СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ СТАФИЛОКОККОВ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/02 C12R1/44 C12Q1/14 

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии и может быть использовано для определения и оценки степени выраженности антилизоцимной активности различных видов стафилококков, как одного из факторов персистенции, а также позволяет оценить изменения степени выраженности данного свойства у определенных штаммов под влиянием различных лекарственных и дезинфицирующих средств, зависимость данного свойства от антропогенного воздействия и др.

Известен способ определения антилизоцимной активности (АЛА) микроорганизмов, при котором исследуемые штаммы бактерий засевают на плотную питательную среду с определенной концентрацией лизоцима в агаре и после инкубации при 37°C в течение 24 ч выросшие исследуемые культуры инактивируют парами хлороформа в течение 30 мин. Затем на колонии исследуемых культур вторым слоем заливают питательную агаровую среду с 0,5 мл 20-миллиардной взвеси предварительно убитой хлороформом тест-культуры Micrococcus lysodeikticus (Micrococcus luteus, штамм N 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Эффект инактивации лизоцима определяют по наличию зоны мутности вокруг антилизоцимактивных штаммов. Количественную оценку антилизоцимной активности исследуемого штамма проводят по максимальной концентрации лизоцима в среде, которая инактивируется данным штаммом (Бухарин О.В. и др. // Журнал микробиология. - 1984. - №2. - С. 27-28).

Одним из важнейших недостатков данного метода является визуальная оценка результатов, в силу чего сложно определить четкие зоны лизиса бактерий. Данный способ не позволяет определить точное значение АЛА, что затрудняет сравнительную оценку данного свойства различных штаммов стафилококков. Использование хлороформа требует соблюдения специальных мер безопасности сотрудниками. Воспроизводство этого метода требует наличия специального тест-штамма (N 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича), его получение встречает определенную трудность. Кроме того, недостатками метода являются низкая чувствительность и длительное время, необходимое для определения антилизоцимной активности.

Наиболее близким к заявленному способу является способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов, в том числе и стафилококков, согласно которому исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант и смешивают его с лизоцимом, параллельно готовят контроль, опытную и контрольную пробы смешивают с суспензией тест-культуры Micrococcus lysodeikticus (Micrococcus luteus) и определяют антилизоцимную активность по оптической плотности полученных смесей, при этом в качестве контроля используют смесь питательного бульона с лизоцимом, осуществляют инкубирование супернатанта с лизоцимом, вводят инкубированную смесь в предварительно обработанную трилоном Б тест-культуру и проводят измерение оптической плотности опытной пробы и контроля через 30 и 150 с, затем рассчитывают антилизоцимную активность по формуле (Патент RU 2126051, 1999 г).

Недостатки прототипа: недостаточная точность, вследствие оценки АЛА бактерий, в том числе и стафилококков, по росту Micrococcus lysodeikticus (Micrococcus luteus), что является косвенным методом, также не учитывает отношение прироста биомассы в опыте с лизоцимом и в контроле.

Технический результат: повышение точности способа.

Новым в заявленном способе является: культивирование стафилококков в условиях встряхивания в течение 6 часов, использование 96-луночного планшета, для определения АЛА у большого количества штаммов, измерение оптической плотности опытных проб и контроля через 2 и 4 часа, возможность оценки даже низкой АЛА, определение прироста биомассы в динамике по отношению к контролю, оценка полученного результата конкретного штамма стафилококков в соответственную ему степень выраженности признака. Указанный результат достигают путем расчета коэффициента антилизоцимной активности по формуле:

где K - коэффициент антилизоцимной активности стафилококков;

V_К - объем бульонной культуры исследуемого штамма;

V_Л - объем раствора лизоцима исходной концентрации;

C_Л - концентрация лизоцима;

M_О4 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;

M_О2 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности;

М_К4 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;

М_К2 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности;

100 - коэффициент пересчета.

Распределение по степени выраженности признака проводят в соответствии со следующими критериями:

1. Низкая степень выраженности АЛА: K<0,49;

2. Средняя степень выраженности АЛА: K в пределах 0,5-2,49;

3. Высокая степень выраженности АЛА: K>2,5.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемую культуру стафилококков культивируют на скошенном мясопептонном агаре в течение 18-24 часов при температуре 37°C. Далее культуру пересевают стандартной бактериальной петлей на жидкую среду LB и выращивают, встряхивая при скорости 150 оборотов в минуту при температуре 37°C в течение 6 часов. Затем оптическую плотность культуры средой LB доводят до 0,15, что соответствует 1*10⁸ КОЕ/мл, используя автоматический одноканальный дозатор.

Параллельно готовят раствор лизоцима с концентрацией 12,5 мкг/мл на бульоне LB.

Для подбора оптимальной концентрации лизоцима провели раститровку в пределах 50-1,5 мкг/мл. Использование большей концентрации лизоцима приводит к выраженному подавлению роста стафилококков, в то время как более низкая концентрация не выявляет признак в полной мере.

Готовят смесь культуры и лизоцима в пластиковых плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа в нескольких повторах. Смесь вносят в лунки, используя автоматический одноканальный дозатор. В контрольные лунки раствор лизоцима не добавляют. Закрытые планшеты инкубируют при 37°C в течение 4-х часов. Оптическую плотность проб измеряют через 2 и 4 часа инкубации. Измерения проводят на ридере BenchmarkPlus (BioRad, США) при длине волны 600 нм. Далее рассчитывают по формуле коэффициент АЛА и оценивают степень выраженности данного признака у определенного штамма стафилококков.

Интервал времени, через который осуществляют измерение оптической плотности проб, получен в ходе исследования. Эксперименты показали, что изменения оптической плотности проб наиболее выражены через 2 и 4 часа инкубации. Более раннее измерение не целесообразно, так как оптическая плотность смеси культуры с лизоцимом практически не отличается от контрольных лунок. Более позднее измерение оптической плотности не информативно, так как скорость роста культуры замедляется. В сравнении оптической плотности смеси через 4 и 2 часа получены наиболее информативные значения.

Ход анализа: в лунку планшета к 100 мкл бульона с лизоцимом в концентрации 12,5 мкг/мл добавляют 5 мкл исследуемой культуры стафилококков, в контрольные лунки добавляют 100 мкл бульона LB и 25 мкл культуры. Инкубируют в течение 4-х часов и измеряют оптическую плотность через 2 и 4 часа. Далее проводят расчет коэффициента АЛА по формуле:

где K - коэффициент антилизоцимной активности стафилококков;

V_К - объем бульонной культуры исследуемого штамма;

V_Л - объем раствора лизоцима исходной концентрации;

C_Л - концентрация лизоцима;

M_О4 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;

M_О2 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности;

M_К4 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;

M_К2 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности;

100 - коэффициент пересчета.

Распределение по степени выраженности признака проводят в соответствии со следующими критериями:

1. Низкая степень выраженности АЛА: K<0,49;

2. Средняя степень выраженности АЛА: K в пределах 0,5-2,49;

3. Высокая степень выраженности АЛА: K>2,5.

Заявленный способ позволяет изучить и оценить степень выраженности антилизоцимной активности стафилококков прямым методом, что ведет к повышению точности результатов. В данном способе проводится двукратное измерение оптической плотности нескольких повторов исследуемых проб, длительное время взаимодействия стафилококков и лизоцима позволяет лучше оценить степень продукции антилизоцимных факторов стафилококками.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. У штамма Staphylococcus gallinarum, изолированного со слизистой носа сотрудника птицефабрики, определили степень выраженности АЛА.

Для этого исследуемую культуру стандартной бактериологической петлей засевали на скошенном мясопептонном агаре и культивировали в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее культуру пересевали стандартной бактериологической петлей на жидкую среду LB и выращивали, постоянно встряхивая при скорости 150 оборотов в минуту при температуре 37°C в течение 6 часов. Затем оптическую плотность культуры доводили средой LB до 0,15, что соответствует 1*10⁸ КОЕ/мл, используя автоматический одноканальный дозатор переменного объема.

Параллельно готовили раствор лизоцима на бульоне LB с концентрацией 12,5 мкг/мл.

Готовили смесь культуры и лизоцима в пластиковых плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа в нескольких повторах. Для этого в лунку планшета к 100 мкл бульона с лизоцимом в концентрации 12,5 мкг/мл добавляли 25 мкл исследуемой культуры стафилококков, в контрольные 2 лунки по 100 мкл бульона LB, без лизоцима и 25 мкл культуры. Смесь вносили в 4 лунки, используя автоматический одноканальный дозатор постоянного объема. Инкубировали при 37°C в течение 4х часов и измеряли оптическую плотность через 2 и 4 часа. Оптическую плотность проб измеряли через 2 и 4 часа инкубации. Измерения проводили на ридере BenchmarkPlus (BioRad, США) при длине волны 600 нм.

Были получены следующие значения оптической плотности:

M_О2 - 0,239;

M_О4 - 0,666;

M_К2 - 0,249;

M_К4 - 0,715;

Далее проводили расчет по формуле:

Итог: K=2,87. В соответствии с критериями данный штамм обладает высокой степенью выраженности АЛА.

Пример 2. У штамма Staphylococcus aureus, изолированного со слизистой студента ПГМА, определили степень выраженности АЛА.

Для этого исследуемую культуру стандартной бактериологической петлей засевали на скошенном мясопептонном агаре и культивировали в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее культуру пересевали стандартной бактериологической петлей на жидкую среду LB и выращивали, постоянно встряхивая при скорости 150 оборотов в минуту при температуре 37°C в течение 6 часов. Затем оптическую плотность культуры доводили средой LB до 0,15, что соответствует 1*10⁸ КОЕ/мл, используя автоматический одноканальный дозатор переменного объема.

Параллельно готовили раствор лизоцима на бульоне LB с концентрацией 12,5 мкг/мл.

Готовили смесь культуры и лизоцима в пластиковых плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа в нескольких повторах. Для этого в лунку планшета к 100 мкл бульона с лизоцимом в концентрации 12,5 мкг/мл добавляли 25 мкл исследуемой культуры стафилококков, в контрольные 2 лунки по 100 мкл бульона LB, без лизоцима и 25 мкл культуры. Смесь вносили в 4 лунки, используя автоматический одноканальный дозатор постоянного объема. Инкубировали при 37°C в течение 4-х часов и измеряли оптическую плотность через 2 и 4 часа. Оптическую плотность проб измеряли через 2 и 4 часа инкубации. Измерения проводили на ридере BenchmarkPlus (BioRad, США) при длине волны 600 нм.

Были получены следующие значения оптической плотности:

M_О2 - 0,286;

M_О4 - 0,497;

M_К2 - 0,300;

M_К4 - 0,612;

Далее проводили расчет по формуле:

Итог: K=2,12. В соответствии с критериями данный штамм обладает средней степенью выраженности АЛА.

Пример 3. У штамма Staphylococcus warneri, изолированного со слизистой сотрудника амбулатории, определили степень выраженности АЛА.

Для этого исследуемую культуру стандартной бактериологической петлей засевали на скошенном мясопептонном агаре и культивировали в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее культуру пересевали стандартной бактериологической петлей на жидкую среду LB и выращивали, постоянно встряхивая при скорости 150 оборотов в минуту при температуре 37°C в течение 6 часов. Затем оптическую плотность культуры доводили средой LB до 0,15, что соответствует 1*10⁸ КОЕ/мл, используя автоматический одноканальный дозатор переменного объема.

Параллельно готовили раствор лизоцима на бульоне LB с концентрацией 12,5 мкг/мл.

Готовили смесь культуры и лизоцима в пластиковых плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа в нескольких повторах. Для этого в лунку планшета к 100 мкл бульона с лизоцимом в концентрации 12,5 мкг/мл добавляли 25 мкл исследуемой культуры стафилококков, в контрольные 2 лунки по 100 мкл бульона LB, без лизоцима и 25 мкл культуры. Смесь вносили в 4 лунки, используя автоматический одноканальный дозатор постоянного объема. Инкубировали при 37°C в течение 4-х часов и измеряли оптическую плотность через 2 и 4 часа. Оптическую плотность проб измеряли через 2 и 4 часа инкубации. Измерения проводили на ридере BenchmarkPlus (BioRad, США) при длине волны 600 нм.

Были получены следующие значения оптической плотности:

M_О2 - 0,143;

M_О4 - 0,132;

M_К2 - 0Д64;

M_К4 - 0,207;

Далее проводили расчет по формуле:

Итог: K=-0,76. В соответствии с критериями данный штамм обладает низкой степенью выраженности АЛА.

Изобретение относится к области клинической микробиологии. Исследуемую культуру стафилококков выращивают в условиях постоянного встряхивания, в качестве контроля используют смесь бульона и культуры без лизоцима, проводят двукратное измерение оптической плотности опытных и контрольных лунок через 2 и 4 часа инкубации и об уровне антилизоцимной активности судят по степени выраженности признака у определенного штамма стафилококков, которую рассчитывают по формуле:

где K - коэффициент антилизоцимной активности стафилококков;

V_К - объем бульонной культуры исследуемого штамма;

V_Л - объем раствора лизоцима исходной концентрации;

C_Л - концентрация лизоцима;

M_О4 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;

M_О2 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности;

M_К4 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;

M_К2 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности. При значении K<0,49 определяют низкую степень выраженности АЛА, K в пределах 0,5-2,49 - определяют среднюю степень выраженности АЛА, K>2,5 - определяют высокую степень выраженности АЛА стафилококков. Использование данного способа позволяет повысить точность определения АЛА. 3 пр.

Способ определения антилизоцимной активности стафилококков (АЛА) путем двукратного измерения оптической плотности смесей стафилококков с лизоцимом в сравнении с контролем, для чего исследуемую культуру стафилококков выращивают в жидкой питательной среде, инкубируют смеси культуры с лизоцимом и определяют антилизоцимную активность по значению их оптической плотности, отличающийся тем, что рост культуры осуществляют в условиях постоянного встряхивания, в качестве контроля используют смесь бульона и культуры без лизоцима, проводят двукратное измерение оптической плотности опытных и контрольных лунок через 2 и 4 часа инкубации и об уровне антилизоцимной активности судят по степени выраженности признака у определенного штамма стафилококков, которую рассчитывают по формуле:

где K - коэффициент антилизоцимной активности стафилококков;
V_К - объем бульонной культуры исследуемого штамма;
V_Л - объем раствора лизоцима исходной концентрации;
C_Л - концентрация лизоцима;
M_О4 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;
M_О2 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности;
M_К4 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности;
M_К2 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности, и при значении K<0,49 определяют низкую степень выраженности АЛА, K в пределах 0,5-2,49 - определяют среднюю степень выраженности АЛА, K>2,5 - определяют высокую степень выраженности АЛА стафилококков.