ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ СНО РЕКОМБИНАНТНОГО ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА (ФСГ) ЧЕЛОВЕКА, ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ СНО БЕТА-СУБЪЕДИНИЦЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ФСГ ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА СНО - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФСГ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ГОРМОНА Российский патент 2015 года по МПК C12N15/63 C12N15/16 C12N15/79 C12N5/10 C12P21/02 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, который может быть использован в медицине, методом рекомбинантных ДНК.

Предшествующий уровень техники

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) является незаменимым для нормального роста и созревания фолликулов и для образования половых стероидов у человека. У женщин уровень ФСГ является критичным для начала и протекания развития фолликулов и, следовательно, для установления определенного ритма созревания и количества достигающих зрелости фолликулов, у мужчин - для индукции и поддержания сперматогенеза. Вследствие этого рекомбинантные и нативные варианты фолликулостимулирующего гормона могут применяться для стимуляции развития фолликулов и образования стероидов во многих случаях нарушения половой функции. Существенная часть производимых лекарственных средств ФСГ используется при применении вспомогательных репродуктивных технологий, проводимых под медицинским контролем, таких как экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов (ЭКО/ПЭ), перенос гамет в маточную трубу (ГИФТ) и интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ) (van Wely M. et al. (2011), "Recombinant versus urinary gonadotrophin for ovarian stimulation in assisted reproductive technology cycles". Cochrane Database of Syst. Rev., 2: CD005354).

В клинической практике препараты, содержащие ФСГ, обычно используют при ановуляторном бесплодии у женщин, а также при применении вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с: (1) первым классом ановуляторного бесплодия (гипоталамо-гипофизарная недостаточность), для которого характерны очень низкие содержания эндогенных ФСГ, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и эстрадиола; (2) второго класса ановуляторного бесплодия (гипоталамо-гипофизарная дисфункция), для которого характерны низкий или нормальный уровень эндогенного ФСГ, высокое или нормальное содержание эндогенного ЛГ, высокий или нормальный уровень тестостерона, а также при наличии мужского фактора бесплодия (Dhont M. (2005), "WHO-classification of anovulation: background, evidence, problems. International congress series. 1279:3-9).

На сегодняшний день существует два класса фармацевтических препаратов, содержащих ФСГ: полученные из мочи женщин в постменопаузе и полученные с использованием рекомбинантных ДНК. Препараты ФСГ мочевого происхождения появились на рынке много лет назад (1958 г.) и на сегодняшний день представлены: высокоочищенными мочевыми гонадотропинами с биохимической чистотой ФСГ до 77-95% и содержащими около 2% активности ЛГ; мочевыми гонадотропинами с биохимической чистотой ФСГ до 70%, а также содержащими ЛГ, хорионический гонадотропин (ХГ) и существенные количества посторонних белков, не относящихся к гонадотропинам. Применение технологии рекомбинантной ДНК позволило получить фармацевтические препараты ФСГ, содержащие рекомбинантный ФСГ человека с чистотой более 99% и не содержащих других гонадотропинов. Разработка новых методов и подходов, позволяющих получать большие количества рекомбинантного ФСГ в культивируемых клетках млекопитающих, представляет большой интерес для фармацевтической промышленности вследствие постоянного роста потребления лекарственных препаратов ФСГ и низкой продуктивности разработанных в конце 80-х годов прошлого века систем экспрессии ФСГ, использованных для производства оригинальных препаратов рекомбинантного ФСГ. Оптимизация эукариотической системы экспрессии рекомбинантного ФСГ, проведенная путем многократного увеличения удельной продуктивности получаемой моноклональной клеточной линии лежат в основе настоящего изобретениия.

ФСГ - гетеродимерный гликопротеиновый гормон (34 кДа), продуцирующийся аденогипофизом. Он состоит из двух нековалентно связанных друг с другом субъединиц, кодирующихся разными генами (Pierce J.G., Parsons T.F. (1981), "Glycoproteinhormones: structureandfunction". Annu.Rev. Biochem., 50:465-495). Альфа-субъединица ФСГ человека содержит 92 а.к. и также представлена в лютеинезирующем гормоне, хорионическом гонадотропине и тиреотропном гормоне (ТТГ). Все данные гормоны являются гетеродимерами одинаковой альфа-цепи и различных специфических бета-цепей (или субъединиц). Бета-субъединица ФСГ состоит из 111 а.к. Альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека подвергаются N-гликозилированию по остаткам аспарагина альфа-52, альфа-78 и бета-7, бета-24 соответственно, что определяет высокую степень гликозилирования ФСГ до 35% в весовом соотношении, тем самым создавая микрогетерогенность гормона (Mulders J.W. et al. (1997). "Prediction of the in vivo Biological Activity of Human Recombinant Follicle Stimulating Hormone Using Quantitative Isoelectric Focusing". Biologicals, 25(3):269-81). Вторичные модификации карбогидратных цепей включают образование разветвленных структур на основе сиаловых кислот, количественный и качественный состав которых определяет время полужизни ФСГ в кровотоке, биологическую активность гормона in vivo и способность к активации рецепторов ФСГ in vitro (Ulloa-Aguirre A. et al. (1995). "Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance". EndocrRev.; 16(6):765-87). Изогормоны ФСГ с изоэлектрической точкой (pI) 5.5 в 2-3 раза превышают способность к активации рецепторов ФСГ в тестах in vitro изогормонами с pI 4.3, в то же время наиболее кислые формы изогормонов ФСГ (pI 3.5) имеют в 100-200 раз большую биологическую активность в тестах in vivo, по сравнению с изогормонами, имеющими pI 5.5 (Mulders J.W. et al. (1999). "Prediction of the in-vivo biological activity of human recombinant follicle-stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing. Optimization of the model". Pharm. Pharmacol. Commun., 5:51-55).

Известен самый первый способ создания векторов, кодирующих альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, и генетическая модификация этими векторами культивируемых клеток мыши линии С127 в целях получения рекомбинантного ФСГ (патенты США 4923805, 5156957). Для экспрессии генов альфа- и бета-субъединиц ФСГ, содержащих все экзоны и интроны, используются две независимые плазмидные конструкции pRF375 и CL28FSH2.8BPV соответственно. Недостатком описанного способа является использование для экспрессии целевых генов металлотеонеинового промотора (МТ) мыши, который не является наиболее сильным для экспрессии белков в эукариотических клетках. Также полученные плазмиды не были использованы для создания стабильной линии клеток-продуцентов полноразмерного ФСГ человека, поэтому неизвестен уровень секреции рекомбинантного ФСГ в культуральную среду при использовании полученных плазмид.

Известен способ получения векторов, кодирующих альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, и генетическая модификация этими векторами культивируемых клеток китайского хомяка линии СНО (Keene J.L. et al. (1989). "Expression of biologically active human follitropin in Chinese hamster ovary cells". J. Biol. Chem., 264:4769-4775). Гены альфа- и бета-субъединицы ФСГ, содержащие интроны и экзоны, клонируют в векторы рМ²/α и рМ² соответственно, экспрессия субъединиц находится под контролем промотора вируса саркомы мышей Харви (LTR). К недостаткам этого способа относится использование генов субъединиц ФСГ человека, содержащих интроны, которые могут содержать как энхенсерные, так и сайленсерные регуляторные элементы, положительно и отрицательно влияющие на экспрессию кодируемого белка. Обе созданные плазмиды содержат последовательность, обеспечивающую устойчивость трансфицированных клеток к селективному антибиотику - генетицину (G418), тогда как использование двух селективных антибиотиков и последовательности дигидрофолатредуктазы мыши (DHFR) для селективного отбора и амплификации являются более перспективными при создании генетической модификации клеточных культур. При описании данного способа не указывается продуктивность по целевому белку полученной клеточной линии, а также на протяжении скольких пассажей сохраняется продукция ФСГ.

Известен другой способ создания эукариотических продуцентов рекомбинантных гетеродимерных гормонов человека, в том числе ФСГ (патент США 5240832). Способ основан на получении двух независимых плазмидных конструкций. Первая плазмида создана на основе вектора CLH3AXSC2DHFR и содержит полноразмерный ген альфа-субъединицы ФСГ человека, а также открытую рамку считывания DHFR для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках. Вторая плазмида создана на основе вектора CLH3AXSC20DOC и содержит кДНК бета-субъединицы ФСГ человека, ген орнитин декарбоксилазы (ODC) мыши для селективного отбора трансформантов. Экспрессия генов обеих субъединиц ФСГ находится под контролем МТ промотора. С помощью котрансфекции линии клеток DUKX СНО двумя вышеописанными плазмидами с последующей их амплификацией в среде с добавлением 200 мМ метотрексата (МТХ) получают несколько линий клеток-продуцентов ФСГ. Уровень секреции полноразмерного ФСГ в культуральную среду по 9 полученным линиям составляет в среднем 1,25 мкг/10⁶ клеток/день. К недостаткам этого метода относится использование полноразмерного гена альфа-субъединицы ФСГ человека, так как интроны могут содержать сайленсерные регуляторные элементы, отрицательно влияющие на экспрессию кодируемого белка в процессе культивирования. При описании данного способа не указывается конечная концентрация секретируемого ФСГ (т.н. вольюметрическая продуктивность) и число пассажей культуры до падения уровня секреции.

Известен способ создания продуцентов рекомбинантного человеческого ФСГ на основе линии клеток СНО-K1 (Olijve W. et al. (1996). "Molecular biology and biochemistry of human recombinant folliclestimulating hormone" Mol. Hum. Rep., 2(5):371-382). Ген альфа-субъединицы ФСГ, содержащий интроны, и открытую рамку считывания бета-субъединицы ФСГ клонируют в вектор pKMS, созданный на основе вектора pBR327, с получением вектора pKMS.FSHαgβg, в котором экспрессия гена альфа-субъединицы находится под контролем раннего вирусного промотора SV40, с содержанием энхенсерных последовательностей SV40, а бета-субъединицы - под контролем металлотеонеинового промотора (MT-II), с содержанием энхенсерных последовательностей вируса лейкемии мышей (MuLV). Амплификацию плазмиды в геноме эукариотических клеток СНО-K1 обеспечивает открытая рамка считывания дигидрофолатредуктазы мыши, присутствующая в векторе pKMS.FSHαgβg. Клетки СНО-K1 котрансфицируют плазмидами pKMS.FSHαgβg и вспомогательной плазмидой pAG60/MT2, содержащей ген металлотеонеина и ген устойчивости к неомицину, которые обеспечивают резистентность культуры клеток к тяжелым металлам (Cd²⁺) и селективному антибиотику генетицину (G418) соответственно. Продуктивность линии-продуцента сохраняется при культивировании в биореакторе на микроносителях на протяжении 3-х месяцев и составляет 5-8 МЕ/10⁶ клеток/день, что приблизительно соответствует 0,5-0,8 мкг/10⁶ клеток/день. Данный способ обладает недостатками, а именно: для экспрессии гетерологического белка в эукариотической системе используются неоптимальные промоторы - металлотеонеиновый (МТ-II) и вирусный (SV40), активность последнего может подавляться клетками в процессе культивирования. Также наличие интронов в клонированной последовательности альфа-субъединицы ФСГ может индуцировать отрицательную регуляцию экспрессии этой субъединицы в клетках.

Известен способ получения плазмиды pXM17ss#6 для экспрессии альфа- и бета-субъединиц ФСГ человека в клетках эукариот, которая способна экспрессировать оптимизированные кодирующие синтетические последовательности альфа- и бета-субъединиц ФСГ (патентная заявка США 20120034655 А1). К недостаткам данного метода относится выбор неоптимальных вирусных промоторов (SV40 и CMV), проведение только временной трансфекции полученной плазмидой без проведения амплификации экспрессионной кассеты метотрексатом и дальнейшей селекции антибиотиком, так как известно, что свойства поликлональной культуры клеток после проведения временной трансфекции и стабильно-трансфицированной клеточной культуры могут значительно различаться как по стабильности, так и по продуктивности целевого белка.

Известен способ создания клеток-продуцентов ФСГ с использованием синтетических генов альфа- и бета-субъединиц ФСГ человека (патентная заявка РФ №2012106207). Синтетический ген альфа-субъединицы ФСГ человека клонируют в вектор pcDNA-TOPO (Invitrogen, США) с получением плазмиды pcDNA/FSHальфа, для получения плазмиды pOptiVEC/FSHбета синтетический ген бета-субъединицы клонируют в вектор pOptiVEC-TOPO (Invitrogen, США). В обеих полученных плазмидах экспрессия альфа- и бета-субъединиц ФСГ находится под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса (CMV), плазмида pcDNA/FSHальфа содержит ген устойчивости к антибиотику неомицин для селекции стабильных клеточных линий генетицином, плазмида pOptiVEC/FSHбета содержит последовательность дигидрофолатредуктазы. После проведения котрансфекции клеток линии СНО K1 DXB11 полученными плазмидами, получают линию клеток huFSHIK, которая способна секретировать в культуральную среду полноразмерный гормон ФСГ в количестве 1,5 мкг/10⁶ клеток/день в течение 30 пассажей при культивировании с МТХ (в селективных условиях) и, по крайней мере, в течение 15 пассажей без МТХ (в неселективных условиях). Данный метод обладает следующими недостатками. Для экспрессии генов обеих субъединиц ФСГ используется промотор цитомегаловируса (CMV), эффективность которого для экспрессии генов-интереса может изменяться как в течение культивирования модифицированной культуры клеток, так и при криоконсервации клеточной культуры, что может приводить к снижению продуктивности экспрессии каждого из генов двух субъединиц и впоследствии к значительному стехиометрическому дисбалансу в продукции альфа- и бета-субъединиц ФСГ. Также при получении клеток-продуцентов ФСГ клетки культивировали в присутствии 50-100 нМ метотрексата, что недостаточно для получения максимальной амплификации экспрессионных кассет в геноме. Синтетические последовательности открытых рамок считывания альфа- и бета-субъединиц ФСГ были получены путем оптимизации кодонов для экспрессии в млекопитающих, в то же время известно, что оптимизация кодонов и другие манипуляции с кодирующей последовательностью могут приводить к снижению уровней экспрессии целевых генов. Культивирование генетически модифицированных плазмидами клеток проводили в среде с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (FBS), что также является недостатком описанного метода ввиду неэкономичности использования FBS при промышленном культивировании клеток, а также наличии риска потери продуктивности клеточной культуры при адаптации к росту в бессывороточной среде культивирования и постоянному риску контаминации промышленной культуры вирусами крупного рогатого скота и прионами.

Известны способ получения вектора, содержащего гены альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, и линия-продуцент рекомбинантного ФСГ, полученная после трансфекции созданным вектором линии клеток DUKX-B11 СНО (Yoon S.K. et al. (2007). "Effect of culture temperature on follicle-stimulating hormone production by Chinese hamster ovary cells in a perfusion bioreactor". Appl. Microbiol. Biotechnol., 76:83-89). Из описания способа неизвестно, какой вектор и структурные элементы были использованы для создания экспрессионной плазмиды. С помощью данного способа получают стабильную клеточную линию, способную при культивировании в биореакторе с перфузией при 28°С продуцировать ФСГ в количестве более 10 мкг/10⁶ клеток/день. К недостаткам данного способа относится возможность получения продуцируемого ФСГ на высоком уровне лишь в течение 8 дней их культивирования (с 15 по 23 день культивирования).

Известен способ получения двух плазмид, кодирующих альфа- и бета-субъединицы ФСГ на основе вектора pLCED, созданного с использованием модифицированного вектора pCDM8 (Invitrogen, США) (Kim D.J. et al. (2010). "Highly expressed recombinant human follicle-stimulating hormone from Chinese hamster ovary cells grown in serum-free medium and its effect on induction of folliculogenesis and ovulation". Fertil. Steril., 93:2652-60). Открытую рамку считывания обеих субъединиц получают с помощью последовательно проведенных полимеразных цепных реакций (ПЦР) и клонируют в отдельный вектор pLCED. Экспрессия субъединиц в клетках СНО начинается независимо по контролем вирусного промотора (CMV), причем обе плазмиды способны экспрессировать также ген DHFR, связанный с генами субъединиц участком, содержащим сайт внутреннего связывания рибосом (IRES). Продуктивность получаемой клональной линии составляет 0,0085 мМЕ/клетку/48 часов, что составляет приблизительно 0,425 мкг/10⁶ клеток/день. К недостаткам данного способа относится использование неоптимальных вирусных промоторов и невысокий уровень продукции ФСГ. Информация о стабильности полученной культуры к продукции ФСГ также отсутствует.

Известен способ создания продуцента ФСГ, в котором последовательность, кодирующую альфа-субъединицу ФСГ, клонируют в вектор рЕ-neo, а последовательность, кодирующую бета-субъединицу, - в вектор pE-hygr (патентная заявка США 2009/0291473 А1). кДНК альфа-субъединицы получают путем ПЦР из библиотеки кДНК человеческой плаценты, а кДНК бета-субъединицы из библиотеки кДНК человеческого гипофиза. Клетки линии СНО котрансфицируют полученными плазмидами и производят селекцию клонов с использованием антибиотиков - гигромицина и генетицина (G418), получают клеточную линию, адаптированную к росту в суспензии в бессывороточной среде, продуктивность которой не превышает 1 мкг ФСГ/10⁶ клеток/день. При данном способе для индукции экспрессии обеих субъединиц используется промотор EF-1 (коровая область промотора фактора элонгации трансляции 1 человека), который является относительно слабым промотором для экспрессии белков в клетках грызунов. Стабильность продукции ФСГ линией-продуцентом в данной заявке не упоминается.

Известны способы повышения биологической активности рекомбинантного ФСГ за счет увеличения его гликозилирования (патентные заявки США 2009/0018070 А1, 2005/0100989 А1) и добавления C-концевого пептида (СТР, carboxyterminalpeptide) бета-субъединицы человеческого хорионического гонадотропина к бета-субъединице ФСГ (патенты США 5338835 и 5585345).

Краткое описание настоящего изобретения

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание высокопродуктивной технологии получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека для биофармацевтического производства.

Технический результат достигался путем создания пары новых совместимых экспрессионный плазмидных ДНК p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain, кодирующих открытые рамки считывания альфа- и бета-цепей гетеродимерного белка фолликулостимулирующего гормона человека и создание на их основе клональной клеточной линии-продуцента.

В основе данной технологии лежит разработанная пара совместимых плазмидных ДНК p1.1-FSH-AIB (длина 13222 пар оснований, SEQ ID NO:1, Фиг.1) и p1.2-Hygro-B-chain (длина 12811 пар оснований, SEQ ID NO:4, Фиг.2).

Плазмида p1.1-FSH-AIB состоит из:

- фрагмента ДНК длиной 1324 п.о., в следующей последовательности содержащего:

- последовательность 363 п.о. (SEQ ID NO:1 4079-4441), содержащую синтетическую последовательность Козак (сайт кэп-зависимой инициации трансляции), SEQ ID NO:1 4079-4087), обеспечивающую инициацию трансляции мРНК, и ОРС альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (SEQ ID NO:1 4088-4438) с блоком стоп-кодонов (SEQ ID NO:1 4436-4441),

- последовательность 955 п.о. (SEQ ID NO:1 4448-5402), содержащую последовательность IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV) дикого типа (SEQ ID NO:1 4448-5012), обеспечивающую бицистронную экспрессию в животных клетках, и ОРС бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (SEQ ID NO:1 5010-5399) с блоком стоп-кодонов (SEQ ID NO:1 5397-5402); и

- фрагмента ДНК длиной 11898 п.о. плазмиды p1.1 (SEQ ID NO:1 5403-13222, 1-4074, Фиг.3), в следующей последовательности содержащего регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию целевого белка:

- последовательность IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках, (SEQ ID NO:1 5423-6010) и последовательность фактора устойчивости трансфицированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) (SEQ ID NO:1 6023-6586),

- 3′ нетранслируемую область (3′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающую терминатор и сигнал полиаденилирования этого гена, а также фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО (SEQ ID NO:1 6588-10846);

- область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотор гена bla, обеспечивающей устойчивость бактерий к антибиотику ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli (SEQ ID NO:1 11000-10846), и участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) (SEQ ID NO:1 12810-13211);

- 5′ нетранслируемую область (5′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающие фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО, и его функциональный промотор (SEQ ID NO:1 11-4074).

Плазмида p1.2-Hygro-B-chain состоит из:

- фрагмента ДНК, длиной 402 п.о., в следующей последовательности содержащего, последовательность 363 п.о. (SEQ ID NO:4 12409-12810), содержащую синтетическую последовательность Козак (сайт кэп-зависимой инициации трансляции, SEQ ID NO:1 12409-12417), обеспечивающую инициацию трансляции мРНК, и ОРС цепи бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (SEQ ID NO:1 12418-12804) с блоком стоп-кодонов (SEQ ID NO:1 12805-12810),

- фрагмента 12409 п.о. плазмиды р1.2 (SEQ ID NO:4 1-12408, Фиг.4), в следующей последовательности содержащего регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию целевого белка:

- 3′ нетранслируемую область (3′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающую терминатор и сигнал полиаденилирования этого гена, а также фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО (SEQ ID NO:4 1-4257);

- промотор вируса SV40, последовательность фактора устойчивости трансфицированных клеток к селекционному маркеру - антибиотику гигромицину, сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40 (SEQ ID NO:4 4292-5946),

- область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотор гена bla, обеспечивающей устойчивость бактерий к антибиотику ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli (SEQ ID NO:4 6108-6781),

- участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) (SEQ ID NO:4 7918-8319),

- 5′ нетранслируемую область (5′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающую фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО функциональный промотор этого гена, а также его функциональный промотор (SEQ ID NO:4 8331-12401).

Плазмида p1.1-FSH-AIB имеет размер 13222 п.о. и содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции NheI (1), AgeI (2396), AscI (5464), PvuI (6857), BstBI (11863), AbsI (11894), XbaI (12080).

Плазмида p1.2-Hygro-B-chain имеет размер 12811 п.о. и содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции AgeI (1209), KpnI (4143), NdeI (5120), PsiI (5844), SalI (5962), SwaI (10487), FseI (11171), AbsI (12404).

Плазмиды были последовательно введены методом электротрансфекции (Straus S.E. et al., J. Virol., 1981, Jul; 39(1):290-4) в клетки линии CHO-S (Invitrogen, США; кат. № R800-07), адаптированной к бессывороточной ростовой среде и выделенной в виде отдельного субклона из клеточной линии CHOK1. После введения в клетки линеаризованной плазмиды p1.1-FSH-AIB вели культивацию в безбелковой среде, не содержащей гипоксантин и тимидин, и дополнительно содержащей 1 мкМ ингибитора DHFR метотрексата (МТХ) до восстановления жизнеспособности клеток более 85%. После этого была проведена амплификация целевых генов цепей ФСГ в геноме путем последовательных культивировании в присутствии возрастающих концентраций метотрексата до концентрации МТХ 8 мкМ. Была получена поликлональная популяция клеток, устойчивых к высокой концентрации МТХ и продуцирующих увеличенные количества ФСГ и значительные количества свободной альфа-цепи ФСГ. Клетки данной популяции трансфицировали плазмидой p1.2-Hygro-B-chain, после чего культивировали в присутствии 8 мкМ МТХ и 750 мкг/мл гигромицина до восстановления жизнеспособности клеток более 85%. Была получена популяция клеток, секретирующих большее количество гетеродимера ФСГ. Клетки данной популяции подвергли клонированию методом предельных разведений. Полученные клоны клеток-продуцентов были проанализированы методом иммуноферментного анализа, и были отобраны клоны, дающие максимальный уровень экспрессии гетеродимера ФСГ. Среди них был выбран клон C-P1.3-FSH-G4, при культивировании которого в суспензионной культуре в бессывороточной среде конечная концентрация фолликулостимулирующего гормона человека составляла 36,5 мкг/мл при конечной концентрации клеток 1,55 млн/мл, удельная продуктивность не менее 10 пг/клетка/день. Полученная клеточная линия C-P1.3-FSH-G4 депонирована во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-140.

Целью настоящего изобретения является предоставление плазмид для экспрессии рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, в частности плазмид p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain. Также целью настоящего изобретения является предоставление моноклональной линии клеток млекопитающего, в частности клеток яичника китайского хомячка, - продуцентов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, содержащей в геноме множественные копии экспрессионных кассет, соответствующих линеаризованным экспрессионным плазмидам, в частности плазмидам p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain. Иллюстративным примером указанной моноклональной линии клеток являются клетки яичника китайского хомячка клона С-P1.3-FSH-G4.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека с использованием указанных клеток.

Подробное описание настоящего изобретения

Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание технологии высокопродуктивного получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека для биофармацевтического производства с использованием культивируемых клеток яичника китайского хомячка, адаптированных к суспензионному культивированию в безбелковой среде, содержащих в геноме множественные копии генетических кассет, представляющих собой линеаризованные экспрессионные плазмиды, содержащих фрагмент ДНК, кодирующих альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека под контролем промотора и регуляторных элементов, функционирующих в эукариотической клетке.

Термин «экспрессионная плазмида» («экспрессионная плазмидная ДНК») означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор, сигнал полиаденилирования. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка.

Фрагментами ДНК, кодирующими рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека согласно настоящему изобретению, являются гены, кодирующие ОРС полипептидов альфа- и бета-цепей ФСГ, которые могут быть получены, например, как указано в Примере 1. Также указанные фрагменты ДНК могут быть получены, например, с использованием технологии клонирования фирмы SloningBioTechnology, описанной в заявке РСТ WO2005071077.

Последовательность искусственного гена, кодирующего ОРС обеих субъединиц рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1 (цепь альфа-субъединицы - нуклеотиды 4088-4438, цепь бета-субъединицы - нуклеотиды 5010-5399). Аминокислотная последовательность секретируемого фолликулостимулирующего гормона человека согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2 и 3, и представляет собой продукт трансляции нуклеотидов 4088-4438 и 5010-5399 последовательности ОРС SEQ ID NO:1, включая 24 аминокислоты N-концевого сигнального пептида альфа-цепи и 18 аминокислот N-концевого сигнального пептида бета-цепи, отделяющихся при посттрансляционном процессинге цепей ФСГ и отсутствующих в зрелом секретированном гетеродимерном белке. Часть молекул цепей ФСГ может быть секретирована в свободной форме, для целей настоящего изобретения важно накопление только двуцепочечной формы гетеродимера цепей ФСГ в культуральной среде.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию гена в клетках китайского хомячка, предпочтительно, чтобы ОРС предварялась последовательностью для кэп-зависимой инициации трансляции (последовательность Козак), например, синтетической. Для кэп-независимой инициации трансляции предпочтительно использование вирусных регуляторных элементов класса сайтов внутреннего связывания рибосом (IRES).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК SEQ ID NO:1 (цепь альфа-нуклеотиды 4088-4438, цепь бета-нуклеотиды 5010-5399), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу такой же функциональный белок, могут быть выявлены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке и установления активности экспрессируемого продукта.

ФСГ - гетеродимерный гликопротеиновый гормон (34 кДа), продуцирующийся аденогипофизом, и состоит из двух нековалентно связанных друг с другом субъединиц, кодирующихся разными генами (Pierce J.G., Parsons T.F. (1981), "Glycoproteinhormones: structureandfunction". Annu. Rev. Biochem., 50:465-495).

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, определяются по его способности стимулировать рост фолликулов. Так, например, биологическую активность рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека можно определить с помощью теста Steelman-Pohley, по линейному увеличению веса яичников крыс в зависимости от вводимой дозы препарата ФСГ (Steelman S.L., Pohley F.M. (1953) "Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin". Endocrinology, 53:604-16). Концентрацию гетеродимерного фолликулостимулирующего гормона человека определяют при помощи иммуноферментного анализа в сравнении со стандартом, в качестве которого можно использовать образцы плазмы крови женщин, калиброванные против первичного международного стандарта ФСГ, изготовляемого Всемирной Организацией Здравоохранения, например стандарта NIBSC code: 08/282. Удельную активность фолликулостимулирующего гормона человека определяют как отношение активности и концентрации ФСГ и выражают в МЕ/мг. Считается, что вариант белка обладает свойствами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека при условии, что удельная активность указанного варианта составляет не ниже 1% от удельной активности природного фолликулостимулирующего гормона человека, выделяемого из мочи, то есть не менее 60 МЕ/мг.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий цепи альфа- и бета-субъединиц фолликулостимулирующего гормона человека или индивидуальную цепь бета-субъединицы ФСГ человека под контролем промотора и регуляторных элементов, функционирующих в эукариотической клетке. В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pcDNA3.1, pCMV-Myc, pDEF38 и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.

Пара совместимых плазмид согласно настоящему изобретению означает две такие экспрессионные плазмиды, которые могут быть использованы для одновременной или последовательной трансфекции культивируемых клеток млекопитающих и последующей селекции стабильно трансфицированных клеток. Необходимым условием совместимости векторов является наличие в их составе различных генов устойчивости к действию селекционных агентов, сообщающих трансфицированным клеткам устойчивость к действию только одного из нескольких используемых селекционных агентов. Экспрессионые плазмиды из пары совместимых плазмид могут кодировать ген, содержащий ОРС одной или обеих цепей ФСГ.

Конкретным вариантом реализации настоящего изобретения является пара совместимых плазмид p1.1-FSH-AIB (длина 13222 пар оснований, SEQ ID NO:1, Фиг.1) и p1.2-Hygro-B-chain (длина 12811 пар оснований, SEQ ID NO:4, Фиг.2), которые содержат следующие функциональные элементы, перечисленные в порядке их расположения:

Для плазмиды p1.1-FSH-AIB

1. область начала репликации плазмиды pUC (11000-11673), открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) (11815-122675) и прокариотический промотор гена bla (12670-12774), позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli;

2. участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), представляющий собой фрагмент конкатемера терминальных повторов вируса Эпштейна-Барр (12810-13211), обеспечивающей увеличение частоты интеграции генетической кассеты в геном клеток СНО и увеличение скорости амплификации кассеты в геноме;

3. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «выше по течению» (1-4071), включающий нетранскрибируемые области этого гена, промотор этого гена, первый интрон этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена фолликулостимулирующего гормона человека в геноме клеток СНО;

4. синтетическую последовательность Козак (сайт связывания рибосом) (4079-4087), обеспечивающую кэп-зависимую инициацию трансляции мРНК в животных клетках;

5. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (4088-4438) с блоком стоп-кодонов (4436-4441);

6. последовательность внутреннего сайта связывания рибосом вируса энцефаломиокардита EMCV дикого типа (4448-5012), обеспечивающая кэп-независимую инициацию трансляции полицистронных РНК в животных клетках;

7. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (5010-5399) с блоком стоп-кодонов (5397-5402);

8. последовательность аттенюированного внутреннего сайта связывания рибосом вируса энцефаломиокардита EMCV (5423-6010), обеспечивающую кэп-независимую инициацию трансляции полицистронных РНК в животных клетках;

9. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (6023-6586) - фактора устойчивости трансфицированных клеток к воздействию метотрексата;

10. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «ниже по течению» (6588-10846), включающий терминатор и сигнал полиаденилирования, а также нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена фолликулостимулирующего гормона человека в геноме клеток СНО.

Для плазмиды p1.2-Hygro-B-chain:

1. область начала репликации плазмиды pUC (6108-6781), открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) (6923-7783) и прокариотический промотор гена bla (7778 7882), позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli;

2. участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), представляющий собой фрагмент конкатемера терминальных повторов вируса Эпштейна-Барр (7918-8319), обеспечивающей увеличение частоты интеграции генетической кассеты в геном клеток СНО и увеличение скорости амплификации кассеты в геноме;

3. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «выше по течению» (8331-12401), включающий нетранскрибируемые области этого гена, промотор этого гена, первый интрон этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека в геноме клеток СНО;

4. синтетическую последовательность Козак (сайт связывания рибосом) (12409-12417), обеспечивающую кэп-зависимую инициацию трансляции мРНК в животных клетках;

5. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания бета цепи фолликулостимулирующего гормона человека (12418-12804) с блоком стоп-кодонов (12805-12810);

6. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «ниже по течению» (1-4257), включающий терминатор и сигнал полиаденилирования, а также нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека в геноме клеток СНО.

7. последовательность фактора устойчивости трансфицированных клеток к селекционному маркеру - антибиотику гигромицину (4669-5694) и регуляторные элементы для его экспрессии - промотор (4292-4572), сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40 (5827-5946).

Плазмида p1.1-FSH-AIB содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции NheI (1), AgeI (2396), AscI (5464), PvuI (6857), BstBI (11863), AbsI (11894), XbaI (12080).

Плазмида р1.2-Hygro-В-chain содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции AgeI (1209), KpnI (4143), NdeI (5120), PsiI (5844), SalI (5962), SwaI (10487), FseI (11171), AbsI (12404).

Структура плазмиды p1.1-FSH-AIB приведена на Фигуре 1.

Структура плазмиды p1.2-Hygro-B-chain приведена на Фигуре 2.

Плазмида p1.1-FSH-AIB сконструирована на базе экспрессионной плазмиды p1.1, подробно описанной в патентной заявке РФ 2011146243, целиком включенной в настоящее описание посредством ссылки. Плазмида p1.1 содержит функциональные промотор и терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, обеспечивающие конститутивную экспрессию целевого гена в клетках СНО, фланкированные 5′ и 3′ НТО этого гена, обеспечивающими эухроматинизацию сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО; участок для клонирования открытых рамок считывания целевых белков; внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV IRES), обеспечивающий реинициацию трансляции на бицистронной мРНК в клетках млекопитающих и полное генетическое сцепление уровней продукции целевого белка и DHFR; OPC DHFR мыши, экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с целевым геном (IRES DHFR) и обеспечивающую устойчивость стабильно трансфицированных клеток к отсутствию в среде тимидина и дозозависимую устойчивость к воздействию метотрексата (МТХ), что позволяет вести направленную селекцию высокопродуктивных клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме СНО; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), обеспечивающий повышенный уровень интеграции кассет в геном клеток СНО и ускорение процесса амплификации целевого гена в геноме под действием МТХ. Использование плазмиды p1.1 позволяет осуществлять высокочастотную интеграцию и ускоренную амплификацию экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, а также получать линии-продуценты с высоким уровнем продукции целевого белка и высокой стабильностью.

Плазмида p1.2-Hygro-B-chain сконструирована на базе экспрессионной плазмиды р1.2 для моноцистронной экспрессии, и подробно описанной в патентной заявке РФ 2013122048, целиком включенной в настоящее описание посредством ссылки. Плазмида р1.2 содержит функциональные промотор и терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, обеспечивающие конститутивную экспрессию целевого гена в клетках СНО, фланкированные 5′ и 3′ НТО этого гена, обеспечивающими эухроматинизацию сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО; участок для клонирования открытых рамок считывания целевых белков; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), обеспечивающий повышенный уровень интеграции кассет в геном клеток СНО и кассету, обеспечивающую экспрессию селекционного маркера гена устойчивости к антибиотику, под контролем генетических элементов для экспрессии в клетках млекопитающего. Использование плазмиды р1.2 позволяет осуществлять высокочастотную интеграцию экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, а также получать линии-продуценты с высоким уровнем продукции целевого белка при одновременной или последовательной трансфекции культивируемых клеток млекопитающих плазмидами на основе p1.1 и р1.2 и последующей селекции стабильно трансфицированных клеток.

При помощи созданных плазмид согласно настоящему изобретению, в частности плазмид p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain, можно трансформировать эукариотическую клетку, предпочтительно иммортализованную клетку яичника китайского хомячка. Выбор конкретной линии клеток не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. После проведения одного или нескольких раундов селекции и клонирования популяции трансформированных клеток могут быть получены клональные линии-продуценты рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека. Методология и приемы селекции и клонирования клеток известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования и селекции трансформантов уровень экспрессии фолликулостимулирующего гормона человека может варьироваться, факт транзиентной экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента, факт стабильной экспрессии целевого белка будет иметь место при успешном проведении раунда селекции популяции клеток-трансформантов.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например электропорацию, использование трансфекционных агентов, например метод, описанный в техническом документе компании Invitrogen, Inc. "Lipofectamine® 2000 Reagent" Pub. No. MAN0000995 Rev. Date 20 July 2012.

Согласно настоящему изобретению «клеточная линия - продуцент фолликулостимулирующего гормона человека» означает клональную линию клеток млекопитающих, обладающую способностью к продукции и секреции фолликулостимулирующего гормона человека, когда она согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «клеточная линия - продуцент фолликулостимулирующего гормона человека» также означает линию клеток, которые способна секретировать фолликулостимулирующий гормон человека в количестве не менее чем 1 мкг/мл при концентрации клеток 1-2 млн/мл, более предпочтительно не менее чем 10 мкг/мл при концентрации клеток 1-2 млн/мл при культивировании в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Указанный фолликулостимулирующий гормон человека секретируется указанными клетками в культуральную жидкость.

Среди клеток млекопитающих предпочтительно использование клеток китайского хомячка (Cricetulus griseus), предпочтительно клеток яичника (СНО). В качестве примера предпочтительных клеток яичника китайского хомячка может быть приведена линия CHO-S (Invitrogen, США; кат. № R800-07) (1. Puck, Т. (1958) J. Exp. Med. 108, 945. 2. Deaven, L.L. and Petersen, D.F. (1973) Chromosoma 41, 129. 3. D′Anna, J.A. (1996) Methods in Cell Science 18, 115. 4. D′Anna, J.A. et al. (1997) Radiation Research 148, 260. 5. Schifferli, K. et al. (1999) Focus 21, 16. 6. Ciccarone, V. et al. (1999) Focus 21, 54). Круг сублиний СНО не ограничен каким-либо образом, например могут быть использованы сублинии СНО CHOZN DHFR, СНО DUKXB11, СНО DG-44 и подобные им.

Конкретным примером линии для получения продуцента фолликулостимулирующего гормона человека согласно настоящему изобретению является линия CHO-S, но спектр линий клеток не ограничивается ей.

Линия CHO-S характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и генетическими признаками:

- Данные по видовой принадлежности: китайский хомячок Cricetulus griseus, яичник.

- Контроль видовой идентичности: кариологический, изоферментный (ЛДГ и Г6ФДГ).

- Маркерные признаки и методы их оценки: иммунологические, цитогенетические, биохимические, физиологические:

- Морфология: эпителиоподобная.

- Происхождение, вид клеток: стабильная диплоидная суспензионная клеточная линия CHO-S (Invitrogen, США; кат. № R800-07), адаптированная к бессывороточной ростовой среде, выделена в виде отдельного субклона из клеточной линии СНО K1.

- Признаки опухолевого роста in vivo, in vitro: отсутствуют.

- Онкогены: отсутствуют.

- Морфология клеточной линии: при анализе в световой микроскоп, культура представлена суспензией круглых клеток с овальным ядром, содержащих небольшие эндосомы, время удвоения 16-18 часов.

- Культуральные свойства, маркерные признаки: клетки адаптированы к росту в среде ProCHO 4 (Lonza, Швейцария) без добавления сыворотки, с добавлением L-глутамина 8 мМ.

- Рекомендуемые условия для замораживания: замораживать клетки при плотности ≥2,0×106 живых клеток/мл; ростовая среда, 10% ДМСО.

- Рекомендуемые условия для культивирования: клетки культивируют в колбах Эрленмеера с рабочим объемом 30 мл, 125 мл или 500 мл на орбитальном шейкере при 120-140 об/мин в увлажненной атмосфере при 5% СО₂ при температуре 37°С. Пассирование клеток производят каждые 2-3 дня путем разбавления суспензии клеток свежей средой с кратностью 1:4-1:8. Плотность посева 0,2-0,3×10⁶ клеток/мл, максимальная плотность 3,0×10⁶ клеток/мл.

Трансформация клеток линии CHO-S плазмидами p1.1-FSH-AIB (длина 13222 пар оснований, SEQ ID NO:1, Фиг.1) и p1.2-Hygro-B-chain (длина 12811 пар оснований, SEQ ID NO:4, Фиг.2) с последующей селекцией, аплификацией трансгена, кодируемого плазмидой p1.1-FSH-AIB, и клонированием приводит к получению клеточных линий-продуцентов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека.

Линия-продуцент C-P1.3-FSH-G4 обеспечивает синтез и секрецию рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека в количестве 36,5 мкг фолликулостимулирующего гормона на 1 мл среды при концентрации клеток 1,55 млн/мл при культивировании в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Линия-продуцент C-P1.3-FSH-G4 депонирована во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-140.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека в клетках млекопитающих, включающего культивирование в питательной среде описанных выше клеток млекопитающих - продуцентов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, и выделение полученного целевого рекомбинантного белка из культуральной жидкости.

Выращивание клеток, выделение и очистка целевого белка из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам культивирования, в которых рекомбинантный белок продуцируется с использованием клеток млекопитающих.

Питательная среда, используемая для культивирования, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, незаменимые аминокислоты, нуклеозиды, незаменимые липиды, минеральные добавки, инсулин и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, требующихся для роста клеток. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические соединения. В качестве источника азота может использоваться аминокислота глутамин или ее дипептиды или природные источники азота, такие как соевый гидролизат. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.

Для получения фармацевтически пригодного фолликулостимулирующего гормона человека предпочтительно использование бессывороточной питательной среды для культивирования.

Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, предпочтительно с повышенным содержанием СО₂ (8%), таких как перемешивание культуральной жидкости в колбах, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 34 до 38°С. Обычно выращивание в течение от 24 часов до 20 дней приводит к накоплению целевого рекомбинантного белка в культуральной среде. После выращивания твердые остатки, такие как клетки и их фрагменты, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования, а затем целевой белок может быть выделен и очищен методами хроматографии и/или концентрирования.

Особенности созданных экспрессионных плазмид, линии клеток и результаты практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.

Краткое описание фигур

На Фигуре 1 показана карта экспрессионной плазмиды p1.1-FSH-AIB (длина 13222 пар оснований). Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотер гена bla; EBV TR - участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека; 5 CHEF функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ НТО этого гена; transcription start - точка начала транскрипции; 3CHEF функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3′ НТО этого гена; рА - сигнал полиаденилирования; EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV) дикого типа; art EMCV IRES - аттенюированный внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV); DHFR - открытая рамка считывания дигидрофолатредуктазы мыши для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках; Kozak - область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции, FSH-A-chain - ОРС альфа-субъединицы ФСГ; FSH-B-chain - ОРС бета-субъединицы ФСГ, stop - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.

На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды p1.2-Hygro-B-chain (длина 12811 пар оснований). Используются обозначения аналогично фигуре 1, а также SV40 promoter - область промотора вируса SV40; SV40pA, terminator - терминатор и сигнал полиаденилирования вируса SV40; hygroB - ОРС гена устойчивости к гигромицину.

На Фигуре 3 показана карта экспрессионного вектора p1.1. Используются обозначения аналогично фигуре 1.

На Фигуре 4 показана карта экспрессионного вектора p1.2-Hygro. Используются обозначения аналогично фигуре 2.

На Фигуре 5 показана схема получения плазмид p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain. Обозначения: сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, названия использованных эндонуклеаз рестрикции указаны курсивом.

На Фигуре 6 показана электрофореграмма препаратов ФСГ, полученных после хроматографической очистки ФСГ из кондиционированной культуральной среды при помощи сорбентов Capto ММС и Blue Sepharose. Обозначения: М - маркер, ММС1, ММС2, ММС3-элюаты с колонки CaptoMMC (первая, вторая и третья порции соответственно), BS_FF - проскок с колонки Blue Sepharose (первая порция), BS_EL - элюат с колонки Blue Sepharose (первая порция). +DTT - пробы с добавленным DTT, прогретые 3 мин 75°С, -DTT - пробы без прогрева и добавления DTT.

Молекулярная масса полос маркера указана в кДа, положение гетеродимера ФСГ и мономеров цепей указаны звездочками.

На Фигуре 7 показана зависимость веса яичников крыс от дозы введеного п/к исследуемого препарата ФСГ. Размер групп - 5 особей, по 1 инъекции в день в течение трех дней, контрольная группа получала инъекции физиологического раствора, объем инъецированных растворов одинаков во всех группах (300 мкл/животное).

Практическая применимость настоящего изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Дизайн, получение и верификация последовательности ДНК конструкций, кодирующих альфа- и бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека pUC57-Kan-AIB и pUC57-Kan-BIA

Для расчета синтетической ДНК, кодирующей ОРС цепей ФСГ, были использованы природные последовательности гена, в силу того что по имеющимся литературным данным оптимизация кодонов и другие манипуляции с кодирующей последовательностью могут приводить к снижению уровней экспрессии целевых генов http://www.freepatentsonline.com/y2012/0034655. html.

В качестве источника последовательности природного гена использованы данные из публичной базы данных GenBank. Для ОРС бета-субъединицы - NM_000510.2 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/66528900) (приведенные варианты транскрипции кодируют одинаковую рамку считывания), для ОРС аль фа-субъединицы - NM_000735.3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000735.3 (использовали транскрипционный вариант 2, имеющий длину, совпадающую с указанной для фоллитропина альфа).

Фрагменты ДНК, кодирующие цепи альфа- и бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека, а также содержащие между ОРС субъединиц внутренний сайт связывания рибосом вируса EMCV (IRES), были синтезированы по заказу (Genscript, США). Были созданы два варианта сборки синтетического гена - «альфа-цепь ФСГ-IRES-бета-цепь ФСГ» («AIB») и «бета-цепь ФСГ-IRES-альфа-цепь ФСГ» («BIA»), фланкированные адапторными сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции, для последующего субклонирования.

Для получения плазмиды pUC57-Kan-FSH-AIB синтетический фрагмент FSH-AIB (Genscript, США) был клонирован в плазмиду pUC57-Kan (GENEWIZ, Inc., США).

Для получения плазмиды pUC57-Kan-FSH-BIA синтетический фрагмент FSH-BIA (Genscript, США) был клонирован в плазмиду pUC57-Kan (GENEWIZ, Inc., США).

Конструкции, содержащие ОРС цепей в плазмидном векторе pUC57-Kan, были трансформированы в клетки Top10 (F^-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801acZΔM15 ΔlacZX15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galUgalKrpsL (Str^R) endA1 nupG) (Invitrogen, Великобритания). Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°С на 60 секунд и инкубировали на льду 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 250 мМ KCl, 10 мМ MgC₂) и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-агар (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 18 г/л агара), содержащей канамицин в концентрации 30 мкг/мл, и помещали в термостат на 37°С на 18 часов. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением канамицина в концентрации 30 мкг/мл, наращивали 18 часов при 37°С и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов "WizardPlusSVMinipreps" («Promega», США) по протоколу производителя. Полностью секвенировали области вставки полученных плазмид с праймеров M13f и M13rev (SEQ ID NO:13 и 14) с использованием набора BigDye® Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (AppliedBiosystems, США) и капиллярного секвенатора ABI PRISM 3730 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems, США), анализ данных вели при помощи программы Chromas 1.45 (Technelysium Pty Ltd, Australia).

Полученные плазмиды, содержащие гены цепей альфа и бета фолликулостимулирующего гормона человека и сайт внутренней инициации трансляции EMCV, использовали для получения экспрессионных конструкций.

Пример 2. Создание экспрессионных конструкций p1.1-FSH-AIB и p1.1-FSH-BIA, кодирующих альфа- и бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека

На базе плазмидного вектора p1.1, описанного в российской патентной заявке 2011146243 (Фиг.3, SEQ ID NO:5), созданы экспрессионные конструкции для трицистронной экспрессии генов альфа- и бета-субъединиц фолликулостимулирующего гормона человека и ОРС дигидрофолатредуктазы мыши. Схема клонирования плазмиды p1.1-FSH-AIB приведена на Фиг.5. Плазмида p1.1-FSH-BIA была получена аналогичным способом.

Плазмиды pUC57-Kan-FSH-AIB и pUC57-Kan-FSH-BIA расщепляли эндонуклеазами AbsI («СибЭнзим», Россия) и NheI (Fermentas, Литва) и переносили фрагменты, содержащие ОРС обеих цепей ФСГ, интактный IRES EMCV и участок консенсусной последовательности Козак, в вектор p1.1, рестрицированный теми же эндонуклеазами, с образованием плазмид p1.1-FSH-AIB и p1.1-FSH-BIA.

Рестрикцию проводили по инструкции производителя ферментов. Продукты рестрикции смешивали в соотношении 5:1 с буфером для нанесения «6х Loading dye» («Fermentas», Литва) и проводили разделение в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, визуализированную при помощи УФ-лампы, вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл, после чего проводили выделение ДНК набором реактивов "Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) согласно протоколу производителя. Лигирование очищенных фрагментов проводили ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва) по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали, как описано в Примере 1, клетки Е.coli штамма Тор 10 (Invitrogen, Великобритания) и высевали на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-arap (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 18 г/л агара), содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещали в термостат на 37°С на 18 часов.

Отбор клонов Е.coli проводился методом ПЦР с клонов с использованием праймеров SQ-FA-R (SEQ ID NO:6), SQ-FB-R (SEQ ID NO:7), SQ-FB-F (SEQ ID NO:8), SQ-FA-F (SEQ ID NO:9). ПЦР с колоний Е.coli проводили с использованием набора реактивов «ScreenMix-HS» (ЗАО Евроген, Россия), по методике производителя, помещая образцы бактериальных клонов в пробирки с 10 мкл готовой смеси для ПЦР. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, позитивные клоны наращивали в 5 мл среды LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл 18 часов при 37°С и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов "WizardPlusSVMinipreps" («Promega», США) по протоколу производителя.

Области открытых рамок цепей ФСГ в полученной плазмиде p1.1-FSH-AIB были полностью отсеквенированы, как описано выше, с использованием праймеров SQ-FA-R (SEQ ID NO:6), SQ-FB-R (SEQ ID NO:7), SQ-FB-F (SEQ ID NO:8), SQ-FA-F(SEQ ID NO:9), 5CH6-F (SEQ ID NO:10), мутации в кодирующих областях не выявлены.

Полученная экспрессионная конструкция для трицистронной экспрессии цепей альфа и бета фолликулостимулирующего гормона человека и ОРС дигидрофолатредуктазы мыши p1.1-FSH-AIB имеет размер 13222 п.о. и содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции NheI (I), AgeI (2396), AscI (5464), PvuI (6857), BstBI (11863), AbsI (11894), XbaI (12080).

Области открытых рамок цепей ФСГ в полученной плазмиде p1.1-FSH-BIA были также полностью отсеквенированы, мутации в кодирующих областях не выявлены.

Данные конструкции предназначены для трансфекции эукариотических клеток генами альфа- и бета-субъединиц фолликулостимулирующего гормона человека с последующим отбором и амплификацией по сцепленному признаку DHFR⁺. Она сообщает клеткам-реципиентам следующие фенотипические признаки: при трансформации прокариот - устойчивость к ампициллину, карбенициллину; при трансфекции эукариот - устойчивость к отсутствию гипоксантина и тимидина, ограниченная устойчивость к метотрексату, увеличивающаяся при селективном отборе, экспрессия рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека. Созданные генетические конструкции использовали для получения линии клеток - продуцента ФСГ.

Пример 3. Создание экспрессионной конструкции p1.2-Hygro-FSH-B-chain, кодирующей бета-субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека.

На базе плазмидного вектора p1.2-Hygro (рис.4, SEQ ID NO:11) для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих создана экспрессионная конструкция для моноцистронной экспрессии индивидуальной цепи бета-субъединицы в векторе, содержащем ген устойчивости к антибиотику гигромицину. Схема клонирования приведена на Фиг.5.

Плазмиду pUC57-Kan-FSH-BIA расщепляли эндонуклеазами AbsI и SpeI («СибЭнзим», Россия) и переносили фрагмент, содержащий ОРС бета-субъединицы ФСГ и участок консенсусной последовательности Козак, в вектор p1.2-Hygro, рестрицированный эндонуклеазами AbsI («СибЭнзим», Россия) и NheI (Fermentas, Литва), с образованием плазмиды p1.2-Hygro-FSH-B-chain.

Рестрикцию проводили по инструкции производителя ферментов. Продукты рестрикции выделяли из 1% агарозного геля, как описано в Примере 1, набором реактивов "Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя. Лигирование очищенных фрагментов проводили ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва) по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали, как описано в Примере 1, клетки Е.coli штамма Тор10 (Invitrogen, Великобритания) и высевали на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-arap (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 18 г/л агара), содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещали в термостат на 37°С на 18 часов. Отбор клонов Е.coli вели методом ПЦР с клонов с использованием праймеров SQ-FB-R, SQ-FB-F (SEQ ID NO:7-8) и набора реактивов «ScreenMix-HS» (ЗАО Евроген, Россия), по методике производителя, помещая образцы бактериальных клонов в пробирки с 10 мкл готовой смеси для ПЦР, с последующим электрофорезом в 1% агарозном геле. Позитивные клоны наращивали в 5 мл среды LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл 18 часов при 37°С и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов "Wizard® Plus SV Minipreps" («Promega», США) по протоколу производителя. Область открытой рамки бета-цепи ФСГ полученной плазмиды была полностью отсеквенирована, как описано выше, с использованием праймеров SQ-FB-R (SEQ ID NO:7), SQ-FB-F (SEQ ID NO:8), 5CH6-F (SEQ ID NO:10), 3CH1-R (SEQ ID NO:12), мутаций не выявлено.

Полученная экспрессионная конструкция для моноцистронной экспрессии индивидуальной цепи бета-субъединицы в векторе, содержащем кассету устойчивости к гигромицину p1.2-Hygro-B-chain, имеет размер 12811 п.о. и содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции AgeI (1209), KpnI (4143), NdeI (5120), PsiI (5844), SalI (5962), SwaI (10487), FseI (11171), AbsI (12404). Данная конструкция предназначена для трансфекции эукариотических клеток геном бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека с последующим отбором по признаку hygro⁺. Она сообщает клеткам-реципиентам следующие фенотипические признаки: при трансформации прокариот - устойчивость к ампициллину, карбенициллину; при трансфекции эукариот - устойчивость к гигромицину, экспрессия бета-субъединицы рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека. Созданную генетическую конструкцию использовали для получения линии клеток - продуцента ФСГ. Схематическая карта приведена на Фиг.2.

Пример 4. Препаративное выделение плазмидной ДНК для трансфекций и получение стабильно трансфицированных популяций клеток СНО DG-44/p1.1-FSH-AIB и СНО DG-44/p1.1-FSH-BIA

Плазмидные ДНК для трансфекций нарабатывали в клетках Escherichia coli штамма Top10, трансформированных экспрессионными конструкциями. Клетки культивировали в 50-150 мл среды LB в течение 16 ч и выделяли плазмиды с использованием набора GeneJet™ Midi по протоколу фирмы-производителя (Fermentas, Литва). При получении стабильно трансфицированных линий клеток использовали линеаризованные плазмиды. Плазмиды p1.1-FSH-AIB и p1.1-FSH-BIA расщепляли эндонуклеазой PvuI (Fermentas, Литва). Продукты рестрикции осаждали этанолом, осадки ДНК растворяли в стерильной воде.

Полученным препаратом очищенной плазмиды p1.1-FSH-AIB или p1.1-FSH-BIA были трансфицированы клетки СНО DG-44, содержащие повреждения обоих копий гена дигидрофолатредуктазы и неспособные расти в отсутствие гипоксантина и тимидина. К препарату плазмиды p1.1-FSH-AIB или p1.1-FSH-BIA перед трансфекцией добавляли 5% (по массе) плазмиды pEGFP-N2 (Clontech, США), кодирующей зеленый флуоресцентный белок под контролем эукариотического промотора. Эффективность трансфекций, измеренная как доля флуоресцирующих клеток, составила 6%. Концентрация секретированного ФСГ составила около 35 нг/мл (в предположении удельной активности ФСГ 6 МЕ/мкг). Популяцию транзиентно трансфицированных клеток использовали для определения условий получения стабильно трансфицированных популяций. Для этого проводили культивацию в присутствии 0,2; 0,5; 1 мкМ селекционного агента метотрексата (МТХ). Во всех случаях через 18 дней были получены постоянно делящиеся культуры с жизнеспособностью более 85%, уровни продукции ФСГ приведены в Таблице 1.

Таблица 1 Продуктивность стабильно трансфицированных популяций СНО DG-44 Концентрация метотрексата в среде, мкМ Концентрация ФСГ в среде по ИФА, в МЕ/мл Концентрация ФСГ, мг/л Плотность культуры, тыс. клеток/мл Уровень секреции ФСГ мкг/млн клеток/мл* 0,2 3,6 0,61 955 0,64 0,5 3,2 0,53 535 1,00 1 22,7 3,78 1675 2,25 * - уровень секреции оценен по конечной точке в предположении равной скорости деления клеток.

Также было установлено, что плазмида p1.1-FSH-BIA является нестабильной и модифицируется в клетках путем делеции участка бета-цепи, продукции ФСГ в этом случае не наблюдалось.

Пример 5. Получение первичных поликлональных популяций клеток линии CHO-S, стабильно трансфицированных плазмидой p1.1-FSH-AIB

Клетки линии CHO-S (Invitrogen, Ltd., США), содержащие интактный ген дигидрофолатредуктазы, культивировали в безбелковой среде ProCHO 4 (Lonza, Швейцария) с добавлением 8 мМ L-глутамина (Invitrogen, Ltd., США). Клетки выращивали в стерильных одноразовых колбах Эрленмеера (30 мл суспензии в колбах вместимостью 125 мл) на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа при температуре 37°С. Подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток проводили в счетной камере Горяева при окрашивании трипановым синим. Пассирование культуры проводили по достижении плотности 1,8 млн кл./мл, посевная концентрация 0,3 млн кл./мл. За 48 часов и 24 ч до трансфекции клетки дополнительно пассировали до посевной концентрации 0,5 млн кл./мл.

Трансфекцию линеаризованной плазмиды p1.1-FSH-AIB в клетки CHO-S проводили электропорацией. Для этого 1,5×10⁷ клеток ресуспендировали в 700 мкл трансфекционного буфера Gene Pulser (BioRad). В полученную суспензию добавляли 30 мкг линеаризованной плазмидной ДНК. Трансфекцию проводили в аппарате Gene Pulser Xcell (BioRad) и кювете с зазором между электродами 4 мм одним импульсом длиной 20 мс при постоянном напряжении 200 В. После электротрансформации клетки переносили в 30 мл среды ProCHO 5 (Lonza, Швейцария) в колбе Эрленмеера и растили при перемешивании 48 ч. Эффективность трансфекции, измеренная для контрольной популяции, трансфицированной в тех же условиях смесью плазмид p1.1-FSH-AIB и pEGFP-N2 (95:5 по массе) составила 18%, концентрация ФСГ в среде - 130 нг/мл. После выращивания в неселективной среде в течение 48 ч культуру разделили на три равные порции (по 4×10⁶ клеток) и культивировали раздельно с добавлением различных концентраций селекционного агента метотрексата (0,5 мкМ, 1 мкМ и 2 мкМ).

Вели культивирование в селекционной среде с периодическим пассированием культур в течение 22 дней. Во всех трех случаях были получены делящиеся популяции клеток с жизнеспособностью более 90%, концентрация секретируемого гетеродимера ФСГ приведена в Таблице 2.

Было установлено, что популяция клеток CHO-S, трансфицированных плазмидой p1.1-FSH-AIB и подвергнутых селекции в присутствии 1 мкМ метотрекстата (код популяции C-AIB-1K), обладает максимальной продуктивностью, существенно превосходящей продуктивность известных из уровня техники клональных продуцентов ФСГ. Копийность трансгена, т.е. количество копий экспрессионной плазмиды в гаплоидном геноме продуцентов, для популяции C-AIB-1K составила 50±8 шт. при определении методом количественного ПЦР.

Таблица 2 Продуктивность стабильно трансфицированных популяций CHO-S Концентрация метотрексата в среде, мкМ Концентрация ФСГ в среде по ИФА, в МЕ/мл Концентрация ФСГ, мг/л Плотность культуры, тыс. клеток/мл Уровень секреции ФСГ мкг/млн клеток/мл* 0,5 34,2 5,7 1900 3,00 1 28,3 4,7 935 5,04 2 13,2 2,2 825 2,66 * - уровень секреции оценен по конечной точке в предположении равной скорости деления клеток.

Пример 6. Амплификация целевого гена под действием возрастающих концентраций метотрексата

Амплификацию целевого гена в геноме клеток отобранной поликлональной популяции C-AIB-1K проводили в суспензионной культуре, добавляя в культуральную среду метотрексат в возрастающих концентрациях до момента падения жизнеспособности культуры. При обнаружении падения жизнеспособности культуру вели при постоянной концентрации метотрексата до восстановления жизнеспособности >85%, после чего концентрацию метотрексата удваивали. Процесс амплификации считали законченным, когда жизнеспособность клеток переставала восстанавливаться после 15 суток культивирования. Пассирование проводили, как указано в Примере 5. Ход амплификации и показатели продуктивности культуры приведены в Таблице 3.

Таблица 3 Динамика секреции ФСГ при амплификации целевого гена. Код популяции Концентрация метотрексата, мкМ Время культивирования с указанной концентрацией метотрексата, дней Уровень секреции ФСГ мкг/млн клеток/мл* C-AIB-1K 1 1 5,0 C-AIB-1K 1 15 5,8 C-AIB-2K 2 15 6,8 C-AIB-4K 4 15 8,0 C-AIB-8K 8 15 10,1 * - уровень секреции оценен по конечной точке в предположении равной скорости деления.

Продуктивность клеток была увеличена приблизительно в два раза в результате продолжительного культивирования в присутствии возрастающих концентраций метотрексата.

Пример 7. Получение популяции клеток CHO-S, стабильно трансфицированных плазмидами p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-FSH-B-chain

Для кондиционированной культуральной среды, полученной от популяции клеток C-AIB-8K, определяли относительный уровень секреции цепей ФСГ при помощи иммуноблоттинга с моноклональными антителами к обеим цепям (данные не приводятся). Установили, что бета-цепь ФСГ присутствует в культуральной среде только в составе гетеродимера, а альфа-цепь распределена между гетеродимером и свободным мономером, при этом большая часть альфа-цепи присутствует в культуральной среде в виде мономера. Предположили, что эффективность трансляции области открытой рамки считывания бета-субъединицы в плазмиде p1.1-FSH-AIB снижена относительно области открытой рамки считывания альфа-субъединицы, то есть эффективность реинициации трансляции EMCV IRES дикого типа для открытой рамки считывания бета-цепи ФСГ ниже 100%. Для компенсации недостаточного уровня экспрессии бета-цепи в популяции C-AIB-8K в клетки ввели дополнительный ген бета-цепи ФСГ, кодируемый плазмидой p1.2-Hygro-FSH-B-chain. Трансфекцию проводили, как указано в Примере 5. p1.2-Hygro-FSH-B-chain расщепляли эндонуклеазой CciI (СибЭнзим, Россия) по протоколу производителя фермента. Эффективность трансфекции составила 25%, через 48 ч после трансфекции изменений в уровне секреции гетеродимера ФСГ не наблюдалось.

Через 48 часов к культуре добавили селекционный антибиотик гигромицин В (Invitrogen, Ltd., США) в концентрации 750 мкг/мл, концентрацию метотрексата на весь период селекции гигромицином сохраняли на уровне 8 мкМ. Пассирования культуры проводили по достижении плотности 1,2 тыс. кл./мл, но не позднее чем через пять суток после начала культивации. Через 24 дня после трансфекции была получена стабильная культура с долей живых клеток 82%, после чего концентрация гигромицина была понижена до нетоксичной - 250 мкг/мл. Продуктивность клеток в полученной популяции C-AIB-8K-Bch составила 23,5 мкг/млн кл./мл. Максимальная концентрация секретированного ФСГ для популяции C-AIB-8K-Bch составила 81 мкг/мл при культивировании в течение 12 дней без пересева, удельная продуктивность - 4,7 пг/клетка/день, время удвоения культуры - 31 ч. Видимое при иммуноблоттинге распределение цепей ФСГ между мономером и гетеродимером осталось без изменений, но наблюдаемая доля альфа-цепи в составе мономера уменьшилась (данные не приводятся).

Таким образом, в результате введения дополнительных копий гена бета-цепи ФСГ общая продуктивность клеток была удвоена, при этом общий уровень экспрессии альфа-цепи ФСГ продолжал превышать уровень экспрессии бета-цепи. Полученная поликлональная популяция была использована для получения клональных линий-продуцентов ФСГ.

Пример 8. Получение клональной линии-продуцента ФСГ человека C-P1.3-FSH-G4

Перед клонированием клетки популяции C-AIB-8K-Bch культивировали в течение 6 дней без метотрексата и гигромицина, а также пересевали за 48 и 24 часа до рассева в лунки планшетов. Клонирование осуществляли методом предельных разведений (0,5 клетки на лунку) в 96-луночных планшетах, по 200 мкл среды на лунку в культуральной среде EXCELL-CHO (Sigma), с добавлением 8 мМ глутамина, 2 мМ гипоксантина (Gibco) и 2 мМ тимидина (Gibco) при 37°С, 5% СО₂. Планшеты инкубировали в течение 20 дней, после чего отмечали лунки с единственными колониями и продолжали инкубацию в течение еще 4 дней. Эффективность клонирования составила 29%, было получено и проанализировано 330 моноклональных колоний в 12 культуральных 96-луночных планшетах. Отобранные клоны с максимальной продуктивностью были переведены на культивирование в среде Lonza 5 и последовательно пересеяны в лунки 48-, 24-, 6-луночных планшетов. В результате культивирования отобранных клонов в суспензионных условиях с перемешиванием культуры были отобраны 8 клонов с продуктивностью от 13 до 36 мкг ФСГ/млн клеток/мл и временем удвоения не более 40 ч. Среди них была выбрана основная моноклональная линия C-P1.3-FSH-G4, при культивировании которой в суспензионной культуре в бессывороточной среде Lonza 5 активность фолликулостимулирующего гормона человека составляла 36,5 мкг/мл (по данным ИФА) при концентрации клеток 1,55 млн/мл и времени роста 3 дня, измеренная удельная продуктивность не менее 10 пг/клетка/день.

Пример 9. Выделение целевого белка из супернатанта культуры линии C-P1.3-FSH-G4

Препаративное культивирование линии C-P1.3-FSH-G4 вели в перемешиваемых колбах Эрленмейера с использованием бессывороточной среды Pro CHO 5 с добавлением 8 мМ L-глютамина. Проводили посев культуры на плотности 0,3 млн кл./мл и вели рост культуры в течение 12 дней без смены среды.

Кондиционированную культуральную среду отделяли от клеток и дебриса центрифугированием. Далее рН культуральной жидкости доводили до 5,5 при помощи концентрированной соляной кислоты. Подкисленную культуральную жидкость наносили на уравновешенную колонку с сорбентом Capto MMC (GE Healthcare, США). Колонку промывали раствором 50 мМ натрий-фосфатного буфера рН 5,5 и 100 мМ NaCl и элюировали ФСГ раствором 50 мМ натрий-фосфатного буфера рН 6,0 и 400 мМ NaCl. К элюату добавляли 40% по объему раствора 250 мМ Tris-HCl рН 8,5, полученный нейтрализованный раствор наносили на колонку с сорбентом Blue Sepharose FF (GE Healthcare), колонку промывали раствором, содержащим 0,3 М NaCl. ФСГ элюировали раствором, содержащим 4 М NaCl. Результаты гель-электрофореза фракций элюата и промывки колонок приведены на Фигуре 6. Полученный раствор очищенного рекомбинантного ФСГ обессоливали и концентрировали при помощи ультрафильтрации в ячейке для концентрирования VivaSpin6 (Sartorius, Германия) с мембраной из полиэфирсульфона, порог отсечения 10 кДа. Общий выход продукта составил более 50% (измерение концентрации по ИФА), чистота по денситометрии электрофореграммы не менее 90%. Приведенный метод очистки не включает стадии разделения изоформ ФСГ с различным зарядом N-связанных олигосахаридов, получаемый препарат обогащен щелочными формами, обладающими повышенной активностью в тестах in vitro и пониженной активностью в тестах in vivo.

Пример 10. Измерение биологической активности очищенного рекомбинантного ФСГ

20 неполовозрелых самок крыс WISTAR возрастом в диапазоне 19-28 дней, различающихся по возрасту не более чем на 3 дня и с различиями по массе, не превышающими 10 г между самой крупной и самой легкой особью в каждой группе, были сгруппированы в 4 группы по 5 крыс. В пределах каждой из 4 групп особям были проведены подкожные инъекции растворов, содержащих 0 мкг, 0,11 мкг, 0,22 мкг и 0,44 мкг очищенного ФСГ в физиологическом растворе (все растворы с добавлением 20 ME хорионического гонадотропина человека). Инъекции были повторены в группах через 24 и 48 часов после первой инъекции, всего 3 инъекции. Объем инъекции составлял 300 мкл на особь.

Через 24 ч после последней инъекции, животных подвергли эвтаназии в СО₂-камере, отделяли яичники, удаляли постороннюю жидкость и ткань, после чего немедленно взвешивали по отдельности и попарно от каждой особи. Результаты взвешивания приведены на Фиг.7. Было установлено, что очищенный ФСГ, секретированный полученной линией-продуцентом, вызывал дозозависимый прирост массы яичников крыс, при этом удельная активность полученного препарата очищенного ФСГ, не фракционированного по изоформам заряда, составляла около 7 МЕ/мкг (расчет по методу Steelman-Pohley в сравнении со стандартом рекомбинантного ФСГ, данные для стандарта не приводятся), что сравнимо с удельной активностью известных лекарственных препаратов ФСГ (4-13 МЕ/мкг).

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантного получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека. Конструируют плазмиду для экспрессии в клетках СНО рекомбинантного ФСГ человека, включающую область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотор гена bla, участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональные элементы гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, последовательность Козак; открытые рамки считывания альфа- и бета-субъединиц ФСГ человека с блоками стоп-кодонов; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса EMCV; открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе трицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека. Полученной плазмидой трансформируют клетку СНО с получением клетки-продуцента ФСГ. Клетка-продуцент может быть дополнительно трансформирована плазмидой, экспрессирующей бета-субъединицу ФСГ человека. Изобретение позволяет существенно повысить эффективность продукции ФСГ человека в клетках СНО. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 10 пр.

1. Плазмида для экспрессии в клетках яичника китайского хомячка (СНО) рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, в следующей последовательности по существу состоящая из области начала репликации плазмиды pUC, открытой рамки считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотического промотора гена bla; участка терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функционального промотора и первого интрона гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 5′ нетранслируемой областью этого гена; последовательности Козак; открытой рамки считывания, кодирующей альфа-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; внутреннего сайта связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытой рамки считывания, кодирующей бета-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; аттенюированного внутреннего сайта связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытой рамки считывания дигидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующейся в составе трицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека; и функционального терминатора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 3′ нетранслируемой областью этого гена.

2. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что открытые рамки считывания, кодирующие альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, кодируют альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, последовательности аминокислот которых приведены в SEQ ID NO: 2 и 3 соответственно.

3. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.

4. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что используют открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.

5. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является плазмида p1.1-FSH-AIB, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.

6. Плазмида для экспрессии в клетках яичника китайского хомячка (СНО) бета-субъединицы рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, в следующей последовательности по существу состоящая из области начала репликации плазмиды pUC; открытой рамки считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотического промотора гена bla; участка терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); функционального промотора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 5′ нетранслируемой областью этого гена; последовательности Козак; открытой рамки считывания гена, кодирующего бета-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; функционального терминатора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 3′ нетранслируемой областью этого гена; промотора вируса SV40; гена устойчивости к гигромицину; и функционального терминатора вируса SV40.

7. Плазмида по п. 6, отличающаяся тем, что открытая рамка считывания гена, кодирующего бета-субъединицу ФСГ человека, кодирует бета-субъединицу ФСГ человека, последовательность аминокислот которой приведена в SEQ ID NO: 3.

8. Плазмида по п. 6, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.

9. Плазмида по п. 6, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является pl.2-Hygro FSH-B-chain, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 4.

10. Клетка СНО - продуцент рекомбинантного ФСГ человека, трансформированная плазмидой по пп. 1-5.

11. Клетка по п. 10, дополнительно трансформированная плазмидой по пп. 6-9.

12. Клетка по п. 11, отличающаяся тем, что указанной клеткой является клетка линии яичника китайского хомячка C-P1.3-FSH-G4, депонированная во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-140.

13. Способ получения рекомбинантного ФСГ человека, включающий следующие стадии:
- культивирование в питательной среде клеток линии по п. 10 или 11; и
- выделение полученного рекомбинантного белка из культуральной жидкости.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что культивируют клетки линии яичника китайского хомячка C-P1.3-FSH-G4, депонированные во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-140.

15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что питательная среда для культивирования является бессывороточной.