ШТАММ Staphylococcus xylosus, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИИНТЕРЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/44 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к штамму Staphylococcus xylosus №5/55, который может быть использован в качестве тест-культуры для определения «антиинтерцидной» активности микроорганизмов.

Известно использование штамма Corynebacterium xerosis №181, чувствительного к бактерицидной фракции препарата человеческого лейкоцитарного интерферона, для определения антиинтерфероновой активности бактерий (SU 1564191). Однако производимый в настоящее препарат человеческого лейкоцитарного интерферона не содержит антибактериальную составляющую (Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М., 1999. - С. 94-95), что ограничивает применение данного штамма для определения «антиинтерцидной» активности микроорганизмов.

Задачей настоящего изобретения является поиск штамма бактерий, чувствительного к бактерицидному действию катионного белка лейкоцитов «интерцида».

Новым в заявляемом изобретении является применение штамма Staphylococcus xylosus №5/55, высокочувствительного к бактерицидному действию катионного белка лейкоцитов «интерцида».

Технический результат от реализации изобретения заключается в получении штамма Staphylococcus xylosus №5/55, чувствительного к бактерицидному действию катионного белка лейкоцитов «интерцида».

Штамм Staphylococcus xylosus №5/55 выделен из влагалища женщины с миомой матки при субмукозной локализации миоматозного узла, находившейся на стационарном лечении в гинекологическом отделении в Муниципальном городском клиническом перинатальном центре (г. Оренбург).

Штамм Staphylococcus xylosus №5/55 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под №1254.

Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма

Клетки представляют собой неподвижные грамположительные неспорообразующие кокки, расположенные в мазке единично, в парах и группах скопления неправильной формы, диаметром 0,5-1,5 мкм.

Факультативный анаэроб; оптимальные условия для культивирования - аэробные. Температура культивирования - +30-37°C. Максимальная скорость роста при +35-37°C. В жидких и на плотных питательных средах вырастает в течение 18-24 часов. На желточно-солевом агаре (+37°C, 24-48 часов) штамм образует изолированные непрозрачные колонии кремового цвета диаметром 2-4 мм с ровными краями без радужного венчика, что свидетельствует об отсутствии лецитиназной активности микроорганизмов. В солевом бульоне с 6,5% хлористого натрия штамм вызывает диффузное помутнение среды с выпадением рыхлого хлопьевидного осадка через 48 часов культивирования.

Биохимическая активность штамма определена с помощью STAPHYtest 16 (Lachema, Чехия):

VPT - положительный; Уреаза (URE) - положительный; Аргинин (ARG) - отрицательный; Орнитин (ORN) - отрицательный; β-галактозидаза (GAL) - отрицательный; β-глюкуронидаза (GLR) - положительный; Нитраты (NIT) - положительный; Фосфатаза (PHS) - положительный; Пирролидониламидаза (PYR) - положительный; Эскулин (ESL) - положительный; Сахароза (SUC) - положительный; Трегалоза (TRE) - положительный; Маннитол (MAN) - положительный; Ксилоза (XYL) - положительный; Мальтоза (MLT) - положительный; Манноза (MNS) - положительный; Глюкоза/новобиоцин (GLN) - положительный.

Штамм не обладает плазмокоагулазной, лецитовителлазной и гемолитической активностями, тест на оксидазу - отрицательный, рост с использованием (NH₄)₂SO₄ как источника азота - положительный.

Штамм устойчив к антагонистическому действию золотистых и коагулазоотрицательных стафилококков.

Условия хранения: культура, выращенная в течение суток при 37°C в пробирках с 0,3% ΜΠΑ (pH 7,2-7,6) и залитых сверху стерильным вазелиновым маслом, в условиях бытового холодильника при температуре 4±2°C в течение не менее 6 месяцев или лиофильно высушенная культура при температуре 4±2°C в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60% в течение не менее 2-х лет. В качестве защитной среды для обеспечения длительной консервации при сублимационном высушивании используется сахарозо-желатиновая среда (0,5% сахарозы, 2,0% желатина, дистиллированная вода. Автоклавирование при 1 атмосфере в течение 20 мин).

Сравнительное определение чувствительности штамма Staphylococcus xylosus №5/55 и штамма Corynebacterium xerosis №181 к бактерицидному действию катионного белка лейкоцитов «интерцида» осуществляли при помощи "чашечного" метода.

Ход эксперимента: Готовили 2 серии опытных чашек Петри с 5 мл 1,5% мясопептонного агара (Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой; НПО "Питательные среды", г. Махачкала), содержащего катионный белок лейкоцитов "интерцид" в конечной концентрации 0,3; 0,6; 0,9, 1,2; 1,5 и 1,8 мг/мл.

В работе использовали экспериментальный образец препарата "интерцида" (серия С2), полученный на базе Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова из полуфабриката жидкого человеческого лейкоцитарного интерферона методом селективной ультрафильтрации с применением мембранной технологии и представляющий собой сухой порошок желто-розового цвета, хорошо растворимый в воде. Препарат содержит гистоноподобный термостабильный белок с молекулярным весом 11,0-11,5 кДа, изоэлектрической точкой 10,5-11,0, низким коэффициентом экстинции при 280 нм (Соколов В.Ю. Антиинтерфероновая активность микроорганизмов. Персистенция бактерий. Куйбышев, 1990. С. 92-93).

Контролем служили 2 чашки с 5 мл питательной среды, в которую был добавлен эквивалентный объем стерильной дистиллированной воды без "интерцида".

На поверхность подсушенного агара вторым слоем выливали 3 мл 0,7% мясопептонного агара, содержащего 0,2 мл взвеси суточной агаровой культуры испытуемого штамма Staphylococcus xylosus №5/55 или Corynebacterium xerosis №181, приготовленной в стерильном изотоническом (0,85%) растворе NaCl с концентрацией 5·0⁸ КОЕ/мл. Давали агару затвердеть, помещали чашки в термостат, где их инкубировали при температуре 37°C в течение 18-24 часов, а затем учитывали результаты по наличию роста данного штамма бактерий на поверхности и в толще питательной среды. Концентрацию "интерцида" в среде, на которой культура не росла, принимали за минимально подавляющую концентрацию (МПК).

Для штамма Staphylococcus xylosus №5/55 минимальная подавляющая концентрация (МПК) «интерцида» составляла 0,6 мг/мл, для штамма Corynebacterium xerosis №181 - 1,2 мг/мл, что позволяет сделать вывод о большей чувствительности Staphylococcus xylosus №5/55 к «интерциду» в сравнении с чувствительностью Corynebacterium xerosis №181, а также о возможности использовать штамм Staphylococcus xylosus №5/55 в качестве тест-культуры для определения "антиинтерцидной" активности микроорганизмов.

Пример №1

К 1,5% питательному агару добавили препарат «интерцид» в конечной концентрации 0,6; 0,9; 1,2; 1,5 и 1,8 мг/мл и разлили в чашки Петри. После застывания среды и ее подсушивания на поверхность нанесли петлей в виде отдельных "пятачков" суточные агаровые культуры 12 клинических штаммов Escherichia coli, выделенных из влагалища у женщин с миомой матки и из гнойной раны у больных с синдромом диабетической стопы. Чашки инкубировали 24 часа при 37°C, после чего выросшие колонии бактерий убили парами хлороформа в течение 20-25 мин, а затем на поверхность агара "пятачки" убитых культур вторым слоем залили 3 мл 0,7% питательного агара, содержащего 0,2 мл взвеси суточной агаровой культуры Staphylococcus xylosus №5/55 с концентрацией 5·10⁸ КОЕ/мл. Затем повторно инкубировали чашки 24 часа при 37°C. Учет опыта проводится по наличию роста Staphylococcus xylosus №5/55. Тест-культура вырастала вокруг колоний тех штаммов, которые инактивировали внесенный в питательную среду катионный белок лейкоцитов «интерцид», то есть проявляли «антиинтерцидную» активность. 3 штамма Е.coli инактивировали катионный белок лейкоцитов «интерцид» в концентрации 0,6 мг/мл; 1 штамм - в концентрации 0,9 мг/мл; 1 штамм - в концентрации 1,2 мг/мл; 1 штамм - в концентрации 1,5 мг/мл; остальные 6 штаммов Е.coli не инактивировали бактерицидное действие «интерцида». Таким образом, 6 клинических штаммов Е.coli обладали разным уровнем «антиинтерцидной» активности, а у 6 штаммов Е.coli это свойство не выявлялось.

Пример №2

К 1,5% питательному агару добавили препарат «интерцид» в конечной концентрации 0,6; 0,9; 1,2; 1,5 и 1,8 мг/мл и разлили в чашки Петри. После застывания среды и ее подсушивания на поверхность нанесли петлей в виде отдельных "пятачков" суточные агаровые культуры 16 клинических штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями (гнойная рана при синдроме диабетической стопы, абсцесс и флегмона мягких тканей, гнойный гайморит). Чашки инкубировали 24 часа при 37°C, после чего выросшие колонии бактерий убили парами хлороформа в течение 20-25 мин, а затем на поверхность агара "пятачки" убитых культур вторым слоем залили 3 мл 0,7% питательного агара, содержащего 0,2 мл взвеси суточной агаровой культуры Staphylococcus xylosus №5/55 с концентрацией 5·10⁸ КОЕ/мл. Затем повторно инкубировали чашки 24 часа при 37°C. Учет опыта проводится по наличию роста Staphylococcus xylosus №5/55. Тест-культура вырастала вокруг колоний тех штаммов, которые инактивировали внесенный в питательную среду катионный белок лейкоцитов «интерцид», то есть проявляли «антиинтерцидную» активность. 3 штамма S.aureus нейтрализовали катионный белок лейкоцитов «интерцид» в концентрации 0,6 мг/мл; 2 штамма - в концентрации 0,9 мг/мл; 2 штамма - в концентрации 1,2 мг/мл; 1 штамм - в концентрации 1,5 мг/мл; 1 штамм - в концентрации 1,8 мг/мл; остальные 7 штаммов S.aureus не инактивировали бактерицидное действие «интерцида». Таким образом, 9 клинических штаммов S.aureus обладали разным уровнем «антиинтерцидной» активности, а у 7 штаммов S.aureus это свойство не выявлялось.

Следовательно, предложенный штамм Staphylococcus xylosus №5/55 может быть использован в качестве тест-культуры для определения «антиинтерцидной» активности микроорганизмов.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Staphylococcus xylosus №5/55 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» под регистрационным номером № 1254. Штамм обладает высокой чувствительностью к катионному белку лейкоцитов интерциду и может быть использован для определения антиинтерцидной активности микроорганизмов. Изобретение позволяет инактивировать катионный белок лейкоцитов. 2 пр.

Штамм Staphylococcus xylosus, используемый в качестве тест-культуры для определения антиинтерцидной активности микроорганизмов, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под № 1254.