ШТАММ БАКТЕРИЙ Staphylococcus aureus, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ОТБОРА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СРЕДСТВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/445 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в качестве тест-культуры для отбора антибактериальных средств, пригодных для борьбы с персистирующими патогенными стафилококками.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении штамма, обладающего высокой антилизоцимной активностью.

Указанный технический результат достигнут тем, что получен новый штамм Staphylococcus aureus 113.

Штамм Staphylococcus aureus 113 выделен из области трофической язвы нижних конечностей пациентки отделенческой клинической железнодорожной больницы на станции Оренбург Феоктистовой Е.В., 54 года, в лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистентных свойств микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук.

Полученный штамм Staphylococcus aureus 113 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» и имеет регистрационный номер 1253.

Штамм Staphylococcus aureus 113 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные, неспорообразующие кокки, расположенные скоплениями в виде гроздьев винограда, но могут располагаться одиночно и попарно. Диаметр клеток от 0,5 до 1,5 мкм.

На мясопептонном агаре (37°С, 48 ч) образуют изолированные, непрозрачные кремовые колонии. На желточно-солевом агаре Чистовича (37°С, 24 ч) колонии имеют форму плоских, слегка выпуклых дисков диаметром 2-4 мм с ровными краями; изолированные, непрозрачные, блестящие, маслянистые, вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды, что свидетельствует о лецитиназной активности стафилококков. На молочно-солевом агаре (37°С, 24 ч) образуют непрозрачные круглые колонии, окрашенные в золотистый цвет, диаметром 2-4 мм, слегка выпуклые, блестящие, маслянистые.

В солевом бульоне с 6,5% хлористого натрия (37°С, 24 ч) штамм вызывает диффузное помутнение с последующим выпадением рыхлого хлопьевидного осадка.

Физиолого-биохимические признаки:

Факультативный анаэроб, оптимальные условия для культивирования - атмосферные. Температура культивирования - 37°С, температурный диапазон роста 10-45°С.Растет на средах с содержанием 10% NaCl. На средах вырастает в течение 18-24 ч.

Оптимум рН 7,0-7,5.

Штамм каталазоположительный, оксидазоотрицательный, образует ацетоин. Штамм ферментирует N-ацетил β-D-глюкозамин, галактозу, сукрозу, трегалозу, маннит, мальтозу, маннозу, лактозу, рибозу, фруктозу, арабинозу. Продуцирует ферменты: уреазу, L-аргинин, β-глюкозидазу, фосфатазу. Реакция Фогес-Проскауера положительная.

Устойчивость к новобиоцину - отрицательная.

Штамм коагулирует плазму, обладает лецитовителлазной активностью.

Условия хранения: лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение 2 лет или культура, выращенная в течение суток при 37°С в пробирках с 0,3% МПА (рН 7,2-7,6) и залитых сверху стерильным вазелиновым маслом, в условиях бытового холодильника при температуре 4±2°С в течение 6 месяцев.

Условия и состав среды для размножения - 1,5% МПА, солевой агар, желточно-солевой агар при Т 36-37°С в течение 18-24 ч.

Штамм Staphylococcus aureus 113 идентифицирован по биохимической активности с помощью «STAPHYtest» 24 («Erba Lachema», Чехия) с фотометрической регистрацией результатов на бактериологическом анализаторе iEMS-reader («Labsystems», Финляндия).

Штамм Staphylococcus aureus 113 характеризуется наличием антилизоцимной активности (АЛА), равной 10 мкг/мл.

Наличие и уровень антилизоцимной активности определялся согласно известному способу определения антилизоцимной активности (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1984. №2. С.27).

Суточную культуру S. aureus 113 выращивали на 1,5% мясопептонном агаре (питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой; НПО «Питательные среды», г. Махачкала) при 37°С. Готовили раствор лизоцима (ФАО «Ферейн», г. Москва): делали навеску лизоцима (5 мг), помещали в пробирку и добавляли 5 мл стерильного изотонического (0,85%) раствора хлорида натрия, получая исходную концентрацию лизоцима 1000 мкг/мл. Затем переносили 0,5 мл раствора в другую пробирку и добавляли 9,5 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, что позволяло получить концентрацию лизоцима 50 мкг/мл.

Далее готовили 10 пробирок, в которые вносили от 0,1 до 1,0 мл раствора лизоцима и добавляли физиологический раствор, доводя общий объем до 1 мл (за исключением последней пробирки) и получая концентрацию лизоцима в пробирках от 5 до 50 мкг/мл.

Затем в каждую пробирку добавляли 4 мл остуженного 1,5% питательного агара (разводили лизоцим в 5 раз) и, разлив в чашки Петри, получали концентрацию лизоцима от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. Застывшие чашки подсушивали в термостате в течение 20 мин, и на их поверхность бактериологической петлей засевали исследуемый штамм.

Чашки инкубировали сутки при 37°С, после чего выросшие колонии обрабатывали парами хлороформа в течение 10 мин, с этой целью вкладывали в крышки чашек кусочки бумаги ватман площадью 8-10 см², пропитанные 0,3-0,5 мл хлороформа.

Затем сверху на колонии наслаивали 3-4 мл полужидкого (0,7%) агара, смешанного с 0,1 мл взвеси суточной агаровой индикаторной культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307.

Мутность взвеси соответствовала 10 единицам оптического стандарта мутности (ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

Через сутки инкубации в термостате при температуре 37°С проводили учет результата опыта по наличию роста микрококка на поверхности и вокруг колоний исследуемой культуры, инактивировавшей известную концентрацию лизоцима, внесенного в питательную среду.

В соответствии с указанной методикой за уровень антилизоцимной активности исследуемой культуры приняли максимальное значение концентрации лизоцима в среде, при которой еще наблюдается рост индикаторного штамма микрококка, равное 10 мкг/мл, и установили, что антилизоцимная активность штамма Staphylococcus aureus 113 составила 10 мкг/мл.

Уровень антилизоцимной активности определяется по следующим критериям: 3 мкг/мл и менее - низкий, 4-6 мкг/мл - средний, 7-8 мкг/мл - высокий (Первушина Л.А. Значение антилизоцимной активности микроорганизмов в этиологической диагностике и клинике воспалительных заболеваний внутренних женских половых органов // Персистенция бактерий / Под ред. О.В. Бухарина. Куйбышев, 1990. С. 89-94; Сафронов А.А., Желтова В.И. Значение антилизоцимной активности микроорганизмов в диагностике открытых переломов. Там же. С. 58-61; Кузьмин М.Д. Антилизоцимная активность микрофлоры спермы при мужском бесплодии. Там же. С. 65-69).

Согласно данным критериям новый штамм Staphylococcus aureus 113 обладает высокой антилизоцимной активностью, что позволяет использовать его в качестве тест-культуры для отбора антибактериальных средств, пригодных для борьбы с персистирующими патогенными стафилококками.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Проводили эксперименты по определению наличия и уровня антилизоцимной активности у штамма Staphylococcus aureus 113 и клинических штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от стафилококковых бактерионосителей (штаммы 1-5) и от больных с трофическими язвами нижних конечностей (штаммы 6-11).

Авторами экспериментально установлено, что уровень АЛА Staphylococcus aureus 113 составил 10 мкг/мл, а уровень АЛА клинических штаммов Staphylococcus aureus от 1 до 4 мкг/мл, что свидетельствует о высокой способности заявляемого штамма Staphylococcus aureus ИЗ инактивировать лизоцим по сравнению с изученными клиническими штаммами Staphylococcus aureus.

Результаты исследований приведены в табл. 1.

Пример 2

Staphylococcus aureus 113 использовали как тест-культуру для проведения доклинических испытаний фитосубстанций. Суточную бульонную культуру стафилококка культивировали с изучаемыми фитосубстанциями (1 часть фитосубстанции: 3 части питательного бульона) в течение 1 ч при 37°С, затем определяли АЛА стафилококка. Результаты приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, до 7 мкг/мл снижали антилизоцимную активность стафилококка настойки зверобоя и березы, а также углекислотный экстракт фенхеля; до 6 мкг/мл - экстракты жидкие элеутерококка колючего и расторопши пятнистой, настойки сирени, плодов лимонника, почек тополя; до 5 мкг/мл - настойка полыни; до 4 мкг/мл - настойки родиолы розовой, мелиссы, эхиницеи пурпурной; до 3 мкг/мл - углекислотный экстракт гвоздики.

Углекислотный экстракт аниса не оказывал влияния на антилизоцимную активность стафилококка. Максимально до 0 снижала АЛА S. aureus 113 вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики.

Полученные результаты служат экспериментальным обоснованием целесообразности использования эффективной фитосубстанции (вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики) в клинической практике для борьбы с персистирующими патогенными стафилококками (санация стафилококковых бактерионосителей и терапия хронических инфекционно-воспалительных заболеваний).

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Staphylococcus aureus 113, обладающий антилизоцимной активностью, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под регистрационным номером 1253 и может быть использован для отбора антибактериальных средств, пригодных для эффективной борьбы с персистирующими патогенными стафилококками. Изобретение позволяет повысить эффективность в борьбе с персистирующими патогенными стафилококками. 2 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Staphylococcus aureus, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под регистрационным номером ГКНМ 1253, используемый в качестве тест-культуры для отбора антибактериальных средств.