СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ S-ФОСФОЛИПАЗЫ A В ГОМОГЕНАТЕ ПЛАЦЕНТЫ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

1. Цель изобретения - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации повышается активность S-фосфолипазы А₂ в гомогенате плаценты, что создает угрозу повреждения фетоплацентарного барьера в период гестации.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа диагностики повреждения фетоплацентарного барьера при обострении цитомегаловирусной инфекции, ведущей к увеличению содержания S-фосфолипазы А₂ в гомогенате плаценты.

3. Раскрытие изобретения

S-фосфолипаза А₂ находится большей частью в тромбоцитах, а также в местах воспаления различных органов, особенно в синовиальных оболочках суставов, в миокарде при ишемической болезни [8, 11, 12]. Наличие в фосфолипазах окисленных форм жирных кислот увеличивает активность секреторных фосфолипаз, что предполагает их участие в регуляции вязкости мембран при окислительном стрессе. S-фосфолипаза А₂ принимает участие при различных воспалительных заболеваниях [5, 6]. В большом количестве при воспалительных процессах в организме S-фосфолипаз А₂ можно найти в моноцитах, макрофагах, фибробластах [2, 3, 10]. Активность фермента регулируется интерлейкинами 1 и 6, TNFα, интерфероном-α [4]. Под влиянием S-фосфолипазы А₂ арахидоновая кислота выполняет синтез простаноидов [9], а также может стимулировать экспрессию циклооксигеназы-2 [1]. Окисленные фосфолипиды увеличивают активность S-фосфолипаз А₂ [7].

4. Новая техническая задача

Определяя уровень содержания S-фосфолипазы А₂ в гомогенате плаценты на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции, диагностируют повреждение фетоплацентарного барьера.

5. В доступной литературе аналогов по данному вопросу не отмечено.

6. Осуществление изобретения

6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 20 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз обострения хронической цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к ЦМВ.

6.2. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.3. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.4. S-фосфолипаза А₂ выявлялась в гомогенате плаценты методом иммуноферментного анализа на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием набора Cayman Chemical sPLA₂ (human Type II A) EIA.

6.5. Для получения гомогената плодовая часть плаценты (ворсинчатый хорион) срезалась скальпелем небольшими пластинками площадью до 2-3 см и толщиной 1 мм. Кусочки ткани помещали в химические стаканы, содержащие 200 мл физиологического раствора, отмывали от клеток крови, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 мин и подсушивали на фильтровальной бумаге. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли физиологический раствор в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл физиологического раствора). Гомогенат замораживали при -20°С в течение суток. Затем его размораживали и центрифугировали при 1500 g при температуре +4°С в течение 15 минут. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения иммуноферментного анализа.

7. На гистологических срезах плаценты подсчитывали количество ядер в синцитиотрофобласте, находящихся в состоянии апоптоза с помощью иммуногистохимического ISEL-метода. Морфологическая классификация апоптоза на парафиновых срезах проводилась по метке концов фрагментов ДНК (in situ end labeling metod, ISEL) с инкубацией в смеси 4 нуклеотидов dATF, dGTF, dCTF biotin II dUTP, ДНК полимераза - E.Coli («Sigma», USA).

8. Статистическая обработка проводилась непарным параметрическим критерием Стьюдента и методом Фишера.

В процессе исследования установлено, что обострение хронической цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации связано с нарастанием в гомогенате плаценты S-фосфолипазы А².

При нарастании в гомогенате плаценты S-фосфолипазы А₂ до 12,0±0,95 нг/мл (контроль 9,6±0,85 нг/мл) отмечается у беременной на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 к цитомегаловирусу, что приводит к увеличению содержания ядер в состоянии апоптоза до 3,0±0,15% (контроль - 0,5±0,02%).

Литература

1. Aarsman A., Neys F. Sera of patients suffering from inflammatory diseases contain group II A but not group V phospholipase A₂ // Biochem Biophys. Acta. 2000. 1502; 257-263.

2. Altken M.A., Thomas T. Localization of type II phospholipase A₂ messenger RNA and immunoactivity in human placenta and fetal membranes//Placenta. 1999. 17(7). 423-439.

3. Aviram M., Maori Phospholipase A₂ - modified LDL is taken up at enhanced rate by macrophages // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. 185(1). 465-472.

4. Blascucei L.M., Vitelli A. Elevated, levels of interleukin-6 in unstable angina // Circulation. 1997. 96. 2099.

5. Boyanovsky В., Webb N.R. Biology of secretory Phospholipase A₂ // Cardiovasc. Drugs. Ther. 2009. 23. 61-72.

6. Burk J.E., Dennis E.A. Phospholioase A₂ Bichemistry. Cardiovase. Drugs Ther. 2009. 23. 49-59.

7. Chai Y.C., Binion D.G. Relationship of molecular structure to the mechanism of lysophospholipid-induced smooth muscule cell proliferation // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2000. 279. H1830-38.

8. Elinder L.S., Dumitrescu A. Expression of phospholipase A₂ isoforms in human normal and atherosclerotic arterial wall // Ateriscler. Thromb. Vase Biol. 1997. 17.2257-2263.

9. Fonteh A.N., Bass D.A., Marshall L.A. Evidence that secretory phospholipase A2 plays a role in arachidonic acid release and eicosanoid biosynthesis by mast cells // J. Immunol. 1994. 152(11). 5438-5446.

10. Jacobson P.S., Schrier D.J. Regulation of CD-I ib/CD18 expression in human neutrophils by phospholipase A₂ // J. Immunol. 1993. 151. 5639-5652.

11. Menshikowski M., Hagelgans A., Siegert G. Secretory phospholipase A₂ of II A is it an offensive or a defensive player during atherosclerosis other inflammatory diseases? // Prostaglandins. Other Lipid Medial. 2006. 79(1-2). 1-33.

12. Piek J., Winter R. Type II secretory phospholipase A₂. The emerging role of biochemical markers of plaque inflammation // J. Eur Heart 2002. 24. 1804-1806.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы повреждения фетоплацентарного барьера при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации. Для этого в периферической крови определяют титр антител к цитомегаловирусу, содержание в гомогенате плаценты иммуноферментным методом содержание S-фосфолипазы А₂ и в синцитиотрофобласте количество ядер в состоянии апоптоза. При нарастании титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600, содержании в гомогенате плаценты S-фосфолипазы А₂ до 12,0 нг/мл и увеличении числа ядер в синцитиотрофобласте до 3,0% создается угроза повреждения фетоплацентарного барьера ворсинок плаценты. Способ позволяет оценить угрозу повреждения фетоплацентарного барьера при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации за счет нарастания в нем содержания S-фосфолипазы А₂ и увеличении числа ядер в синцитиотрофобласте в состоянии апоптоза.

Способ оценки угрозы повреждения фетоплацентарного барьера при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, включающий определение S-фосфолипазы А₂, титра антител к цитомегаловирусу, процент ядер в синцитиотрофобласте в состоянии апоптоза, и при нарастании титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600, содержании в гомогенате плаценты S-фосфолипазы А₂ до 12,0 нг/мл и увеличении числа ядер в синцитиотрофобласте до 3,0% создается угроза повреждения фетоплацентарного барьера ворсинок плаценты.