ШТАММ ГРИБА Eremothecium ashbyi - ПРОДУЦЕНТ ЭФИРНОГО МАСЛА, АНАЛОГИЧНОГО БОЛГАРСКОМУ РОЗОВОМУ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/14 C12P1/02 C12P7/64 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для применения в качестве продуцента эфирного масла, аналогичного розовому маслу болгарского происхождения. Целью изобретения является получение нового штамма гриба Eremothecium ashbyi Guill. 810-ssb-III (регистрационный номер ВКМ F-4566D), синтезирующего эфирное масло, близкое к показателям болгарского розового масла, регламентируемого международным стандартом ISO 9842:2003. Штамм Eremothecium ashbyi Guill. 810-ssb-III является мутантом, селекционированным в лаборатории Пензенского государственного университета из популяции штамма Eremothecium ashbyi ВКПМ F-36 (NRRL Y-1363), полученного из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Настоящее изобретение относится к биологически чистой культуре штамма гриба Eremothecium ashbyi Guill. 810-ssb-III, которая может быть использована в качестве продуцента эфирного масла, аналогичного розовому маслу болгарского происхождения.

Болгарское розовое масло является одним из ценнейших масел в мире, широко использующимся в пищевой, фармацевтической, парфюмерно-косметической промышленности [1, 2]. Его выход составляет в среднем 0,025%, так что для получения 1 кг масла приходится собрать вручную и переработать около 4 тонн лепестков. В мире производят розовое масло, соответствующее ISO 9842:2003, всего 4 страны (объем которого в настоящее время около 600 кг/год): Саудовская Аравия (г. Таиф), Болгария (г. Казанлык), Турция (г. Стамбул) и Узбекистан (Ташкентская область) [1, 3, 4]. Его качество существенно зависит от экологических факторов, местности, в которой культивируются эфирномасличные розы, кроме того плантационное выращивание характеризуется сезонностью [1].

Указанные проблемы возможно решить с применением биотехнологических подходов. Следует отметить, что получение розового масла в культуре изолированных растительных клеток и тканей оказалось недостигаемым, поскольку было выявлено, что количество синтезированного масла в клеточной культуре розы на порядок ниже, чем в лепестках интактного растения; при этом состав экстрагируемых масел отличался от розового масла, полученного из растения [5]. Однако в 90-е годы прошлого века была показана возможность получения ароматического продукта с запахом розы на основе штаммов Eremothecium ashbyi Guilliermond 1935 и Е. gossypii Kurtzman 1995 [6-9].

Предлагаемый штамм гриба Eremothecium ashbyi 810-ssb-III новый, в научной и патентной литературе не описан. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являются штамм гриба Eremothecium ashbyi BKM F-3009 - продуцент эфирного масла (А.с. 1454845 СССР) [9]. Однако по сравнению с прототипом при одинаковых условиях культивирования и выделения (экстракция гексаном) предлагаемый штамм отличается более высокой продуктивностью в отношении синтеза эфирного масла и его составом, который более близок к показателям болгарского розового масла, регламентируемого международным стандартом ISO 9842:2003 (табл. 1).

Идентификацию штамма проводили по основным культурально-морфологическим признакам, физиолого-биохимическим свойствам согласно определителю Kurtzman′а [10].

Для проверки чистоты культур был произведен посев коллекционного образца на агар Сабуро и инкубация его в течение 120 часов.

Морфология. Микроорганизм имеет дихотомически ветвящийся септированный мицелий, состоящий из многоядерных клеток; диаметр гиф варьирует в пределах 2,3…17,1 мкм; спорангии продолговатые многоспоровые, конидии веретеновидные; размеры аскоспор 2,4…2,9×19,8…27,1 мкм. На твердой агаризованной среде образует кремовые плоские матовые колонии, которые позднее приобретают ярко-желтое окрашивание и неглубокую радиальную складчатость. Форма колоний округлая, диаметр составляет через 120 часов роста при 29°C на рисовом агаре - 4…5 мм, на агаре Сабуро - 7…12 мм, на картофельно-глюкозном агаре - 8…13 мм.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Оптимальная температура роста 25-28°C. Оптимум рН лежит в диапазоне 5,5…6,5. В качестве источников углерода и энергии использует глюкозу, фруктозу, раффинозу, сахарозу, глицерин, ацетат и цитрат, не усваивает крахмал, целлюлозу, этанол, инозит; коагулирует молоко, слабо разжижает желатин.

Штамм синтезирует эфирное масло, в состав которого входит гераниол (26,5-64,9%), цитронеллол (9,4-27,0%), нерол (2,6-11,9%), β-фенилэтанол (6,8-24,0%), линалоол (0,1-0,4%), гераниаль (0,1-0,2%). Полученный штамм отличается компонентным составом синтезируемого ароматического продукта от исходного штамма Е. ashbyi ВКПМ F-36 и ранее известного штамма Е. ashbyi BKM F-3009 (табл. 2) и по соотношениям главных компонентов более близок к показателям розового масла, регламентируемого международным стандартом ISO 9842:2003.

Условия хранения штамма.

Методы хранения: в пробирках на твердой скошенной агаризованной среде до 1 месяца при температуре 24°C, до 3 месяцев при температуре 5°C, до 5 лет под вазелиновым маслом.

Среды хранения: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар - 18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0).

Среды культивирования:

Твердые: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар -18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; гидроортофосфат калия - 0,0-0,5; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0); рисовый агар (г/л: обезвоженные рисовые хлопья - 20,0; глюкоза - 10,0-20,0; агар-агар - 15,0-20,0);

Жидкие: соево-сахарозная (г/л: соевая мука - 10,0-30,0, сахароза - 10,0-35,0); солодовый бульон с дрожжевым экстрактом (г/л: экстракт солода - 5,0-15,0, мальтоза - 5,0-10,0, дрожжевой экстракт - 0,5-2,0, глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 3,0-10,0, гидроортофосфат калия - 0,0-0,5); глюкозо-пептонная (г/л: глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 2,0-10,0, натрия сукцинат - 1,0-2,5, калия гидроортофосфат - 0,0-1,0, инозит - 0,0-0,5).

Температура и время культивирования: 25-28°C, 7 суток. Частота пересевов: 12 раз в год при хранении при температуре 24°C, 4 раза в год при температуре 5°C, до 5 лет под вазелиновым маслом.

Использование штамма иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Штамм выращивали в течение 6 суток при 28°C в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, воды дистиллированной до 1 л. Для образования и накопления эфирного масла вносили клеточную суспензию в изотоническом растворе, соответствующую стандарту мутности 2, в количестве 1% в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): экстракт солода - 6,0, мальтоза - 6,0, дрожжевой экстракт - 1,2, глюкоза - 13,5, пептон - 4,0, гидроортофосфат калия - 0,5, воды дистиллированной до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (150 об/мин) в течение 67 часов. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта составило 122,9 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас. %: гераниол 64,84, цитронеллол 9,38, нерол 2,55, β-фенилэтанол 6,84, линалоол 0,33, гераниаль 0,10, нераль 0,08.

Пример 2. Штамм выращивали в течение 6 суток при 28°C в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, воды дистиллированной до 1 л. Культуру использовали для получения инокулята. Засев проводили в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): экстракт солода - 6,0, мальтоза - 6,0, дрожжевой экстракт - 1,2, глюкоза - 13,5, пептон - 4,0, гидроортофосфат калия - 0,5, воды дистиллированной до 1 л. Культивировали на качалке при 28°C 72 часа. Для образования и накопления эфирного масла инокулят в количестве 5% вносили в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): соевая мука - 20,0, сахароза - 20,0, воды дистиллированной до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (150 об/мин) в течение 96 часов. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 220,0 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас. %: гераниол 26,43, цитронеллол 26,99, нерол 11,89, β-фенилэтанол 17,41, линалоол 0,08, гераниаль 0,18, нераль 0,03.

Пример 3. Штамм выращивали в течение 24 часов при 28°C в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре. Культуру использовали для получения инокулята. Засев проводили в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза - 7,5, пептон - 4,0, натрия сукцинат - 2,0, калия гидроортофосфат - 0,5, инозит - 0,14, воды дистиллированной до 1 л. Культивировали на качалке при 28°C в течение 24 часов. Для образования и накопления эфирного масла инокулят в количестве 5% вносили в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): соевая мука - 20,0, сахароза - 20,0, воды дистиллированной до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (220 об/мин) в течение 72 часов. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 293,1 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас. %: гераниол 53,16, цитронеллол 12,20, нерол 10,67, β-фенилэтанол 23,97.

Список литературы

1. Kovacheva, N. Industrial cultivation of oil bearing rose and rose oil production in Bulgaria during 21^st century, directions and challenges / N. Kovacheva, K. Rusanov, I. Atanassov // Biotechnol. & Biotechnol. Eq. - 2010. - №2. - P. 1793-1798.

2. Shawl, A.S. Rose oil in Kashimiri India / A.S. Shawl // Perfumer and Flavorist. - 2009. - V. 34. - P. 2-5.

3. Erdogan, G. Turkey rose oil production and marketing: a review on problem and opportunities / G. Erdogan // Journal of Applied Sciences. - 2005. - Vol. 5, №10. - P. 1871-1875.

4. Research and current profile of Iranian production of damask rose {Rosa damascena Mill.) / M. Haghighi, A. Tehranifar, A. Nikbakht, M. Kafi //Acta horticulturae. - 2008. - Vol. 769. - P. 499-455.

5. Егорова, Н.А. Некоторые итоги и перспективы биотехнологических исследований эфиромасличных растений / Н.А. Егорова, И.В. Ставцева // Эфиромасличные растения и лекарственные растения. Научные труды Института эфиромасличных и лекарственных растений Украинской академии аграрных наук. - 2006. - Выпуск 26. - С. 19-26.

6. А.с. 1794948 СССР Штамм гриба Ashbya gossypii - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С., Радзимовская С.Б. (СССР). Заявл. 23.08.90 (заявка №4862283 с датой приоритета изобретения 23.08.1990 г. ). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.10.1992 г. Опубл. 15.02.93, БИ №6.

7. А.с. 1421765 СССР Способ получения смеси душистых веществ, обладающей запахом розы / Бугорский П.С., Семенова Е.Ф., Родов B.C., Миронов В.А. (СССР) Заявл. 22.05.87 (заявка №4246910 с датой приоритета изобретения 22.05.1987 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.05.1988 г. Опубл. 07.09.88, БИ №33.

8. А.с. 1698276 СССР Способ получения ароматического продукта с запахом розы / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С. (СССР). Заявл. 20.07.88 (заявка №4600171 с датой приоритета изобретения 20.07.1988 г. ). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 15.08.1991 г. Опубл. 15.12.91, БИ №46.

9. А.с. 1454845 СССР Штамм гриба Eremothecium ashbyi - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Родов B.C., Бугорский П.С. (СССР) Заявл. 28.07.87 (заявка №4291537 с датой приоритета изобретения 28.07.1987 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 01.10.1988 г. Опубл. 30.01.89, БИ №4.

10. The yeast, a taxonomic study. Ed. by Kurtzman C.P., Fell J. W. Fourth Edition. - Elsevier Science, 1998. - 1055 p.

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Штамм Eremothecium ashbyi Guill. 810-ssb-III является мутантом, селекционирован из популяции штамма Eremothecium ashbyi ВКПМ F-36 (NRRL Y-1363) и депонирован в ВКМ под номером ВКМ F-4566D. Штамм может быть использован в качестве продуцента эфирного масла, аналогичного розовому маслу болгарского происхождения. 2 табл., 3 пр.

Штамм гриба Eremothecium ashbyi BKM F-4566D - продуцент эфирного масла, аналогичного болгарскому розовому.