СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ГОМОГЕНАТЕ ПЛАЦЕНТЫ БЕРЕМЕННЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ОБОСТРЕНИЕ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/50 

1. Цель исследования - оценить характер влияния цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации на содержание пальмитиновой кислоты в периферической крови и синцитиотрофобласте плаценты, приводящей к увеличению числа ядер в состоянии апоптоза

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа определения повышения содержания пальмитиновой кислоты, способствующей увеличению числа ядер в состоянии апоптоза ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, приводящей к угрозе формирования фетоплацентарной системы и развития плода

3. Раскрытие изобретения

Особая роль жирных кислот принадлежит в процессах, ответственных за формирование различных систем органов, так как они являются основными структурными компонентами клеток, что особенно важно для развивающегося плода [1, 3]. Пальмитиновая кислота, наряду с углеводами, является основным энергетическим соединением, необходимым как для депонирования в тканях, так и в качестве энергетического субстрата для окислительных процессов [7, 13]. При этом пальмитиновая кислота единственная, которую клетки организма синтезируют из ацетата, пирувата, лактата, лейцина и глюкозы при действии мультиферментного комплекса - синтазы жирных кислот [3]. Апоптоз считается жизненно важным компонентом различных процессов, в том числе нормального клеточного цикла, правильного развития и функционирования иммунной системы, эмбрионального развития и химико-индуцированной гибели клеток. Нарушение процесса апоптоза (его активация или угнетение) является фактором развития патологии беременности [2]. Избыток в организме пальмитиновой кислоты инициирует апоптоз в различных типах клеток [8, 11, 12], в том числе в плаценте, что, в свою очередь, нарушает функцию последней.

4. Новая техническая задача

Определение изменения содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови и гомогенате плаценты, свидетельствующее об увеличении числа ядер в состоянии апоптоза при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью оценки угрозы формирования фетоплацентарной системы и развития плода.

5. Прототипом исследования явились работы зарубежных и отечественных авторов, в которых представлены данные об индуцированной гибели клеток, вызванной избыточным содержанием пальмитиновой кислоты в панкреатических клетках [10], гепатоцитах [4, 14], клетках почечных и проксимальных канальцев [9]. Эти данные получены либо в эксперименте (на изолированных клетках, инкубируемых пальмитиновой кислотой), либо при других патологических состояниях вне беременности.

В отличие от вышеописанных прототипов в данном исследовании имеются существенные различия: 1) объектом исследования является периферическая кровь беременной на третьем триместре гестации, 2) изучалось содержание пальмитиновой кислоты в гомогенате плаценты роженицы, 3) в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты подсчитывалось количество ядер в состоянии апоптоза.

6.Осуществление изобретения

6.1. Обследованы 25 пациенток 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 20 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса, IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №226.

6.2. Верификация цитомегаловируса, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами иммуноферментного анализа на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК ЦМВ методами ПНР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.3. Содержание пальмитиновой кислоты в периферической крови у беременной на третьем триместре гестации, а также в гомогенате плаценты рожениц определяли методом газожидкостной хроматографии. Кровь забирают из локтевой вены утром, натощак в пробирку с 0,5 мл антикоагулянта.

6.4. Липиды из периферической крови и гомогената плаценты экстрагировали по методу Folch [6] смесью хлороформ - метанол (2:1). Полученный экстракт упаривали в токе воздуха досуха. К экстракту липидов добавляли порциями 5 мл ацетона и оставляли на ночь при t 3-5°С. Полученный осадок центрифугировали и проводили метилирование жирных кислот [5].

6.5. Полученный метиловый эфир пальмитиновой кислоты анализировали на газовом хроматографе «Кристалл 2000 м» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Обсчет и идентификацию пиков выполняли с помощью программно-аппаратного комплекса Хроматэк Аналитик 2,5 по временам удерживания с использованием стандартов фирмы «Supelco» (США). Количественный расчет хроматограмм проводили методом внутренней нормализации путем определения площадей пиков анализируемых компонентов и их доли (в относительных %) в общей сумме площадей пиков метилированных продуктов высших жирных кислот.

6.6. Количество ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, находящихся в состоянии апоптоза, определяли на парафиновых срезах по метке концов фрагментов ДНК по ISEL-методу (in situ end-labeling). Подсчет проводили на 2000 ядер.

6.7. Статистический анализ и обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistika 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном интервале 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовских распределений применяли непараметрические критерии Колмагорова-Смирнова и Манна-Уитни.

7. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. У беременных, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 отмечается повышение содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови женщин до 30,30±0,27% (контроль - 24,30±0,30%), в гомогенате плаценты до 34,50±0,46% (контроль - 30,10±0,33%) и увеличивается число ядер в состоянии апоптоза в синцитиотрофобласте плаценты до 3,50±0,02% (контроль - 1,20±0,009%). Таким образом, повышение концентрации пальмитиновой кислоты в периферической крови и гомогенате плаценты при нарастании титра антител класса G к ЦМВ 1:1600 указывает на увеличение числа ядер в состоянии апоптоза, приводящего к угрозе формирования фетоплацентарной системы и развития плода.

Литература

1. Захарова И.Н., Суркова Е.Н. Роль полиненасыщенных жирных кислот в формировании здоровья детей // Педиатрия. 2009. Т. 88, №6. С. 84-91.

2. Севрук О.В. Апоптоз - участник патологических процессов в организме человека (обзор литературы) // Репрод. здоровье в Беларуси. 2010. №3. С. 139-151.

3. Сидельникова В.М. Применение омега-3 полиненасыщенных жирных кислот для профилактики и комплексного лечения тромбофилических нарушений при беременности // Рус. мед. журнал. 2008. Т. 16, №6. С. 1-6.

4. Стороженко Г.В., Бабенко Н.А. Влияние пальмитиновой кислоты на содержание кардиолипина и фосфатидной кислоты в изолированных гепатоцитах крыс. Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. 2010. Вып. 11, №905. С. 32-36.

5. Carren J.P., Dubacy J.P-J. Adaptation of a micro-seale metod to the micro-seale for fatty acid methyl trausestenif: cation of biological lipid extracts // Chromatography. 1978. Vol. 151. P. 384-390.

6. Folch J., Lees M., Sloane G.H. A simple metod for the isolation and purification of total lipids from animals tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226. P. 497-509.

7. Herrera Ε. Implications of dietary fatty acid during pregnancy on placental, fetal and postnatal development: a review // Placenta. 2002. №23. P. 9-19.

8. Saturated free fatty acid release and intracellular ceramide generation during apoptosis induction are closely related processes / M. Iturralde, S. Games, J. Pardo [et al.] // Biochem. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1634. P. 40-51.

9. α-Linolenic acid protects renal cells against palmitic acid lipotoxicity via inhibition of endoplasmic reticulum stress / E. Katsoulieris, J. Mabley, M. Samai // Europen Journal of Pharmacology. 2009. №623. З. 107-112.

10. Palmitate induced lipoapoptosis of exocrine pancreas AR42J cell / Z. Landau, E. Forti, M. Alcaly [et al.] // Apoptosis. 2006. Vol. 11(5). P. 717-724.

11. Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome С release in palmitate-induced cardiomyocyte apoptosis / D.B. Ostander, G.C. Sparagna, Amoscato A.A. [et al.] // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 38061-38067.

12. Fatty acid-induced apoptosis in neonatal cardiomycytes: redox signaling / G.C. Sparagna, D.L. Hickson-Bick, L.M. Buja [et al.] // Antioxid. Redox Signal. 2001. Vol. 3, №1. P. 71-79.

13. Springer M., Dordrecht L. Fatty acid-binding protein: fuel metabolism // Molecular and cellular biochemistry. 2007. Vol. 299, №1-2. P. 75-84.

14. Palmitic and linoleic acids induce ER stress and apoptosis in hematoma cell / Y. Zhang, X. Rongliang, Z. Zhang [et al.] // Lipid in Health and Disease. 2012. Vol. 11, №1. P. 145-149.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования фетоплацентарной системы и развития плода на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации. Способ включает определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, газохроматографическое определение содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови беременной и гомогенате плаценты роженицы, подсчет ядер в состоянии апоптоза в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты. При титре антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600, повышении содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови беременной на третьем триместре гестации до 30,30±0,27%, а в гомогенате плаценты роженицы до 34,50±0,46% и увеличении числа ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты в состоянии апоптоза до 3,5±0,02% создается угроза формирования фетоплацентарной системы и развития плода.

Способ оценки угрозы формирования фетоплацентарной системы и развития плода на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, включающий определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, газохроматографическое определение содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови беременной и гомогенате плаценты роженицы, подсчет ядер в состоянии апоптоза в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, и при титре антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600, повышении содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови беременной на третьем триместре гестации до 30,30±0,27%, а в гомогенате плаценты роженицы до 34,50±0,46% и увеличении числа ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты в состоянии апоптоза до 3,5±0,02% создается угроза формирования фетоплацентарной системы и развития плода.