Способ определения кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофильных гранулоцитов при сенсибилизации бруцеллами Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 G01N33/569 A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть использовано для оценки кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофилов при сенсибилизации бруцеллами.

Об активации защитных систем организма, при встрече с чужеродным агентом, можно судить по функциональному состоянию нейтрофилов периферической крови. Нейтрофилы быстро обновляются в кровотоке, моментально реагируют на любые изменения в организме клетки, их гранулы содержат большое количество биологически активных веществ [1, 2].

Известно, что основными путями реализации бактерицидной функции нейтрофилов является кислороднезависимый метаболизм, осуществляемый при участии лизоцима, катионных белков и гидролитических ферментов, среди которых особое место принадлежит катионным белкам. Катионные белки играют важную роль в иммунологических процессах, определяют взаимосвязь в развитии клеточных и гуморальных факторов иммунитета, а также в формировании неспецифического и специфического звена резистентности, обеспечивая иммунный гомеостаз [3].

Определяющим критерием анализа кислороднезависимых ферментных систем нейтрофилов является оценка активации катионных белков, позволяющая обнаружить изменения в организме на ранних стадиях развития инфекционного процесса, до появления более глубоких изменений в органах и системах, выявляемых с помощью традиционных методов исследований [4].

Известен способ определения лизосомального катионного белка, путем приготовления мазка крови, его фиксации, окрашивания, высушивания, микроскопирования и определения количества белка по интенсивности окраски [5]. Активность антимикробных компонентов выражается в условных единицах на основании вычисления среднего цитохимического коэффициента. Данный способ не позволяет определить возможность потенциального усиления функциональной активности нейтрофилов in vitro и, тем самым, дать оценку степени специфической стимуляции фагоцитов.

Также известен способ определения функционального потенциала нейтрофильных гранулоцитов по реализации неферментных катионных белков, который включает в себя определение катионных белков в мазках с не активированными и активированными (Staphylococcus aureus) нейтрофилами путем их инкубации в термостате во влажной камере, фиксации лейкоконцентрата, окрашивания, высушивания и микроскопирования по интенсивности окраски. Рассчитывают средний цитохимический индекс и коэффициент реализации катионных белков [6]. Недостатком данного способа, как и остальных цитохимических методов, являются отсутствие автоматизированной регистрации количества катионных белков, а также субъективность учета реакции.

Наиболее близким техническим решением, является способ определения количества неферментативных катионных белков спектрофотометрически [7]. Способ включает инкубацию 60 минут при 37°С 50 мкл цельной крови с 20 мкл st. aureus для определения индуцированной продукции катионных белков или 20 мкл фосфатно-солевого буфера (ФБС) для определения спонтанной активности. После клетки трехкратно отмывают и фиксируют 96% этиловым спиртом, 100 мкл на лунку, 30 мин остатки спирта удаляют декантированием, планшет высушивают. Клетки окрашивают зеленым прочным - 100 мкл на лунку 30 минут при 37°С. Краску удаляют, клетки троекратно отмывают ФБС. Далее растворяют в 200 мкл ДМСО. Оптическую плотность измеряют при λ-540 нм. Для индукции используют культуру Staphylococcus aureus в концентрации 1 млн/мл убитых автоклавированием. Этот способ дает возможность оценить степень потенциального усиления функционального состояния нейтрофилов, но используемый Staphylococcus aureus в качестве индуктора не позволяет дать четкого представления о специфической стимуляции фагоцитов, полученных от животных, сенсибилизованных бруцеллами.

Техническим результатом заявленного способа является повышение точности и достоверности оценки кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофилов у животных, сенсибилизированных бруцеллами.

Технический результат достигается тем, что способ определения кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофильных гранулоцитов при сенсибилизации бруцеллами по активации катионных белков включает внесение по 50 мкл гепаринизированной крови (из расчета 5 ед. действующего вещества на 1 мл крови), в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа. В одну лунку планшета добавляют 20 мкл фосфатно-солевого буфера (спонтанная активность катионных белков), а в другую 20 мкл бруцеллезного антигена, в концентрации 50 мкг/мл белка в конечном продукте (стимулированная активность катионных белков), тщательно перемешивают, инкубируют в термостате при 37°С 60 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 10 минут, трехкратно отмывают в 200 мкл фосфатно-солевого буфера в центрифуге при 1000 об/мин 5 минут, удаляют надосадок, клеточный осадок фиксируют в 100 мкл на лунку 96% этилового спирта, удаляют надосадочную жидкость, высушивают на воздухе. Клетки окрашивают бромфеноловым синим - 100 мкл на лунку в термостате при 37°С 30 минут, краску удаляют, клетки трехкратно отмывают в 200 мкл фосфатно-солевого буфера в центрифуге при 1000 об/мин 5 минут, надосадок удаляют, осадок растворяют в 200 мкл диметилсульфоксида 10 минут, тщательно перемешивают. Результаты реакции фиксируют фотометрическим методом на многоканальном иммунохимическом анализаторе «Fluorofot STD-Less-486-M» (производства России) при длине волны 540 нм и учитывают в условных единицах оптической плотности (у.ед.оп.пл.). После учета реакции рассчитывают коэффициент стимуляции (КС) как отношение уровня стимулированной активности к спонтанному уровню. При значениях КС от 1,06 и выше результат является положительным, свидетельствующим о специфической сенсибилизации нейтрофильных гранулоцитов к бруцеллам.

Отличительными признаками предложенного способа является использование в качестве активатора реакции экспериментального образца специфического бруцеллезного антигена - ультразвуковой лизат Brucella abortus 19 в концентрации 50 мкг/мл белка, при этом уровень специфического клеточного ответа оценивают по коэффициенту стимуляции.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. У морских свинок, иммунизированных Brucella abortus 16/4 в дозе 1 млрд КОЕ/мл определяют стимулированную активность катионных белков. В качестве активатора реакции используют изготовленный в лабораторных условиях экспериментальный образец специфического бруцеллезного антигена - ультразвуковой лизат Brucella abortus 19.

Концентрацию антигена стандартизируют по содержанию белка в конечном продукте на полуавтоматическом биохимическом анализаторе EMP-168 Vet (производитель Emperor, Китай) с использованием набора реагентов для определения белка «HOSPITEX DIAGNOSTICS».

Определяют уровень стимулированной активности катионных белков нейтрофилов, при воздействии на исследуемые пробы, различными концентрациями специфического бруцеллезного антигена (25, 50, 100 и 200 мкг/мл белка в конечном продукте). Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Показатели стимулированной активности катионных белков при воздействии разных концентраций бруцеллезного антигена, у.е.оп.пл (M±m)

Группа животных Концентрация антигена, мкг/мл 25 50 100 200 n=5 1,177 ± 0,135 1,686 ± 0,131 1,123 ± 0,181 1,061 ± 0,116

Из таблицы 1 видно, что наиболее выраженную специфическую активность катионных белков отмечают при стимуляции клеточной взвеси нейтрофилов антигеном в концентрации 50 мкг/мл - 1,686±0,131 у.е.оп.пл. Дальнейшее увеличение концентрации антигена напротив, способствует снижению стимулированной активности катионных белков.

Таким образом, для оценки стимулированной активности катионных белков нейтрофилов предпочтительно применять экспериментальный образец бруцеллезного антигена в концентрации 50 мкг/мл белка в конечном продукте.

Пример 2. У группы морских свинок (n=20), иммунизированных штаммом Brucella abortus 16/4 в дозе 1 млрд КОЕ/мл, проводят отбор проб крови до иммунизации и на 3, 7, 14, 21, 28, 42, 55, 69, 125 сутки после иммунизации.

Определение активности катионных белков проводят по известной методике (с применением в качестве активатора реакции Staphylococcus aureus в концентрации 1 млн/мл убитого автоклавированием) и по предлагаемому способу, с применением в качестве активатора реакции экспериментального образца бруцеллезного антигена в оптимальной концентрации - 50 мкг/мл. По полученным результатам вычисляют коэффициент стимуляции (таблица 2).

Таблица 2 - Сравнительная оценка стимулирующей способности Staphylococcus aureus и бруцеллезного антигена при определении активности катионных белков у животных, иммунизированных B.abortus 16/4, M±m

Сутки после иммунизации Определение активности катионных белков спонтанная стимулированная Staphylococcus aureus (известный способ) бруцеллезный антиген
(предлагаемый способ) у.е.оп.пл КС у.е.оп.пл КС до иммунизации 1,392±0,050 1,173±0,103 0,835±0,153 1,144±0,058 0,823±0,036 3 1,375±0,134 1,129±0,110 0,818±0,089 1,488±0,125 1,098±0,062 7 1,266±0,111 1,163±0,101 0,918±0,109 1,426±0,017 1,120±0,076 14 0,611±0,059^* 0,742±0,101 1,205±0,048 1,686±0,131 2,759±0,648^* 21 0,829±0,056^* 0,752±0,038 0,915±0,041 1,081±0,043 1,318±0,061^* 28 0,848±0,096^* 0,941±0,066 1,148±0,106 1,250±0,239 1,489±0,227^* 42 1,336±0,189 0,840±0,028 0,629±0,160 1,086±0,072 0,841±0,121 55 1,310±0,044 0,803±0,112 0,608±0,068 1,058±0,105 0,804±0,054 69 2,555±0,120^* 1,163±0,101 0,460±0,057 2,364±0,220^* 0,949±0,104 125 2,051±0,119^* 1,232±0,068 0,606±0,032 1,366±0,332 0,678±0,201 Примечание: * p<0,05

Из таблицы 2 видно, что во все сроки исследования активирующее влияние экспериментального образца бруцеллезного антигена на катионные белки выше, чем у Staphylococcus aureus.

Стоит отметить, что важным показателем активности катионных белков являются не столько изменения в спонтанном и стимулированном вариантах постановки, сколько соотношение между стимулированной и спонтанной активностью, т.е. коэффициент стимуляции. Так, у исследуемых животных до иммунизации среднегрупповое значение КС составило 0,835±0,153 при постановке реакции по известному способу и 0,823±0,036 - по предлагаемому способу. При этом индивидуальные значения КС по известному способу составили от 0,568 до 1,120, по предлагаемому способу от 0,718 до 0,907. На 14 сутки при максимальных среднегрупповых значениях КС, индивидуальные значения КС по известному способу постановки варьировались от 1,205 до 1,600, по предлагаемому способу от 2,404 до 4,455. На 21 сутки индивидуальные значения КС по известному способу составили от 0,813 до 1,064, тогда как по предлагаемому - от 1,06 до 1,471.

Индивидуальные значения КС были сопоставлены с результатами диагностических исследований на бруцеллез в реакции агглютинации (РА), основанной на обнаружении в сыворотке крови специфических антител (таблица 3).

На 21 сутки у всех животных в сыворотке крови обнаружены агглютинирующие антитела к бруцеллезному антигену в диагностическом титре 1:10 и более, что свидетельствует о наличии возбудителя в организме, при этом индивидуальные значения коэффициента стимуляции при определении активности катионных белков по предлагаемому способу не опускались ниже 1,06 в 100% случаев.

На основании полученных данных, животных по индивидуальным значениям коэффициента стимуляции делят на 2 группы. В первую группу включают животных со значениями КС до 1,06, во вторую группу с КС от 1,06 и выше.

Таблица 3 - Результаты оценки иммунологических реакций у морских свинок в разные сроки после иммунизации Brucella abortus

Сутки после имму-
низации РА
1:10 и более Активность катионных белков известный способ предлагаемый способ КС до 1,06 КС от 1,06 и выше КС до 1,06 КС от 1,06 и выше абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % до имму-
низации 0 0 18 90 2 10 20 100 0 0 3 0 0 12 60 8 40 8 40 12 60 7 0 0 16 80 4 20 5 25 15 75 14 8 40 4 20 16 80 0 0 20 100 21 20 100 16 80 4 20 0 0 20 100 28 8 40 2 10 18 90 4 20 16 80 42 12 60 20 100 0 0 12 80 4 20 55 8 40 20 100 0 0 18 90 2 10 69 12 60 20 100 0 0 18 90 2 10 125 0 0 20 100 0 0 20 100 0 0

Из таблицы 3 видно, что до иммунизации индивидуальные показатели КС до 1,06 при исследовании по известному способу регистрировались у 90% животных, тогда как при исследовании по предлагаемому способу - у 100% животных. В ранние сроки после иммунизации на 3 и 7 сутки индивидуальные коэффициенты стимуляции увеличиваются, КС от 1,06 и выше при исследовании по известному способу у 40% и 20% животных соответственно, по предлагаемому способу у 60% и 75%, при этом реагирующих в реакции агглютинации не выявлено.

На 14 сутки после иммунизации у 40% животных наблюдалась положительная реакция в РА с диагностическим титром 1:10 и более, при этом КС от 1,06 и выше по известному способу регистрировался у 80% животных, по предлагаемому способу - в 100% случаев.

На 21 сутки серологический ответ наблюдался у 100% животных, КС от 1,06 и выше по известному способу регистрировался у 20% животных, по предлагаемому способу так же в 100% случаев.

Процент реагирующих в РА животных снижался с 28 суток и сохранялся до 69 суток. Процент животных с КС от 1,06 и выше по известному способу на 28 сутки после иммунизации составил 90%, с 42 суток до конца исследования, животных с КС от 1,06 и выше не выявлено. По предлагаемому способу животных с КС от 1,06 и выше на 28 сутки зарегистрировано 80%, на 42 сутки - 20%, на 55 и 69 сутки - 10%, на 125 сутки животных с КС от 1,06 и выше не выявлено.

Таким образом, результаты проведенных диагностических исследований на бруцеллез подтверждают достоверность результатов исследований, проведенных по предлагаемому способу.

Пример 3. В благополучном по бруцеллезу хозяйстве с регулярной вакцинацией против бруцеллеза проводят отбор проб крови до первой иммунизации и на 3, 7, 14, 21, 28, 35 сутки после иммунизации.

Определение активности катионных белков проводят по предлагаемому способу с применением экспериментального образца бруцеллезного антигена в оптимальной концентрации - 50 мкг/мл в качестве активатора реакции.

Сравнительное изучение показателей спонтанной и стимулированной продукции катионных белков проводят у иммунизированных (n=50) и не иммунизированных (n=50) телок одной возрастной категории (таблица 4).

Таблица 4 - Сравнительное изучение показателей спонтанной и стимулированной активности катионных белков у иммунизированных и негативных телок, M±m

Сроки (сутки) Негативные животные Иммунизированные животные спонтанный стимулированный КС спонтанный стимулированный КС до имму-
низации 2,128±
0,168 1,836±
0,218 0,862±
0,118 2,149±
0,481 1,761±
0,093 0,892±
0,179 3 2,277±
0,228 1,691±
0,261 0,743±
0,118 2,851±
0,213 2,830±
0,041* 1,010±
0,080 7 2,201±
0,193 1,841±
0,205 0,836±
0,124 1,670±
0,307 1,867±
0,121 1,221±
0,211 14 2,225±
0,160 1,630±
0,295 0,733±
0,256 1,032±
0,036 1,332±
0,073* 1,300±
0,106 21 2,277±
0,235 1,648±
0,223 0,724±
0,163 1,124±
0,135 1,630±
0,296 1,488±
0,307 28 2,149±
0,168 1,686±
0,300 0,785±
0,204 1,231±
0,195* 0,994±
0,013* 0,862±
0,118 35 2,151±
0,107 1,684±
0,061 0,783±
0,085 1,074±
0,111* 1,052±
0,234* 0,958±
0,132 Примечание: * p<0,05

Из таблицы 4 видно, что у группы негативных животных среднегрупповые показатели спонтанной и стимулированной активности катионных белков в течение всего срока исследования значительно не меняются. Тогда как у иммунизированных животных уже на третьи сутки после введения бруцеллезных антигенов отмечаются изменения среднегрупповых показателей катионных белков, как в спонтанном, так и в стимулированном варианте постановки реакции. Коэффициенты стимуляции у группы негативных животных на протяжении всего срока исследования варьируются в пределе от 0,724±0,163 до 0,862±0,118. У иммунизированных животных, до иммунизации, среднегрупповой коэффициент стимуляции составляет 0,892±0,179, начиная с третьих суток после иммунизации, среднегрупповой коэффициент стимуляции увеличивается и достигает максимального значения на 21 сутки после иммунизации - 1,488±0,307. При этом до иммунизации у 100% животных индивидуальные показатели КС до 1,06. На 14 сутки после иммунизации КС от 1,06 и выше у 100% иммунизированных животных, на 21 сутки - у 96%.

Таким образом, определение кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофильных гранулоцитов по количеству катионных белков у животных наиболее информативно проводить на 14-21 сутки после сенсибилизации бруцеллами, в этот период значения КС от 1,06 и выше регистрировались в 96-100 % случаев, что свидетельствует о высокой специфической активности катионных белков нейтрофильных гранулоцитов к бруцеллам.

Литература

1. Soehnlein O., Weber C., Lindbom L. Neutrophil granule proteins tune monocytic cell function // Trends Immunol. 2009. V. 30. No 11. P. 538-546.

2. Soehnlein O., Lindbom L., Weber C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment // Blood. 2009. V. 114. No 21. P. 4613-4623.

3. Soehnlein O., Weber C., Lindbom L. Neutrophil granule proteins tune monocytic cell function // Trends Immunol. 2009. V. 30. No 11. P. 538-546.

4. Mocsai A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond // J. Exp. Med. 2013. V. 210. No 7. P. 1283-1299.

5. Шубич М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. 1974. Т. 16, № 10. С. 1321-1322.

6. Методы комплексной оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в норме и патологии / сост. И.В. Нестерова, Г.А. Чудилова и др. Краснодар, 2017. с. 16-17.

7. Хитрик Н.М. Функциональная активность фагоцитов у больных с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва, 2007. с. 10-11.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Предложен способ определения кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофильных гранулоцитов при сенсибилизации бруцеллами, включающий постановку реакции определения количества катионных белков нейтрофилов с применением плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, фиксацию результатов реакции фотометрическим методом при длине волны 540 нм, определение коэффициента стимуляции (КС), при этом в качестве активатора реакции используют ультразвуковой лизат Brucella abortus 19 в концентрации 50 мкг/мл белка в конечном продукте; при значении КС от 1,06 и выше определяют наличие специфической сенсибилизации нейтрофильных гранулоцитов к бруцеллам. Изобретение обеспечивает повышение точности и достоверности оценки кислороднезависимой бактерицидной активности нейрофилов у животных, сенсибилизированных бруцеллами. 4 табл.

Способ определения кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофильных гранулоцитов при сенсибилизации бруцеллами, включающий постановку реакции определения количества катионных белков нейтрофилов с применением плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, фиксацию результатов реакции фотометрическим методом при длине волны 540 нм, определение коэффициента стимуляции (КС), отличающийся тем, что в качестве активатора реакции используют ультразвуковой лизат Brucella abortus 19 в концентрации 50 мкг/мл белка в конечном продукте, при значении КС от 1,06 и выше определяют наличие специфической сенсибилизации нейтрофильных гранулоцитов к бруцеллам.