СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА Bg12p, ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ ГОМОЛОГОМ АНТИГЕНА-МАРКЕРА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОЗОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2015 года по МПК C12P21/02 C07K14/395 C12R1/865 

Область техники, к которой относится изобретение

Предлагаемый способ относится к медицине, биохимии, иммунологии и микологии, может быть использован в биотехнологической промышленности при производстве белков-антигенов и касается иммунологической диагностики микозов человека и животных.

Уровень техники

Среди микозов особого внимания заслуживают инвазивные микозы. Кандидозы, аспергиллезы и другие инвазивные грибковые инфекции продолжают оставаться значимыми источниками заболеваемости и смертности среди госпитализированных пациентов во всем мире. Эти заболевания являются причиной значительного увеличения затрат на медицинские нужды, несмотря на большое количество доступных противогрибковых препаратов с различными фармакокинетическими, фармакодинамическими свойствами и спектрами действия (J.R. Perfect. "Fungal diagnosis: how do we do it and can we do better?" Current Medical Research and Opinion. 2013, 29(Suppl4):3-11).

Многие виды диких, сельскохозяйственных и домашних животных являются природным очагом грибковых инфекций, передающихся человеку (J.P. Tewari. "Veterinary Mycology", в книге Veterinary Scince Vol.1, p. 171-226. Издательство EOLSS Publishers Co Ltd, 2010. ISBN: 978-1-84826-768-8).

Например, собаки болеют кандидозами. У 3-летнего самца кокер-спаниеля без выявленных иммунных отклонений был диагностирован системный кандидоз, вызванный грибами рода Candida. При постмортальном гистопатологическом анализе было выявлено поражение лимфатических узлов, предстательной, поджелудочной желез, печени, селезенки и почек (M.R. Brown, C.A. Thompson, F.M. Mohamed. "Systemic candidiasis in an apparently immunocompetent dog." Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2005, 17:272-276).

Известен патент (J.С. Clancy, Т.М.-Н. Nguyen, S. Cheng. "Polynucleotides and polypeptides identified by IVIAT screening and methods of use". Международный патент № WO/2008/109833, 2008), в котором описан способ получения белков-антигенов микозов на основе полинуклеотидов и полипетидов различной длины, отобранных авторами среди хроматин-регулирующих белков и белков клеточной поверхности дрожжей и грибов (EN01, МЕТ6-1, NOT1, BGL2 и др.). Способ основан на использовании технологии гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков и базируется на воспроизводстве последовательности ДНК и белков патогенных дрожжей Candida albicans и грибов Aspergillus fumigatus. Очистка белков-антигенов в предлагаемом методе основана на аффинной хроматографии с использованием Ni-агарозы.

Известна статья (A. Pitarch, A. Jimenez, С. Nombela, С. Gil. "Decoding serological response to Candida cell wall immunome into novel diagnostic, prognostic, and therapeutic candidates for systemic candidiasis by proteomic and bioinformatic analyses". Molecular and Cellular Proteomics. 2006, 5(1): 79-96), в которой был сделан вывод о том, что белок Bgl2p из С. albicans является единственным независимым диагностическим маркером системных кандидозов, вызванных видом С albicans, а также прогностическим маркером клинического исхода течения заболевания.

Известна статья (F. Klebl, W. Tanner. "Molecular cloning of a cell wall exo-beta-1,3-glucanase from Saccharomyces cerevisiae". J Bacteriol. 1989; 171(11):6259-64), описывающая способ получения белка Bgl2p из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, основной стадией очистки в котором является высокоэффективная жидкостная хроматография с последовательным использованием сорбентов для гель-фильтрационной и ионообменной хроматографии. Также в статье приведены данные о гомологичности белка Bgl2p у дрожжей S. cerevisiae, С.albicans, Torulopsis (Candida) glabrata, Pichia (Candida или Meyerozymd) guilliermondii, Saccharomycopsis (Candida или Yarrowio) lipolytica и Kluyveromyces lactis (или Candida sphaerica).

Известна статья (E.E. Bezsonov, M. Groenning, O.V. Galzitskaya и другие. "Amyloidogenic peptides of yeast cell wall glucantransferase Bgl2p as a model for the investigation of its pH-dependent fibril formation". Prion. 2013; 7(2):175-84), в которой описан способ получения белка Bgl2p. Согласно этому способу получение Bgl2 ведут с использованием лабораторного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae DBY 746, который культивируют на жидкой среде YPD с последующим отмыванием клеток дистиллированной водой, фосфатным буфером и разрушением клеток во вновь добавленном фосфатном буфере с помощью стеклянных шариков (Sigma, 0.5 мм) на шейкере, отделением клеточных стенок, с последующими отмывками растворами NaCl и сахарозы, депротенизированием с помощью трипсина, отмывкой от трипсина растворами NaCl и SDS, отмывкой от SDS раствором ацетата натрия, бутанолом и дистиллированной водой. Белок Bgl2p экстрагируют из клеточных стенок в две стадии в дистиллированную воду. Указанный метод целесообразно взять за прототип.

К недостаткам прототипа относится длительность, многостадийность способа, его трудоемкость и низкая экономичность, связанная с высоким расходом реактивов.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является упрощение, ускорение, снижение трудоемкости и повышение экономичности способа получения белка Bgl2p, гомолога антигена-маркера возбудителей микозов человека и животных, для использования в иммунологической диагностике системных микозов человека и животных.

Предлагаемое изобретение является способом получения белка Bgl2p - гомолога антигена, являющегося маркером возбудителей микозов человека и животных. Способ получения белка Bgl2p, гомолога антигена-маркера возбудителей микозов человека и животных был разработан с учетом особенностей этого белка - устойчивости к протеазам и термической обработке и способности прочно нековалентно закрепляться в клеточной стенке. Для получения целевого продукта используют сухие непатогенные коммерческие дрожжи вида Saccharomyces cervisiae, высушенную биомассу которых замачивают в среде культивирования дрожжевых клеток в течение 15-30 минут при 27-33°C для активации метаболизма дрожжей. Затем осаждают клетки центрифугированием, полученный осадок отмывают от питательной среды дистиллированной водой. Центрифугирование дрожжевых клеток проводят при 1500-2500 g в течение 2-5 минут. Под отмывкой осадка здесь и далее подразумевается ресуспендирование осадка в дистиллированной воде или в соответствующем растворе с последующим центрифугированием. Отмытые клетки ресуспендируют в дистиллированной воде и замораживают при температуре от -20 до -79°C, после чего клетки размораживают при комнатной температуре. Затем добавляют толуол до его конечной концентрации 1-5% (по объему) в смеси. Проводят автолиз инкубированием полученной смеси на качалке при 120-180 об/мин и температуре 35-45°C в течение 45-90 часов. Затем смесь центрифугируют, отделяют клеточные стенки от супернатанта. Осадок клеточных стенок промывают дистиллированной водой. Центрифугирование клеточных стенок проводят при 2000-10000 g в течение 0,5-5 минут. Полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и обрабатывают ультразвуком с частотой 20-30 килогерц с мощностью 30-50 ватт с охлаждением на льду в течение 2-5 минут с промежутком 30 секунд каждые 20-40 секунд. Важно не допускать нагревания суспензии клеточных стенок при обработке ультразвуком выше 25°C, чтобы предотвратить потерю целевого белка. Далее клеточные стенки осаждают центрифугированием, последовательно отмывают при комнатной температуре в растворах 0,1-1% Тритона Х-100 (один раз), 0,2-1М NaCl (три раза), 1-2% сахарозы (один раз) и дистиллированной водой (три раза). Целевой белок экстрагируют из клеточных стенок нагреванием в дистиллированной воде при 70-100°C в течение 5-15 минут, после чего двукратным центрифугированием при 3000-10000 g по 2-10 минут отделяют супернатант, содержащий целевой белок, от осадка клеточных стенок.

Технический результат

Поставленная задача заключается в упрощении, ускорении и повышении экономичности по сравнению с прототипом и достигнута с помощью вышеописанного способа.

Получен электрофоретически гомогенный белок с выходом 75-100 мкг/г сухих дрожжей и степенью чистоты не менее 95%.

По сравнению с прототипом в предлагаемом способе отсутствуют стадии выращивания дрожжей и трипсинолиза с последующими процедурами удаления следов трипсина путем обработки растворами NaCl и SDS, а также отмывкой от SDS раствором ацетата натрия и бутанолом, а трудоемкая стадия получения клеточных стенок с помощью стеклянных шариков успешно заменена на автолиз.

Благодаря этому за один цикл получения белка - в среднем 3 человекодня (2 дня автолиз, 1 день отмывки и экстракция белка) - можно обработать большое количество исходного материала и получить на выходе более 10 мг электрофоретически гомогенного белка при минимальных затратах реагентов и амортизации оборудования, в то время как при работе по методу прототипа за 4 человекодня (2 дня выращивание биомассы дрожжей, 1 день получение клеточных стенок, 1 день отмывки и экстракция белка) нельзя получить более 1 мг белка в силу технических ограничений метода разрушения клеток.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Дорожка 1. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях белкового экстракта, полученного по предлагаемому способу. Гель окрашен красителем Coomassie G-250. Дорожка 2. Вестерн-блот анализ с антителами к Bgl2p, который был выделен нами методом, описанным в прототипе. Стрелками отмечено местоположение белка Bgl2p. *кДа - килодальтон - размерность для обозначения молекулярных масс белков. Числа между дрожками 1 и 2 соответствуют молекулярной массе белковых маркеров.

На Фиг. 1, дорожка 1, видно, что в экстракте, полученном предлагаемым способом, методом электрофореза в полиакриламидном геле обнаруживается один мажорный белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе 33,5 кДа, что совпадает с молекулярной массой Bgl2p. На дорожке 2 видно, что этот белок окрашивается антителами, полученными к белку Bgl2p, выделенному способом, описанным в прототипе. Данные материалы демонстрируют получение очищенного белка Bgl2p (степень чистоты не менее 95%) предложенным способом.

Примеры реализации изобретения

Пример 1. Взвешивают 0,5 г сухих коммерческих дрожжей вида Saccharomyces cervisiae, замачивают в 10 мл среды культивирования дрожжевых клеток и инкубируют в течение 30 минут при 27°C. Затем осаждают клетки центрифугированием (5 минут при 1500 g) и промывают осадок дистиллированной водой. Отмытые клетки ресуспендируют в 25 мл дистиллированной воды, замораживают при температуре от -79°C, размораживают при комнатной температуре, добавляют толуол до конечной концентрации 1%. Смесь инкубируют на качалке при 120 об/мин и температуре 35°C в течение 90 часов. Затем центрифугированием (0,5 минут при 10000 g) получают осадок клеточных стенок, который промывают дистиллированной водой. Осадок ресуспендируют в 20 мл дистиллированной воды и обрабатывают ультразвуком с частотой 20 килогерц с мощностью 30 ватт в течение 5 минут с промежутком 30 секунд каждые 20 секунд. Клеточные стенки осаждают центрифугированием, последовательно отмывают при комнатной температуре в растворах 0,1% Тритона Х-100 (один раз), 0,2М NaCl (три раза), 1% сахарозы (один раз) и дистиллированной водой (три раза). Белок экстрагируют из клеточных стенок нагреванием в дистиллированной воде при 90°C в течение 10 минут, после чего двукратным центрифугированием при 10000 g по 2 минуты отделяют супернатант, содержащий целевой белок, от осадка клеточных стенок. Выход белка Bgl2p составляет 87 мкг на грамм сухих дрожжей.

Пример 2. Берут 0,5 г сухих дрожжей марки «Dr. Oetker» (производитель Dr. August Oetker Nahrungsmittel KG, Германия). Для осаждения клеточных стенок центрифугирование проводят в течение 5 минут при 2000 g. Ультразвуком с частотой 30 килогерц с мощностью 50 ватт обрабатывают в течение 2 минут с промежутком 30 секунд каждые 40 секунд. Все остальные стадии проводят, как в примере 1. Выход белка Bgl2p составляет 101 мкг на грамм сухих дрожжей.

Пример 3. Клетки замачивают в среде культивирования в течение 15 минут при 33°C. Центрифугируют клетки при 2500 g в течение 2 минут. Замораживают клетки при -20°C. Из очищенных клеточных стенок белок экстрагируют нагреванием в дистиллированной воде при 100°C в течение 5 минут. Все остальные стадии проводят, как в примере 1. Выход белка Bgl2p составляет 83 мкг на грамм сухих дрожжей.

Пример 4. Отмывают клеточные стенки после ультразвука при комнатной температуре в растворах 1% Тритона Х-100 (один раз), 1М NaCl (три раза), 2% сахарозы (один раз) и дистиллированной водой (три раза). Экстрагируют белок нагреванием в дистиллированной воде при 70°C в течение 15 минут, после чего двукратным центрифугированием при 3000 g по 10 минут отделяют супернатант, содержащий целевой белок, от осадка клеточных стенок. Все остальные стадии проводят, как в примере 2. Выход белка Bgl2p составляет 73 мкг на грамм сухих дрожжей.

Пример 5. Взвешивают 5 г сухих коммерческих дрожжей марки «Каждый день» (производитель ООО «Распак», Россия) и замачивают в 15 мл среды культивирования дрожжевых клеток. Последующие стадии проводят, как в примере 3. Конечная концентрация толуола составляет 5%. Смесь с толуолом инкубируют при 180 об/мин и температуре 45°C в течение 45 часов. Все остальные стадии проводят, как описано в примере 3. Выход белка Bgl2p составляет 80 мкг на грамм сухих дрожжей.

Пример 6. Клетки замачивают в среде для культивирования дрожжей при 30°C. Конечная концентрация толуола составляет 2%. Смесь с толуолом инкубируют при 150 об/мин и температуре 37°C в течение 70 часов. Все остальные стадии проводят, как в примере 1. Выход белка Bgl2p составляет 92 мкг на грамм сухих дрожжей.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения белка Bgl2p - гомолога антигена-маркера возбудителей микозов человека и животных. Высушенную биомассу коммерческих дрожжей Saccharomyces cerevisiae замачивают в среде культивирования в течение 15-30 минут при 27-33°C. Затем осаждают клетки центрифугированием в течение 2-5 минут при 1500-2500 g и при комнатной температуре. Полученный осадок отмывают в тех же условиях дистиллированной водой. Отмытые клетки ресуспендируют в дистиллированной воде и замораживают при температуре от -20 до -79°C. После чего клетки размораживают при комнатной температуре. Добавляют толуол до конечной концентрации 1-5%. Полученную смесь инкубируют на качалке при 120-180 об/мин и температуре 35-45°C в течение 45-90 часов. Затем смесь центрифугируют, получают осадок клеточных стенок, который промывают дистиллированной водой и повторно центрифугируют в течение 0,5-5 минут при 2000-10000 g. Полученный осадок повторно ресуспендируют в дистиллированной воде и обрабатывают ультразвуком с частотой 20-30 килогерц с мощностью 30-50 ватт с охлаждением на льду в течение 2-5 минут с промежутком 30 секунд каждые 20-40 секунд. Далее клеточные стенки осаждают центрифугированием при 2000-10000 g. Проводят промывки осадка ресуспендированием и последующим центрифугированием при комнатной температуре в растворе 0,1-1% Тритона Х-100 один раз, в растворе 0,2-1М NaCl три раза, в 1-2% растворе сахарозы один раз и три раза дистиллированной водой. Целевой продукт экстрагируют из клеточных стенок в дистиллированную воду при нагревании до 70-100°C в течение 5-15 минут. После чего двукратным центрифугированием при 3000-10000 g пo 2-10 минут отделяют супернатант, содержащий целевой белок. Изобретение позволяет получать белок Bgl2p с выходом 70-100 мкг на грамм сухих дрожжей и степенью чистоты не менее 95 %. 1 ил., 6 пр.

Способ получения белка Bgl2p, являющегося гомологом антигена-маркера возбудителей микозов человека и животных, путем использования дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae, клетки которых получают путем осаждения центрифугированием из среды для культивирования дрожжей, отмыванием от среды дистиллированной водой и последующим получением очищенных клеточных стенок, из которых экстрагируют целевой продукт нагреванием их в дистиллированной воде, отличающийся тем, что для получения целевого продукта используют коммерческие дрожжи того же вида, высушенную биомассу которых замачивают в среде культивирования дрожжевых клеток в течение 15-30 минут при 27-33°C, затем осаждают клетки центрифугированием в течение 2-5 минут при 1500-2500 g и при комнатной температуре, полученный осадок отмывают в тех же условиях дистиллированной водой, отмытые клетки ресуспендируют в дистиллированной воде и замораживают при температуре от -20 до -79°C, после чего клетки размораживают при комнатной температуре, добавляют толуол до его конечной концентрации 1-5%, полученную смесь инкубируют на качалке при 120-180 об/мин и температуре 35-45°C в течение 45-90 часов, затем смесь центрифугируют, получают осадок клеточных стенок, который промывают дистиллированной водой и повторно центрифугируют в течение 0,5-5 минут при 2000-10000 g, полученный осадок повторно ресуспендируют в дистиллированной воде и обрабатывают ультразвуком с частотой 20-30 килогерц с мощностью 30-50 ватт с охлаждением на льду в течение 2-5 минут с промежутком 30 секунд каждые 20-40 секунд, далее клеточные стенки осаждают центрифугированием при тех же значениях g и проводят промывки осадка ресуспендированием и последующим центрифугированием при комнатной температуре в растворе 0,1-1% Тритона Х-100 один раз, в растворе 0,2-1М NaCl три раза, в 1-2% растворе сахарозы один раз и три раза дистиллированной водой, после чего целевой продукт экстрагируют из клеточных стенок в дистиллированную воду при нагревании до 70-100°C в течение 5-15 минут, после чего двукратным центрифугированием при 3000-10000 g по 2-10 минут отделяют супернатант, содержащий целевой белок, от осадка клеточных стенок.