретением, по сравнению с 200 мкл контрольных образцов чистой крови. Данный результат доказывает, что ДНК белых кровяных телец эффективно и достаточно удалены из образца при использовании метода в соответствии с настоящим изобретением.

ПРИМЕР 5

Целью данного примера является демонстрация обнаружения различных типов болезнетворных микроорганизмов в чистой крови с помощью метода в соответствии с настоящим изобретением. Различные виды болезнетворных микроорганизмов, грамотрицательные (синегнойная палочка), грамположительные (золотистый стафилококк) и грибки (диплоидный грибок) были смешаны вместе в 1 мл крови. Образец крови обработали буферным раствором избирательного лизиса (1 мл 1М карбоната натрия рН 10,0+1% раствор ТХ-100) в течение 3 минут с последующей нейтрализацией рН и фильтрацией с помощью фильтра с выбором размера с достаточно мелкими порами, чтобы удержать все клетки. Фильтр промыли, чтобы удалить оставшиеся замедлители, такие как гемоглобин и ДНК белых кровяных телец. Далее клетки были подвергнуты лизису, следуя протоколу стандартного щелочного лизиса, а ДНК очистили с помощью мини-набора для выделения крови Qiagen.

ДНК болезнетворных микроорганизмов была обнаружена с помощью ПЦР в реальном времени; значение порогового цикла является мерой количества ДНК. Для расчета небольшую часть введенного образца крови высевали на пластинку с кровяным агаром, чтобы получить количество КОЕ. Данные, представленные на рисунке 5, показывают, что можно обнаружить небольшое количество болезнетворных микроорганизмов в чистой крови. Контрольный образец содержит такое же количество бактерий в небольшом объеме фосфатно-солевого буферного раствора, который непосредственно подвергается лизису с последующей очисткой ДНК и определением количества с помощью ПЦР в реальном времени. Контрольные измерения и реальные дополнительные эксперименты крови показали близкие значения порогового цикла, демонстрируя тем самым высокий уровень восстановления. Отрицательный контроль (кровь без бактерий) не продемонстрировал никакого сигнала ПЦР.

Анализ позволяет использовать большие объемы крови. Экспериментальная установка идентична предыдущему примеру, но количество крови увеличивается до 5 мл. Контрольный образец содержит то же количество болезнетворных микроорганизмов, что и 5 мл образца крови, но клетки остаются в небольшом объеме фосфатно-солевого буферного раствора и подвергаются непосредственному лизису. Результаты представлены на Рис.6.

Данный эксперимент демонстрирует возможность восстановить небольшое количество болезнетворных микроорганизмов из больших объемов крови. Данные показывают, что концентрация восстановленных ДНК болезнетворных микроорганизмов подобна эталону. Таким образом, можно сделать вывод, что большинство болезнетворных микроорганизмов остаются неповрежденными во время избирательного лизиса, а сокращение ДНК белых кровяных телец является эффективным для предотвращения замедления ПЦР болезнетворного микроорганизма.

ПРИМЕР 6

Метод избирательного лизиса согласно настоящему изобретению может реализовываться различными способами, включая, но не ограничиваясь ручную процедуру и процедуру, в которой метод реализуется с помощью прибора согласно настоящему изобретению (интегрированная процедура). В настоящем примере сравниваются такая интегрированная процедура и ручная процедура. В ручной процедуре используется ручное отмеривание пипеткой и центрифугирование, в то время как в интегрированной процедуре используется микрожидкостная кассета и фильтр выбора размера, способные выполнять все необходимые операции. Основной биохимический протокол является идентичным: избирательный лизис белых и красных кровяных телец с помощью 1-мольного карбоната натрия+1% раствор Тритон Х-100, после которого следует этап нейтрализации по истечении 3 минут. На следующем этапе смесь либо центрифугируется (вручную), либо фильтруется (интегрировано) и клетки омываются, в результате чего ДНК очищается посредством стандартной процедуры щелочного лизиса. На последнем этапе ДНК очищается с помощью небольшого набора для очищения крови Qiagen (Киаген) и определяется ПЦР в режиме реального времени. Результаты интегрированной и ручной процедуры представлены на рис.7. Достигаются сравнительные результаты, демонстрирующие, что результаты не зависят от формата применяемого анализа.

ПРИМЕР 7

В этом примере метод согласно настоящему изобретению проверяется коммерчески доступным методом, именуемым MolYsis Complete kit (МолИзис Комплит кит) (Molzym). В этом наборе используются хаотропные агенты и детергенты для лизиса отобранных клеток млекопитающих. Этот этап лизиса сопровождается перевариванием ДНКазой, на которую не действовали хаотропным агентом/детергентом.

Для данного эксперимента в образцы крови количеством 1 мл вводились различные концентрации S.Aureus (Золотистый стафилококк). 1 мл крови обрабатывался согласно описанию в Примере 5, а другой образец количеством 1 мл обрабатывался с помощью MolYsis kit согласно инструкциям производителя. Значения КТ зависят от концентрации клеток на рисунке 8 и показывают, что метод согласно настоящему исследованию является, по крайней мере, таким же эффективным, как и известный MolYsis kit, но без добавления ферментов или хаотропных солей.

ПРИМЕР 8

После избирательного лизиса кровяных телец и обогащения болезнетворных клеток на фильтре выбора размера для достижения одновременного лизиса различных болезнетворных микроорганизмов на фильтре и выделения ДНК для анализа на ПЦР был применен щелочной лизис.

На рисунке 9 изображены результаты процедуры щелочного лизиса, выполненного на встроенной кассете. В 1 мл крови было введено 10⁶ клеток S.aurens (Золотистый стафилококк), Р.Aeruginosa (Синегнойная палочка) и С.albicans (Диплоидный грибок). После избирательного лизиса кровяных телец и обогащения болезнетворных клеток на фильтре был произведен щелочной лизис с помощью 200 мкл раствора, содержащего 200 ммоль NaOH, 0,5 % одноразовой дозы, инкубированной в течение 10 минут при температуре 95°С, для получения полного лизиса болезнетворных клеток в фильтре. Элюаты, содержащие патогенные ДНК, были нейтрализованы 20 мкл 1-мольного раствора лимонной кислоты и очищены с помощью прибора QIAamp DNA/Blood Mini kit (КьюАйЭйамп ДиЭнЭй/Блуд Мини кит). В качестве контрольного образца 10⁶ клеток каждой болезнетворной клетки были подвержены лизису в качестве эталона, нейтрализованы и очищены, как указано выше.

Для оптимизации и эталонного анализа процедуры щелочного лизиса в качестве модели был выбран диплоидный грибок, тогда как данные дрожжевые клетки хорошо известны за их прочные клеточные стенки, которые плохо поддаются лизису. На рисунке 10 сравнивается процедура щелочного лизиса (с помощью 50 ммоль NaOH, 0,25% одноразовой дозы в сочетании с термической обработкой) с другими методами лизиса, а именно лечение высокоинтенсивным ультразвуком (HiFU-терапия) и коммерческим набором (BD GeneOhm lysis kit (набор для лизиса БД ГенОм)). Для щелочного лизиса и лизиса с использованием коммерческого набора образцы концентрировались от 1 мл до 160 и 100 мкл, соответственно, с помощью центрифугирования. Для HiFU-терапии использовалось 2 мл клеточного раствора без предварительной концентрации. После лизиса нелизированные клетки и инородные вещества были удалены из образца с помощью центрифугирования. В качестве исходного материала для ПЦР использовался 1 мкл сырого лизата.

Сочетание NaOH и одноразовой дозы является более эффективным для лизиса, чем каждое из отдельных соединений. Повышение концентрации ни одного из компонентов более не увеличивает эффективность лизиса. Щелочной лизис без этапа тепловой инкубации является значительно менее эффективным. Эффективность лизиса может быть увеличена инкубацией на протяжении 2 минут при температуре 95°С, однако, для интеграции образца в кассету, более длительная инкубация при температуре 70°С является предпочтительной.

Для щелочного лизиса клетки были повторно растворены в 100 мкл лизисного раствора, содержащего 50 ммоль NaOH и 0,25% одноразовой дозы. Впоследствии образцы подверглись инкубации на протяжении 10 минут при температуре 70°С, затем были быстро охлаждены до комнатной температуры и нейтрализованы добавлением 30 мкл 500 ммоль Трис-НСl со значением рН 7,0 (производя конечную концентрацию 150 ммоль Трис, т.е. три концентрации NaOH).

Для ПЦР с сырым лизатом клетки, не подвергшиеся лизису, и инородные вещества были убраны из образца с помощью центрифугирования (5 минут, 14000 г). К 25 мкл реакции ПЦР был добавлен 1 мкл надосадочной жидкости. Обнаружение ПЦР основывалось на анализе ПЦР с пробами гидролиза, обнаруживающим ген рРНК (Apollo (Аполло)). Реакция ПЦР производилась в универсальном мастер-миксе Taqman (Applied Biosystems) с использованием 500 нмоль прямого праймера и 300 нмоль обратного праймера, а также маркированной пробы FAM-BHQ1 (все олигонуклеотиды синтезированы на заказ компанией Biolegio BV (Биолегио БВ)). Реакция ПЦР производилась в системе ПЦР в режиме реального времени Biorad CFX (Баеред СиЭфЭкс). После начального этапа нагрева в течение 10 минут при температуре 95°С для активации полимеразы горячего запуска для усиления использовали 50 циклов по 15 секунд при температуре 95°С и 1 минуте при 60°С. Знаки флюоресценции были зафиксированы в каждом цикле во время этапа с температурой 60°С. Анализ информации производился программным обеспечением Biorad CFX.

Группа изобретений относится к области лизиса клеток. Предложен способ избирательного лизиса животных клеток, а также прибор для обнаружения микроорганизмов. Способ избирательного лизиса животных клеток в пробе воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, включает этапы обеспечения пробы воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, добавления в упомянутую пробу неионогенного детергента и буферного раствора для получения раствора со значением pH около 9,5 или выше, инкубации упомянутого раствора на протяжении периода, достаточного для лизиса животных клеток. Прибор для обнаружения микроорганизмов в пробе состоит из лизисной камеры для принятия пробы воды с животными клетками, сосуда с щелочным буферным раствором со значением pH 9,5 или выше и неионогенным детергентом, или сосуда с щелочным буферным раствором со значением pH около 9,5 или более и сосуда с неионогенным детергентом, фильтра, соединенного с лизисной камерой для фильтрации пробы после лизиса животных клеток, камеры индикации для анализа присутствия ДНК микроорганизмов. Предложенные изобретения обеспечивают обработку образца без его значительного разбавления и без применения ферментативного расщепления ДНК или термической обработки, а также позволяют обрабатывать более значительные объемы образца и определять низкие концентрации болезнетворных микроорганизмов в образце. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил., 8 пр.

1. Способ избирательного лизиса животных клеток в пробе воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, включающий следующие этапы:
a) обеспечение пробы воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы,
b) добавление в упомянутую пробу неионогенного детергента и буферного раствора для получения раствора со значением pH около 9,5 или выше, при этом соотношение объема добавляемого детергента и добавляемого буферного раствора и объема пробы составляет от 2/1 до 1/10, а неионогенный детергент присутствует в концентрации в пределах 0,1-5% массы/объема или % объемного содержания,
c) инкубацию упомянутого раствора на протяжении периода, достаточного для лизиса животных клеток.

2. Способ по п. 1, в котором упомянутая проба является образцом крови млекопитающего.

3. Способ по п. 2, в котором упомянутый образец крови является цельной
кровью.

4. Способ по п. 1, в котором упомянутый микроорганизм является бактерией.

5. Способ по п. 1, в котором упомянутый микроорганизм является грибком.

6. Способ по п. 1, в котором упомянутый этап инкубации с) осуществляется на протяжении от 30 секунд до 10 минут.

7. Способ по п. 1, в которой неионогенный детергент выбирается из группы, состоящей из Нонидент Р40, дезоксихолата, Игепал СА 630 и/или Тритон-Х 100.

8. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап центрифугирования упомянутого инкубированного раствора и изоляции упомянутых микроорганизмов.

9. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап фильтрации упомянутого инкубированного раствора на фильтре, размер пор которого позволяет задерживать микроорганизмы на упомянутом фильтре.

10. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап лизиса упомянутых микроорганизмов.

11. Способ по п. 1, дополнительно включающий молекулярный анализ, основанный на нуклеиновой кислоте.

12. Прибор (1) для обнаружения микроорганизмов в пробе согласно способу по п. 1, состоящий из:
- лизисной камеры (2) для принятия пробы воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, объемом менее 40 мл,
- сосуда (3) с щелочным буферным раствором со значением pH 9,5 или выше и неионогенным детергентом, или сосуда с щелочным буферным раствором (31) со значением pH около 9,5 или более и сосуда с неионогенным детергентом (32), соединенного с лизисной камерой.
- фильтра (4), соединенного с лизисной камерой для фильтрации пробы после лизиса животных клеток, при этом упомянутый фильтр имеет такой размер пор, который позволяет задерживать бактерии на фильтре, и
- камеры индикации (5) для анализа присутствия ДНК микроорганизмов.

13. Прибор по п. 12, в котором К_а щелочного буферного раствора выше 9,0 и/или неионогенным детергентом является Тритон Х-100.