ТВЕРДЫЕ ФОРМЫ N-(4-(7-АЗАБИЦИКЛО[2.2.1]ГЕПТАН-7-ИЛ)-2-(ТРИФТОРМЕТИЛ)ФЕНИЛ)-4-ОКСО-5-(ТРИФТОРМЕТИЛ)-1,4-ДИГИДРОХИНОЛИН-3-КАРБОКСАМИДА Российский патент 2015 года по МПК C07D401/12 C07D487/08 A61K31/4709 A61P11/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки США с серийным № 61/254614 от 23 октября 2009.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящее изобретение касается твердых форм, например, кристаллических форм N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, который является модулятором регулятора трансмембранной проводимости при муковисцедозе (CFTR). Изобретение также касается фармацевтических композиций, включающих кристаллические формы N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, и связанных с ними способов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] АТФ-кассетные транспортеры составляют семейство мембранных транспортных белков, которые регулируют транспорт большого разнообразия фармакологических агентов, потенциально токсических лекарств и ксенобиотиков, а также анионов. Они представляют собой гомологичные мембранные белки, которые связывают и используют клеточный аденозинтрифосфат (АТФ), благодаря своим специфическим активностям. Некоторые из этих транспортеров раскрыты в качестве белков множественной лекарственной резистентности (как MDR1-P гликопротеин или белок множественной лекарственной резистентности MRP1), защищающих злокачественные раковые клетки от химиотерапевтических агентов. На сегодняшний день идентифицировано 48 таких транспортеров и они сгруппированы в 7 семейств на основании идентичности их последовательностей и функции.

[0003] Одним членом семейства АТФ-кассетных транспортеров, обычно связанным с заболеванием, является цАМФ/АТФ-опосредованный анионный канал, CFTR. CFTR представлен во множестве клеточных типов, включая абсорбирующие и секреторные эпителиальные клетки, где он регулирует поток анионов через мембрану, а также активность других ионных каналов и белков. В эпителиальных клетках нормальное функционирование CFTR является критичным для сохранения транспорта электролитов в организме, включая ткани органов дыхания и пищеварительного тракта. CFTR состоит примерно из 1480 аминокислот, которые кодируют белок, полученный тандемной репликацией трансмембранных доменов, каждый из которых содержит шесть трансмембранных спиралей и домен связывания нуклеотидов. Два трансмембранных домена связаны через большой, полярный, регулирующий (R)-домен со множеством сайтов фосфорилирования, которые регулируют активность каналов и клеточный траффикинг.

[0004] Ген, кодирующий CFTR, идентифицирован и секвенирован (смотри работы Gregory, R. J. и др. (1990) Nature 347: 382-386; Rich, D. P. и др. (1990) Nature 347: 358-362), Riordan, J. R. и др. (1989) Science 245: 1066-1073). Дефект в этом гене вызывает мутации в CFTR, результатом которых является муковисцедоз (CF), наиболее общее смертельное генетическое заболевание у людей. Муковисцедоз поражает примерно одного из каждых 2500 младенцев в Соединенных Штатах. Среди всего населения США до 10 миллионов людей являются носителями единственной копии дефектного гена без очевидных вредных эффектов. В отличие от этого, индивидуумы с двумя копиями CF-ассоциированного гена страдают от подрывающих здоровье и смертельных эффектов CF, включая хроническую болезнь легких.

[0005] У пациентов с муковисцедозом мутации в CFTR, эндогенно экспрессированном в респираторном эпителии, приводят к пониженной апикальной секреции анионов, вызывая дисбаланс транспорта ионов и жидкостей. Результирующее снижение транспорта анионов вносит свой вклад в повышенное аккумулирование слизи в легком и сопутствующие микробные инфекции, которые, в конечном счете, приводят к смерти CF-пациентов. Кроме респираторных заболеваний CF-пациенты обычно страдают от желудочно-кишечных проблем и недостаточности поджелудочной железы, что в результате приводит к смерти, если оставить болезнь без лечения. Кроме того, большинство мужчин с муковисцедозом бесплодны, и у женщин с муковисцедозом способность к воспроизведению потомства снижена. В отличие от тяжелых эффектов двух копий CF-ассоциированного гена индивидуумы с единственной копией CF-ассоциированного гена демонстрируют повышенную сопротивляемость к холере и обезвоживанию в результате диареи - возможно, объясняя относительно высокую частоту CF гена среди населения.

[0006] Анализ последовательности CFTR-гена CF хромосом выявил множество заболеваний, вызывающих мутации (Cutting, G. R. и др. (1990) Nature 346: 366-369; Dean, M. и др. (1990) Cell (61: 863-870; и Kerem, B-S. и др. (1989) Science 245: 1073-1080; Kerem, B-S и др. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8447-8451). На сегодняшний день идентифицировано более 1000 заболеваний, вызывающих мутации CF-гена

(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app). Наиболее распространенной мутацией является удаление фенилаланина в положении 508 аминокислотной последовательности CFTR и обычно обозначается как ΔF508-CFTR. Эта мутация происходит примерно в 70 процентах случаев муковисцедоза и связана с тяжелым заболеванием.

[0007] Удаление остатка 508 в ΔF508-CFTR предотвращает правильную укладку появляющегося белка. Результатом этого является неспособность мутантного белка покидать ER и движение к плазматической мембране. В результате, количество каналов, присутствующих в мембране, намного меньше, чем наблюдается в клетках, экспрессирующих CFTR «дикого» типа. Кроме ухудшенного траффикинга результатом мутации является дефектный воротный механизм ионных каналов. Уменьшенное количество каналов в мембране и дефектный воротный механизм вместе ведут к снижению транспорта анионов через эпителий, приводя к дефектному транспорту ионов и жидкостей. (Quinton, P. M. (1990), FASEB J. 4: 2709-2727). Однако исследования показали, что пониженные количества ΔF508-CFTR в мембране являются функциональными, хотя меньше, чем для CFTR «дикого» типа. (Dolmans и др. (1991), Nature Lond. 354: 526-528; Denning и др., выше; Pasyk и Foskett (1995), J. Cell. Biochem. 270: 12347-50). Кроме ΔF508-CFTR, R117H-CFTR и G551D-CFTR, другое заболевание, вызывающее мутации CFTR, результатом которых является дефектный траффикинг, синтез и/или воротный механизм каналов, можно регулировать повышающим или понижающим образом с целью изменения секреции анионов и модификации прогрессирования и/или тяжести заболевания.

[0008] Хотя кроме анионов CFTR осуществляет транспорт множества молекул, понятно, что эта роль (транспорт хлоридных и бикарбонатных анионов) представляет один элемент в важном механизме транспортировки ионов и воды через эпителий. Другие элементы включают эпителиальный Na⁺-канал, ENaC, Na⁺/2Cl^-/K⁺-сотранспортер, Na⁺-K⁺-АТФазный насос и базолатеральные мембранные K⁺-каналы, которые отвечают за захват хлорида клеткой.

[0009] Эти элементы работают вместе, выполняя направленный транспорт через эпителий посредством своей селективной экспрессии и локализации в клетке. Абсорбция хлорида имеет место при координированной активности ENaC и CFTR, присутствующих на апикальной мембране, и Na⁺-K⁺-АТФазного насоса и Cl^--каналов, экспрессируемых на базолатеральной поверхности клетки. Вторичный активный транспорт хлорида из люминальной области ведет к аккумуляции внутриклеточного хлорида, который затем может пассивно покидать клетку через Cl^--ионные каналы, результатом чего является векторный транспорт. Расположение Na⁺/2Cl^-/K⁺-сотранспортера, Na⁺-K⁺-АТФазного насоса и базолатеральных мембранных K⁺-каналов на базолатеральной поверхности и CFTR в люминальной области координируют секрецию хлорида за счет CFTR в люминальной области. Поскольку вода, вероятно, никогда сама активно не перемещается, ее поток через эпителий зависит от очень маленьких трансэпителиальных осмотических градиентов, генерируемых объемным потоком натрия и хлорида.

[00010] Предполагают, что дефектный транспорт бикарбоната в результате мутаций в CFTR является причиной дефектов некоторых секреторных функций. Смотри, например, работу "Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis", Paul M. Quinton, Lancet 2008; 372: 415-417.

[00011] Мутации в CFTR, которые связаны с умеренной дисфункцией CFTR, также очевидны у пациентов с состояниями, которые имеют определенные проявления заболеваний, общие с CF, но не соответствуют диагностическим критериям для CF. Эти состояния включают врожденное билатеральное отсутствие семенных протоков, идиопатический хронический панкреатит, хронический бронхит и хронический риносинусит. Другие заболевания, при которых, как считают, мутантный CFTR является фактором риска наряду с генами-модификаторами или факторами окружающей среды, включают первичный склерозирующий холангит, аллергический бронхолегочный аспергиллез и астму.

[00012] Показано также, что сигаретный дым, гипоксия и факторы окружающей среды, которые индуцируют гипоксическую сигнализацию, ухудшают функцию CFTR и могут вносить вклад в некоторые виды респираторного заболевания, такого как хронический бронхит. Заболевания, которые являются результатом дефектной функции CFTR, но не соответствуют диагностическим критериям для CF, характеризуют как CFTR-связанные заболевания.

[00013] Кроме муковисцедоза, модуляция CFTR-активности может быть благотворна для других заболеваний, не вызываемых непосредственно мутациями в CFTR, таких как секреторные заболевания и другие заболевания, вызываемые неправильным сворачиванием белка, опосредованные CFTR. CFTR регулирует поток хлорида и бикарбоната через эпителий многих клеток, регулируя движение жидкости, солюбилизацию белка, вязкость слизи и активность фермента. Дефекты в CFTR могут вызывать закупорку дыхательных путей или каналов во многих органах, включая печень и поджелудочную железу. Потенцирующие средства представляют собой соединения, которые повышают активность воротного механизма CFTR, присутствующего в клеточной мембране. Любое заболевание, которое включает загущение слизи, ухудшенную регуляцию жидкости, ухудшенный мукоцилиарный клиренс или блокировку каналов, приводя к воспалению и разрушению ткани, может быть кандидатом для потенцирующих средств.

[00014] Эти заболевания включают, но не ограничены этим, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), астму, вызванную дымом COPD, хронический бронхит, риносинусит, констипацию, синдром «сухого глаза» и синдром Шегрена, гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь, желчный конкремент, выпадение прямой кишки и воспалительное заболевание кишечника. COPD характеризуется ограничением воздушного потока, которое прогрессирует и не полностью обратимо. Ограничение воздушного потока происходит в результате гиперсекреции слизи, эмфиземы и бронхиолита. Активаторы мутантного CFTR или CFTR «дикого» типа предлагают потенциальное лечение гиперсекреции слизи и ухудшенного мукоцилиарного клиренса, которое является общим при COPD. Конкретно, повышение секреции анионов через CFTR может содействовать транспорту жидкости в жидкость на поверхности дыхательных путей, гидратируя слизь и оптимизируя вязкость жидкости вокруг ресничек. Это, вероятно, дает повышенный мукоцилиарный клиренс и снижение симптомов, связанных с COPD. Кроме того, предотвращая продолжающееся инфицирование и воспаление, благодаря улучшению клиренса дыхательных путей, CFTR-модуляторы могут предотвращать или замедлять паренхимное поражение дыхательных путей, которое характеризует эмфизему и снижает или отменяет увеличение количества и размера клеток, секретирующих слизь, которое лежит в основе гиперсекреции слизи при заболеваниях дыхательных путей. Синдром «сухого глаза» характеризуется снижением производства слезной жидкости и аномальным липидом слезной пленки, белковым и муциновым профилями. Встречается много случаев «сухого глаза», некоторые из которых связаны с возрастом, лазерной хирургией глаз, артритом, медикаментозным лечением, химическими/термическими ожогами, аллергиями и такими заболеваниями, как муковисцедоз и синдром Шегрена. Повышение секреции анионов за счет CFTR, возможно, повышает транспорт жидкости из эндотелиальных клеток роговицы и секреторных желез, окружающих глаз, повышая гидратацию роговицы. Возможно, это облегчает симптомы, связанные с синдромом «сухого глаза». Синдром Шегрена представляет собой аутоиммунное заболевание, при котором иммунная система атакует железы, вырабатывающие влагу во всем организме, включая глаз, рот, кожу, респираторную ткань, печень, влагалище и пищеварительный тракт. Симптомы включают сухость глаз, рта и влагалища, а также болезнь легких. Данное заболевание также связано с ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системным склерозом и полимиозитом/дерматомиозитом. Считается, что траффикинг дефектного белка вызывает заболевание, варианты лечения которого ограничены. Модуляторы активности CFTR могут гидратировать различные органы, пораженные болезнью, и могут помочь в облегчении связанных с ним симптомов. Индивидуумы с муковисцедозом имеют рецидивирующие случаи непроходимости кишечника и более высокую инцидентность выпадения прямой кишки, желчного конкремента, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, злокачественных желудочно-кишечных заболеваний и воспалительных заболеваний кишечника, указывая, что функция CFTR может играть важную роль в предотвращении таких заболеваний.

[00015] Как обсуждается выше, полагают, что удаление остатка 508 в ΔF508-CFTR препятствует правильному свертыванию возникающего белка, результатом чего является неспособность данного мутантного белка покидать ER и перемещаться к плазматической мембране. В результате, в плазматической мембране присутствуют недостаточные количества зрелого белка, и транспорт хлорида в эпителиальных тканях значительно уменьшен. Фактически показано, что этот клеточный феномен дефектного ER-процессинга CFTR посредством ER-механизма лежит в основе не только заболевания CF, но и широкого диапазона других отдельных и наследственных заболеваний. Существует два пути, где ER механизм может не срабатывать, это либо потеря связи с ER-экспортом белков, ведущая к деградации, либо ER-накопление этих дефектных/неправильно упакованных белков [Aridor M, и др., Nature Med., 5(7), pp 745-751 (1999); Shastry, B.S., и др., Neurochem. International, 43, pp 1-7 (2003); Rutishauser, J., и др., Swiss Med Wkly, 132, pp 211-222 (2002); Morello, JP и др., TIPS, 21, pp. 466-469 (2000); Bross P., и др., Human Mut., 14, pp. 186-198 (1999)]. Заболеваниями, связанными с первым классом ER-дисфункции, являются муковисцедоз (в результате неправильно упакованного ΔF508-CFTR, как обсуждается выше), наследственная эмфизема (обусловленная 1-антитрипсином; не Piz варианты), наследственный гемохроматоз, недостатки системы свертывания-фибринолиза, такие как дефицит белка C, наследственный ангионевротический отек типа 1, недостатки переработки липидов, такие как семейная гиперхолестеринемия, хиломикронемия типа 1, абеталипопротеинемия, болезни лизосомного накопления, такие как болезнь I-клеток/псевдо-Гурлер, мукополисахаридоз (обусловленный липосомальными обрабатывающими ферментами), болезнь Сандхоффа/Тея-Сакса (обусловленная β-гексозаминидазой), синдром Криглера-Найяра типа II (обусловленный UDP-глюкуронилсиалилтрансферазой), полиэндокринопатия/гиперинсулинемия, сахарный диабет (обусловленный инсулиновым рецептором), карликовость Ларона (обусловленная рецептором гормона роста), дефицит миелопероксидазы, первичный гипопаратиреодизм (обусловленный гормоном околощитовидной железы), меланома (обусловленная тирозиназой). Заболеваниями, связанными с последним классом ER-дисфункции, являются гликаноз CDG типа 1, наследственная эмфизема (обусловленная 1-антитрипсином, PiZ вариант), врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез (обусловленный проколлагеном типа I, II, IV), наследственная гипофибриногенемия (обусловленная фибриногеном), дефицит ACT (обусловленный α1-антихимотрипсином), несахарный диабет (DI), нейрофизиологический DI (обусловленный гормоном вазопрессином/V2-рецептором), нефрогенный DI (обусловленный аквапорином II), синдром Шарко-Мари-Тус (обусловленный периферическим миелиновым белком 22), болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (обусловленная βΑΡΡ и пресенелинами), болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Пика, некоторые полиглутаминовые неврологические нарушения, такие как болезнь Хантингтона, спинномозговая атаксия типа I, спинальная и бульбарная мышечная атрофия, дентаторубральная паллидарная и миотоническая дистрофия, а также спонгиоформные энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейцфельда-Якоба (обусловленная дефектом обработки прионного белка), болезнь Фабри (обусловленная липосомальной α-галактозидазой A), синдром Страусслера-Шейнкера (обусловленный Prp прогрессирующим дефектом), бесплодие, панкреатит, недостаточность поджелудочной железы, остеопороз, остеопения, синдром Горхэма, хлоридные канлопатии, врожденная миотония (формы Томсена и Беккера), синдром Бартера типа III, болезнь Дента, гиперэкплексия, эпилепсия, болезни лизосомного накопления, синдром Ангельмана, первичная цилиарная дискинезия (PCD), PCD с обратным расположением внутренних органов (также известная как синдром Картагенера), PCD без обратного расположения внутренних органов и цилиарной аплазии и болезнь печени.

[00016] Другие заболевания, связанные с мутацией в CFTR, включают бесплодие мужчин вследствие врожденного билатерального отсутствия семенных протоков (CBAVD), умеренную болезнь легких, идиопатический панкреатит и аллергический бронхолегочный аспергиллез (ABPA). Смотри работу "CFTR-opathies: disease phenotypes associated with cystic fibrosis transmembrane regulator gene mutations", Peader G. Noone и Michael R. Knowles, Respir. Res. 2001, 2: 328-332 (включенную здесь в виде ссылки).

[00017] Кроме активности CFTR с повышающей регуляцией снижение секреции анионов модуляторами CFTR может быть полезным для лечения секреторных диарей, при которых эпителиальный транспорт воды значительно усиливается в результате активированного повышающим секрецию средством транспорта хлорида. Этот механизм включает повышение цАМФ и стимуляцию CFTR.

[00018] Хотя существуют многочисленные случаи диареи, главные последствия диарейных заболеваний, являющихся результатом избыточного транспорта хлорида, являются общими для всех и включают обезвоживание, ацидоз, ухудшение роста и смерть. Острые и хронические диареи представляют основную медицинскую проблему во многих районах мира. Диарея представляет собой и существенный фактор при недоедании, и главную причину смерти (5000000 смертей/год) у детей младше пяти лет.

[00019] Секреторные диареи также являются опасным состоянием у пациентов с благоприобретенным синдромом иммунодефицита (AIDS) и хроническим воспалительным заболеванием кишечника (IBD). У шестнадцати миллионов путешественников в развивающиеся страны из промышленно развитых государств ежегодно обнаруживается диарея при разной тяжести и количестве случаев в зависимости от страны и района путешествия.

[00020] Таким образом, имеется потребность в эффективных и селективных CFTR потенцирующих средствах дикого типа и мутантных формах человеческого CFTR. Эти мутантные формы CFTR включают, но не ограничены этим, ΔF508del, G551D, R117H, 2789+5G->A.

[00021] Имеется также потребность в модуляторах активности CFTR и их композициях, которые можно применять для модуляции активности CFTR в клеточной мембране млекопитающего.

[00022] Существует потребность лечения заболеваний, вызванных мутацией в CFTR, с использованием модуляторов активности CFTR.

[00023] Существует потребность в способах модуляции активности CFTR в ex vivo клеточной мембране млекопитающего.

[00024] Кроме того, существует потребность в стабильных твердых формах указанного соединения, которые можно легко использовать в фармацевтических композициях, подходящих для применения в качестве терапевтических средств.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00025] Настоящее изобретение касается твердых форм N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (здесь далее "соединение I"), который имеет приведенную ниже структуру:

Соединение I

[00026] Соединение I и его фармацевтически приемлемые композиции полезны для лечения или уменьшения тяжести множества заболеваний, нарушений или состояний, включая, но не ограничиваясь этим, следующие: муковисцедоз, астма, вызванная дымом COPD, хронический бронхит, риносинусит, констипация, панкреатит, недостаточность поджелудочной железы, бесплодие мужчин вследствие врожденного билатерального отсутствия семенных протоков (CBAVD), умеренная болезнь легких, идиопатический панкреатит, аллергический бронхолегочный аспергиллез (ABPA), болезнь печени, наследственная эмфизема, наследственный гемохроматоз, недостатки системы свертывания-фибринолиза, такие как дефицит белка C, наследственный ангионевротический отек типа 1, недостатки переработки липидов, такие как семейная гиперхолестеринемия, хиломикронемия типа 1, абеталипопротеинемия, лизосомные болезни накопления, такие как болезнь I-клеток/псевдо-Гурлер, мукополисахаридоз, болезнь Сандхоффа/Тея-Сакса, синдром Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатия/гиперинсулинемия, сахарный диабет, карликовость Ларона, дефицит миелопероксидазы, первичный гипопаратиреодизм, меланома, гликаноз CDG типа 1, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственная гипофибриногенемия, дефицит ACT, несахарный диабет (DI), нейрофизиологический DI, нефрогенный DI, синдром Шарко-Мари-Тус, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Пика, некоторые полиглутаминовые неврологические нарушения, такие как болезнь Хантингтона, спинномозговая атаксия типа I, спинальная и бульбарная мышечная атрофия, дентаторубральная паллидарная и миотоническая дистрофия, а также спонгиоформные энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейцфельда-Якоба (обусловленная дефектом обработки прионного белка), болезнь Фабри, синдром Страусслера-Шейнкера, COPD, синдром «сухого глаза» или синдром Шегрена, остеопороз, остеопения, исцеление костей и рост костей (включая восстановление костей, регенерацию костей, уменьшение резорбции костей и усиление депонирования кальция в костях), синдром Горхэма, хлоридные каналопатии, такие как врожденная миотония (формы Томсена и Беккера), синдром Бартера типа III, болезнь Дента, гиперэкплексия, эпилепсия, гиперэкплексия, болезни лизосомного накопления, синдром Ангельмана и первичная цилиарная дискинезия (PCD), термин для наследственных нарушений структуры и/или функции ресничек, включая PCD с обратным расположением внутренних органов (также известную, как синдром Картагенера), PCD без обратного расположения внутренних органов и цилиарная аплазия.

[00027] В одном аспекте соединение I имеет по существу кристаллическую форму, обозначенную как форма B, форма A-HCl или форма B-HCl, которые здесь описаны и охарактеризованы.

[00028] В другом аспекте соединение I имеет форму соли гидрохлорида, обозначенную как форма A-HCl или форма B-HCl, которые здесь описаны и охарактеризованы.

[00029] В другом аспекте соединение I имеет форму соли гидрохлорида, обозначенную как форма B-HCl, которая здесь описана и охарактеризована.

[00030] Описанный здесь способ можно применять для получения композиций по данному изобретению, содержащих форму B, форму A-HCl, форму B-HCl или любую комбинацию этих форм.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[00031] На фигуре 1 представлена картина рентгеновской дифракции порошка типичного образца формы A-HCl.

[00032] На фигуре 2 представлена ДСК-кривая для типичного образца формы A-HCl.

[00033] На фигуре 3 представлена кривая, полученная методом термогравиметрического анализа типичного образца формы A-HCl, которая представляет массу образца как функцию температуры.

[00034] На фигуре 4 представлен ФП-ИК спектр типичного образца формы A-HCl.

[00035] На фигуре 5 представлен твердофазный ^l3C ЯМР-спектр типичного образца формы A-HCl.

[00036] На фигуре 6 представлен твердофазный ¹⁹F ЯМР-спектр типичного образца формы A-HCl.

[00037] На фигуре 7A представлена картина рентгеновской дифракции порошка для типичного образца формы B, зарегистрированной на приборе 1.

[00038] На фигуре 7B представлена картина рентгеновской дифракции порошка для типичного образца формы B, зарегистрированной на приборе 2.

[00039] На фигуре 8 представлена ДСК-кривая для типичного образца формы B.

[00040] На фигуре 9 представлена кривая, полученная методом термогравиметрического анализа типичного образца формы B, которая представляет массу образца как функцию температуры.

[00041] На фигуре 10 представлен ФП-ИК спектр типичного образца формы B.

[00042] На фигуре 11 представлен твердофазный ¹³C ЯМР-спектр типичного образца формы B.

[00043] На фигуре 12 представлен твердофазный ¹⁹F ЯМР-спектр типичного образца формы B.

[00044] На фигуре 13 представлена картина рентгеновской дифракции порошка для типичного образца формы B-HCl.

[00045] На фигуре 14 представлена ДСК-кривая для типичного образца формы B-HCl.

[00046] На фигуре 15 представлена кривая, полученная методом термогравиметрического анализа типичного образца формы B-HCl, которая представляет массу образца как функцию температуры.

[00047] На фигуре 16 представлен ФП-ИК спектр типичного образца формы B-HCl.

[00048] На фигуре 17 представлен твердофазный ¹³C ЯМР-спектр типичного образца формы B-HCl.

[00049] На фигуре 18 представлен твердофазный ¹⁹F ЯМР-спектр типичного образца формы B-HCl.

[00050] Фигура 19 является иллюстрацией конформационной структуры формы B на основании отдельного рентгеновского анализа.

[00051] Фигура 20 является иллюстрацией конформационной структуры формы A-HCl на основании отдельного рентгеновского анализа.

[00052] На фигуре 21 представлена диаграмма молекулярной упаковки формы A-HCl на основании отдельного рентгеновского анализа.

[00053] Фигура 22 является иллюстрацией конформационной структуры формы B-HCl на основании отдельного рентгеновского анализа.

[00054] На фигуре 23 представлена диаграмма молекулярной упаковки формы B-HCl на основании отдельного рентгеновского анализа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00055] Определения

[00056] Используемые здесь следующие определения применяются, если не указано иначе.

[00057] Используемый здесь термин "ABC-транспортер" обозначает ABC-транспортерный белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один связывающий домен, в котором указанный белок или его фрагмент присутствует in vivo или in vitro. Используемый здесь термин "связывающий домен" обозначает домен на ABC-транспортере, который может связываться с модулятором. Смотри, например, работу Hwang, T. C. и др., J. Gen. Physiol. (1998): 111(3), 477-90.

[00058] Используемый здесь термин "CFTR" обозначает регулятор трансмембранной проводимости при муковисцедозе или его мутацию, допускающую регулирующую активность, включая, но не ограничиваясь этим, ΔF508 CFTR, R117H CFTR и G551D CFTR (смотри, например, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app для мутации CFTR).

[00059] Используемый здесь термин "модулирование" обозначает увеличение или уменьшение измеряемого количества.

[00060] Используемый здесь термин "нормальный CFTR" или "нормальная функция CFTR" обозначает CFTR дикого типа, не ухудшенный никакими факторами окружающей среды, такими как курение, загрязнение или что-то, вызывающее воспаление легких.

[00061] Используемое здесь выражение "уменьшенный CFTR" или "пониженная функция CFTR" обозначает меньшее или нормальное количество CFTR или меньшую или нормальную функцию CFTR. Термин "кристаллические" относится к соединениям или композициям, где структурные единицы организованы в фиксированные геометрические структуры или решетки таким образом, что кристаллические твердые вещества имеют строгий дальний порядок. Структурные единицы, которые составляют структуру кристалла, могут представлять собой атомы, молекулы или ионы. Кристаллические твердые вещества демонстрируют точные температуры плавления.

[00062] Выражение "по существу кристаллический" относится к твердому материалу, который преимущественно организован в фиксированные геометрические структуры или решетки, которые имеют строгий дальний порядок. Например, по существу кристаллические материалы имеют кристалличность более примерно 85% (например, кристалличность более примерно 90%, кристалличность более примерно 95% или кристалличность более примерно 99%). Отмечается также, что выражение "по существу кристаллический" включает дескриптор 'кристаллический', который определен в предыдущем абзаце.

[00063] Для цели данного изобретения химические элементы идентифицируют в соответствии с периодической таблицей элементов, CAS версия, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. Кроме того, общие принципы органической химии описаны в "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, и "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. и March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001, полное содержание которых включено здесь в виде ссылок.

[00064] Если не указано иначе, все таутомерные формы соединений по изобретению включены в область изобретения.

[00065] Кроме того, считается, что пока не указано иначе, изображенные здесь структуры включают соединения, которые отличаются только присутствием одного или большего количества атомов изотопов. Например, соединения, имеющие настоящие структуры, за исключением замещения водорода дейтерием или тритием или замещения углерода ^l3C- или ^l4C-углеродом, входят в область данного изобретения. Такие соединения полезны, например, в качестве аналитических инструментов или проб в биологических исследованиях. Такие соединения, в частности соединения, которые содержат атомы дейтерия, могут демонстрировать модифицированные метаболические свойства.

[00066] ФОРМА A-HCl

[00067] В одном аспекте изобретение включает в качестве отличительного признака форму N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, охарактеризованную как форма A-HCl.

[00068] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется одним или большим количеством указанных далее пиков, измеренных в градусах, на картине рентгеновской дифракции порошка: пик от примерно 6,9 до примерно 7,3 градусов (например, около 7,1 градусов); пик от примерно 8,0 до примерно 8,4 градусов (например, около 8,2 градусов); пик от примерно 13,9 до примерно 14,2 градусов (например, около 14,1 градусов) и пик от примерно 21,0 до примерно 21,4 градусов (например, около 21,2 градусов) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа-излучения.

[00069] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в градусах, на картине рентгеновской дифракции порошка: пик от примерно 6,9 до примерно 7,3 градусов (например, около 7,1 градусов); пик от примерно 8,0 до примерно 8,4 градусов (например, около 8,2 градусов); пик от примерно 11,9 до примерно 12,3 градусов (например, около 12,1 градусов); пик от примерно 13,5 до примерно 13,9 градусов (например, около 13,7 градусов); пик от примерно 16,2 до примерно 16,6 градусов (например, около 16,4 градусов); пик от примерно 18,5 до примерно 18,9 градусов (например, около 18,7 градусов) и пик от примерно 21,0 до примерно 21,4 градусов (например, около 21,2 градусов) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа-излучения.

[00070] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в градусах, на картине рентгеновской дифракции порошка: пик от примерно 6,9 до примерно 7,2 градусов (например, около 7,1 градусов); пик от примерно 8,0 до примерно 8,4 градусов (например, около 8,2 градусов); пик от примерно 13,9 до примерно 14,3 градусов (например, около 14,1 градусов); пик от примерно 14,5 до примерно 14,9 градусов (например, около 14,7 градусов); пик от примерно 16,2 до примерно 16,6 градусов (например, около 16,4 градусов); пик от примерно 18,5 до примерно 18,9 градусов (например, около 18,7 градусов); три пика от примерно 21,0 до примерно 22,2 градусов (например, пики около 21,2 градусов, около 21,7 и около 21,9); пик от примерно 22,6 до примерно 23,0 градусов (например, около 22,8 градусов); 2 пика от примерно 24 до примерно 25 градусов (например, около 24,6 градусов и около 25,0 градусов) и 2 пика от примерно 35,3 до примерно 36,0 градусов (например, около 35,6 градусов) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа-излучения.

[00071] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется картиной рентгеновской дифракции порошка, приведенной на фигуре 1.

[00072] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹³C ЯМР-спектре: пик от примерно 163,5 до примерно 163,9 м.д. (например, около 163,7 м.д.), пик от примерно 137,0 до примерно 137,4 м.д. (например, около 137,2 м.д.) и пик от примерно 121,3 до примерно 121,7 м.д. (например, около 121,5 м.д.).

[00073] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹³C ЯМР-спектре: пик от примерно 175,5 до примерно 175,9 м.д. (например, около 175,7 м.д.), пик от примерно 163,5 до примерно 163,9 м.д. (например, около 163,7 м.д.), пик от примерно 142,4 до примерно 142,8 м.д. (например, около 142,6 м.д.), пик от примерно 140,6 до примерно 141,0 м.д. (например, около 140,8 м.д.), пик от примерно 137,0 до примерно 137,4 м.д. (например, 137,2 м.д.), пик от примерно 131,3 до примерно 131,7 м.д. (например, около 131,5 м.д.) и пик от примерно 121,3 до примерно 121,7 м.д. (например, около 121,5 м.д.).

[00074] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется твердотельным ¹³C ЯМР-спектром, показанным на фигуре 5.

[00075] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹⁹F ЯМР-спектре: пик от примерно -56,8 до примерно -57,2 м.д. (например, около -57,0 м.д.) и пик от примерно -60,3 до примерно -60,7 м.д. (например, около -60,5 м.д.).

[00076] В некоторых вариантах форма A-HCl характеризуется твердотельным ^l9F ЯМР-спектром, показанным на фигуре 6.

[00077] В других вариантах форма A-HCl характеризуется ФП-ИК спектром, представленным на фигуре 4.

[00078] ФОРМА B

[00079] В одном аспекте изобретение включает в качестве отличительного признака форму N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, охарактеризованную как форма B.

[00080] В некоторых вариантах форма B характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в градусах, на картине рентгеновской дифракции порошка: пик от примерно 6,5 до примерно 6,9 градусов (например, около 6,7 градусов); пик от примерно 9,8 до примерно 10,2 градусов (например, около 10,0 градусов); пик от примерно 11,0 до примерно 11,4 градусов (например, около 11,2 градусов); пик от примерно 13,2 до примерно 13,6 градусов (например, около 13,4 градусов) и пик от примерно 23,8 до примерно 24,2 градусов (например, около 24,2 градусов) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа излучения.

[00081] В некоторых вариантах форма B характеризуется одним или большим количеством пиков: пик от примерно 6,5 до примерно 6,9 градусов (например, около 6,7 градусов), пик от примерно 9,2 до примерно 9,6 градусов (например, около 9,4), пик от примерно 11,0 до примерно 11,4 градусов (например, около 11,2 градусов), пик от примерно 13,2 до примерно 13,6 градусов (например, около 13,4 градусов), пик от примерно 15,0 до примерно 15,4 градусов (например, около 15,2 градусов), пик от примерно 17,0 до примерно 17,4 градусов (например, около 17,2 градусов), пик от примерно 17,6 до примерно 18,0 градусов (например, около 17,8 градусов), пик от примерно 17,9 до примерно 18,3 градусов (например, около 18,1 градусов), пик от примерно 19,0 до примерно 19,4 градусов (например, около 19,2), пик от примерно 19,9 до примерно 20,3 градусов (например, около 20,1 градусов), пик от примерно 21,0 до примерно 21,5 градусов (например, около 21,2 градусов), пик от примерно 21,8 до 22,2 градусов (например, около 22,0 градусов), пик от примерно 23,8 до примерно 24,2 градусов (например, около 24,0 градусов), пик от примерно 26,0 до примерно 26,4 градусов (например, около 26,2 градусов), пик от примерно 27,0 до примерно 27,4 градусов (например, около 27,2), пик от примерно 27,5 до примерно 27,9 градусов (например, около 27,7 градусов) и пик от примерно 28,7 до примерно 29,1 градусов (например, около 28,9) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа излучения.

[00082] В некоторых вариантах форма B характеризуется картиной рентгеновской дифракции порошка, приведенной на фигуре 7.

[00083] В некоторых вариантах форма B характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹³C ЯМР-спектре: пик от примерно 165,1 до примерно 165,5 м.д. (например, около 165,3 м.д.), пик от примерно 145,7 до примерно 146,1 м.д. (около 145,9 м.д.), пик от примерно 132,7 до примерно 133,1 м.д. (например, около 132,9 м.д.) и пик от примерно 113,2 до примерно 1 13,6 м.д. (например, около 113,4 м.д.).

[00084] В некоторых вариантах форма B характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹³C ЯМР-спектре: пик от примерно 175,1 до примерно 175,5 м.д. (например, около 175,3 м.д.), пик от примерно 165,1 до примерно 165,5 м.д. (например, около 165,3 м.д.), пик от примерно 141,2 до примерно 141,6 м.д. (например, около 141,4 м.д.), пик от примерно 145,7 до примерно 146,1 м.д. (например, около 145,9 м.д.), пик от примерно 132,7 до примерно 133,1 м.д. (например, около 132,9 м.д.), пик от примерно 123,3 до примерно 123,7 м.д. (например, около 123,5 м.д.), пик от примерно 126,6 до примерно 127,0 м.д. (например, около 126,8 м.д.), пик от примерно 113,2 до примерно 113,6 м.д. (например, около 113,4 м.д.), пик от примерно 117,2 до примерно 117,6 м.д. (например, около 117,4 м.д.), пик от примерно 58,1 до примерно 58,5 м.д. (например, около 58,3 м.д.), пик от примерно 26,7 до примерно 27,1 м.д. (например, около 26,9 м.д.) и пик от примерно 29,0 до примерно 29,4 м.д. (например, около 29,2 м.д.).

[00085] В некоторых вариантах форма B характеризуется твердотельным ^l3C ЯМР-спектром, показанным на фигуре 11.

[00086] В некоторых вариантах форма B характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹⁹F ЯМР-спектре: пик от примерно -55,9 до примерно -56,3 м.д. (например, около -56,1 м.д.) и пик от примерно -61,9 до примерно -62,3 м.д. (например, около -62,1 м.д.).

[00087] В некоторых вариантах форма B характеризуется твердотельным ¹⁹F ЯМР-спектром, показанным на фигуре 12.

[00088] В другом варианте настоящее изобретение включает в качестве отличительного признака кристалл N-(4-(7-азабицикло[2.2.l]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида в виде формы B, имеющей моноклинную кристаллическую систему, пространственную группу P21/C и следующие размеры элементарной ячейки: a=13,5429(4) Å, b=13,4557(4) Å, c=12,0592(4) Å, α=90°, β=101,193° и γ=90°.

[00089] В одном варианте настоящее изобретение касается кристалла N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида в виде формы B, имеющей моноклинную кристаллическую систему, пространственную группу P21/C и следующие размеры элементарной ячейки: a=13,5429(4) Å, b=13,4557(4) Å, c=12,0592(4) Å.

[00090] В других вариантах форма B характеризуется ФП-ИК спектром, приведенным на фигуре 10.

[00091] ФОРМА B-HCl

[00092] В одном аспекте изобретение включает в качестве отличительного признака форму N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, охарактеризованную как форма B-HCl.

[00093] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в градусах, на картине рентгеновской дифракции порошка: пик от примерно 8,1 до примерно 8,5 градусов (например, около 8,3 градусов); пик от примерно 8,8 до примерно 9,2 градусов (например, около 9,0 градусов); пик от примерно 12,8 до примерно 13,2 градусов (например, около 13,0 градусов); пик от примерно 17,8 до примерно 18,2 градусов (например, около 18,0 градусов) и пик от примерно 22,8 до примерно 23,2 градусов (например, около 23,0 градусов) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа-излучения.

[00094] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в градусах, на картине рентгеновской дифракции порошка: пик от примерно 8,1 до примерно 8,5 градусов (например, около 8,3 градусов); пик от примерно 14,6 до примерно 15,1 градусов (например, около 14,8 градусов); пик от примерно 16,5 до примерно 16,9 градусов (например, около 16,7 градусов); 3 пика от примерно 17,6 до примерно 18,4 градусов (например, около 17,8 градусов, около 18,0 градусов и около 18,2 градусов); 2 пика от примерно 21,4 до примерно 22,1 градусов (например, около 21,7 градусов и около 22,0 градусов); 2 пика от примерно 22,8 до примерно 23,8 градусов (например, пики около 23,0 градусов и около 23,6); 2 пика от примерно 24,7 до примерно 25,4 градусов (например, около 24,9 градусов и около 25,2 градусов); пик от примерно 26,9 до примерно 27,3 градусов (например, около 27,1 градусов); пик от примерно 30,9 до примерно 31,3 градусов (например, около 31,1 градусов) и пик от примерно 38,2 до примерно 38,7 градусов (например, около 38,5 градусов) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа-излучения.

[00095] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в градусах, на картине рентгеновской дифракции порошка: пик от примерно 8,1 до примерно 8,5 градусов (например, около 8,3 градусов); пик от примерно 13,8 до примерно 14,3 градусов (например, около 14,1 градусов); 2 пика от примерно 14,6 до примерно 15,5 градусов (например, около 14,8 градусов и около 15,2 градусов); пик от примерно 16,5 до примерно 16,9 градусов (например, около 16,7 градусов); 3 пика от примерно 17,6 до примерно 18,4 градусов (например, около 17,8 градусов, около 18,0 градусов и около 18,2 градусов); 2 пика от примерно 19,1 до примерно 19,7 градусов (например, около 19,3 градусов и около 19,5 градусов); 2 пика от примерно 21,4 до примерно 22,1 градусов (например, около 21,7 градусов и около 22,0 градусов); 2 пика от примерно 22,8 до примерно 23,8 градусов (например, пики около 23,0 градусов и около 23,6 градусов); 4 пика от примерно 24,5 до примерно 25,9 градусов (например, около 24,7 градусов, около 24,9 градусов, около 25,2 градусов и около 25,7 градусов); пик от примерно 26,9 до примерно 27,3 градусов (например, около 27,1 градусов); 2 пика от примерно 27,7 до примерно 28,3 градусов (например, около 27,9 градусов и около 28,1 градусов); 2 пика от примерно 29,5 до примерно 30,0 градусов (например, около 29,7 градусов и около 29,8 градусов); 2 пика от примерно 29,5 до примерно 30,0 градусов (например, около 29,7 градусов и около 29,8 градусов); пик от примерно 30,9 до примерно 31,3 градусов (например, около 31,1 градусов); пик от примерно 32,1 до примерно 32,5 градусов (например, около 32,3 градусов); 3 пика от примерно 33,2 до примерно 34,1 градусов (например, около 33,4 градусов, около 33,8 градусов и около 33,9 градусов); пик от примерно 35,0 до примерно 35,4 градусов (например, около 35,2 градусов); пик от примерно 36,0 до примерно 36,4 градусов (например, около 36,2 градусов) и 3 пика от примерно 38,3 до примерно 40,1 градусов (например, около 38,5 градусов, около 38,6 градусов и около 39,9 градусов) при рентгеновской дифракции порошка, полученной с использованием Cu K альфа-излучения.

[00096] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется картиной рентгеновской дифракции порошка, приведенной на фигуре 13.

[00097] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹³C ЯМР-спектре: пик от примерно 168,0 до примерно 168,4 м.д. (например, около 168,2 м.д.), пик от примерно 148,5 до примерно 148,9 м.д. (например, около 148,7 м.д.), пик от примерно 138,6 до примерно 139,0 м.д. (например, около 138,8 м.д.), пик от примерно 119,6 до примерно 120,0 м.д. (например, около 119,8 м.д.) и пик от примерно 23,7 до примерно 24,1 м.д. (например, около 23,9 м.д.).

[00098] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ^l3C ЯМР-спектре: пик от примерно 176,1 до примерно 176,5 м.д. (например, около 176,3 м.д.), пик от примерно 168,0 до примерно 168,4 м.д. (например, около 168,2 м.д.), пик от примерно 148,5 до примерно 148,9 м.д. (например, около 148,7 м.д.), пик от примерно 143,0 до примерно 143,4 м.д. (например, около 143,2 м.д.), пик от примерно 138,6 до примерно 139,0 м.д. (например, около 138,8 м.д.), 7 пиков от примерно 119 до примерно 134 м.д. (например, около 131,6 м.д., около 129,6 м.д., около 129,1 м.д., около 126,7 м.д., около 125,8 м.д., около 122,7 м.д. и около 119,8 м.д.), пик от примерно 112,1 до примерно 112,5 м.д. (например, около 112,3 м.д.), пик от примерно 68,8 до примерно 69,2 м.д. (например, около 69,0 м.д.), пик от примерно 66,7 до примерно 67,1 м.д. (например, около 66,9 м.д.), пик от примерно 28,1 до примерно 28,5 м.д. (например, около 28,3 м.д.) и пик от примерно 23,7 до примерно 24,1 м.д. (например, около 23,9 м.д.).

[00099] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется твердотельным ¹³C ЯМР-спектром, показанным на фигуре 17.

[000100] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется одним или большим количеством следующих пиков, измеренных в миллионных долях (м.д.), в твердотельном ¹⁹F ЯМР-спектре: пик от примерно -55,4 до примерно -55,8 м.д. (например, около -55,6 м.д.) и пик от примерно -61,8 до примерно -62,2 м.д. (например, около -62,0 м.д.).

[000101] В некоторых вариантах форма B-HCl характеризуется твердотельным ¹⁹F ЯМР-спектром, показанным на фигуре 18.

[000102] В других вариантах форма B-HCl характеризуется спектром ФП-ИК, представленным на фигуре 16.

[000103] В одном аспекте изобретение включает в качестве отличительного признака фармацевтическую композицию, содержащую форму A-HCl, форму B, форму B-HCl или любую их комбинацию и фармацевтически приемлемый адъювант или носитель.

[000104] В одном аспекте настоящее изобретение имеет в качестве отличительного признака способ лечения CFTR-опосредованного заболевания у людей, включающий введение человеку эффективного количества формы A-HCl, формы B, формы B-HCl или любой их комбинации.

[000105] В некоторых вариантах способ включает введение дополнительного терапевтического агента.

[000106] В некоторых вариантах заболевание выбрано из следующих: муковисцедоз, панкреатит, синусит, наследственная эмфизема, наследственный гемохроматоз, недостатки системы свертывания-фибринолиза, такие как дефицит белка C, наследственный ангионевротический отек типа 1, недостатки переработки липидов, такие как семейная гиперхолестеринемия, хиломикронемия типа 1, абеталипопротеинемия, лизосомные болезни накопления, такие как болезнь I-клеток/псевдо-Гурлер, мукополисахаридоз, болезнь Сандхоффа/Тея-Сакса, синдром Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатия/гиперинсулинемия, сахарный диабет, карликовость Ларона, дефицит миелопероксидазы, первичный гипопаратиреодизм, меланома, гликаноз CDG типа 1, наследственная эмфизема, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственная гипофибриногенемия, дефицит ACT, несахарный диабет (DI), нейрофизиологический DI, нефрогенный DI, синдром Шарко-Мари-Тус, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Пика, некоторые полиглутаминовые неврологические нарушения, такие как болезнь Хантингтона, спинномозговая атаксия типа I, спинальная и бульбарная мышечная атрофия, дентаторубральная паллидарная и миотоническая дистрофия, а также спонгиоформные энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Фабри, синдром Страусслера-Шейнкера, COPD, синдром «сухого глаза», недостаточность поджелудочной железы, остеопороз, остеопения, синдром Горхэма, хлоридные канлопатии, врожденная миотония (формы Томсона и Беккера), синдром Бартера типа III, болезнь Дента, гиперэкплексия, эпилепсия, гиперэкплексия, болезни лизосомного накопления, синдром Ангельмана, первичная цилиарная дискинезия (PCD), PCD с обратным расположением внутренних органов (также известная как синдром Картагенера), PCD без обратного расположения внутренних органов и цилиарная аплазия, и болезнь Шегрена.

[000107] В одном варианте настоящее изобретение касается способа лечения муковисцедоза у людей, включающего введение указанному человеку эффективного количества формы A-HCl, формы B, формы B-HCl или любой их комбинации.

[000108] В одном аспекте настоящее включает в качестве отличительного признака фармацевтическую упаковку или набор, содержащий форму A-HCl, форму B, форму B-HCl или любую комбинацию этих форм и фармацевтически приемлемый носитель.

[000109] ДРУГИЕ АСПЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[000110] Применения, препараты и введение

[000111] Фармацевтически приемлемые композиции

[000112] В одном аспекте настоящего изобретения представлены фармацевтически приемлемые композиции, причем эти композиции содержат форму A-HCl, форму B или форму B-HCl, которые здесь описаны, и необязательно содержат фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель. В некоторых вариантах эти композиции необязательно содержат еще один или более дополнительных терапевтических агентов.

[000113] Как описано выше, фармацевтически приемлемые композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель, который, как здесь используется, включает любые и все растворители, разбавители или другие жидкие наполнители, диспергирующие или суспендирующие вспомогательные средства, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загущающие или эмульгирующие агенты, консерванты, твердые связующие, лубриканты и подобные агенты, которые соответствуют конкретной требуемой дозированной форме. В работе Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) раскрыты различные носители, используемые при приготовлении фармацевтически приемлемых композиций, и известные методики их получения. За исключением случаев, когда любая общеизвестная среда-носитель несовместима с соединениями по изобретению, например, при получении нежелательного биологического эффекта или, по-другому, при пагубном взаимодействии с любым другим компонентом(ами) фармацевтически приемлемой композиции, предполагается, что ее применение входит в область данного изобретения. Некоторые примеры материалов, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничены этим, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту или сорбат калия, смеси парциальных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, калийгидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, полиакрилаты, воски, блок-полимеры полиэтилен-полиоксипропилен, ланолин, сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетатцеллюлоза; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; наполнители, такие как масло какао и воски для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли; такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновую кислоту; воду, не содержащую пирогенов; изотонический физиологический раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы, а также другие нетоксические совместимые лубриканты, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, агенты высвобождения, покрывающие агенты, подсластители, вкусовые агенты и отдушки, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композиции, согласно решению составителя.

[000114] Применения соединений и фармацевтически приемлемых композиций

[000115] Еще в одном аспекте настоящее изобретение касается способа лечения или уменьшения тяжести состояния, заболевания или нарушения, связанного с мутацией CFTR. В некоторых вариантах настоящее изобретение касается способа лечения состояния, заболевания или нарушения, связанного с дефицитом CFTR-активности, способа, включающего введение композиции, содержащей форму A-HCl, форму B, форму B-HCl или любую комбинацию этих форм, которые здесь описаны, нуждающемуся в этом субъекту, предпочтительно млекопитающему.

[000116] В некоторых вариантах настоящее изобретение касается способа лечения заболевания, связанного с пониженной функцией CFTR вследствие мутации гена, кодирующего CFTR, или факторов окружающей среды (например, дыма). Эти заболевания включают следующие: муковисцедоз, астму, вызванную дымом COPD, хронический бронхит, риносинусит, констипацию, панкреатит, недостаточность поджелудочной железы, бесплодие мужчин вследствие врожденного билатерального отсутствия семенных протоков (CBAVD), умеренная болезнь легких, идиопатический панкреатит, аллергический бронхолегочный аспергиллез (ABPA), болезнь печени, наследственная эмфизема, наследственный гемохроматоз, недостатки системы свертывания-фибринолиза, такие как дефицит белка C, наследственный ангионевротический отек типа 1, недостатки переработки липидов, такие как семейная гиперхолестеринемия, хиломикронемию типа 1, абеталипопротеинемию, лизосомные болезни накопления, такие как болезнь I-клеток/псевдо-Гурлер, мукополисахаридоз, болезнь Сандхоффа/Тея-Сакса, синдром Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатия/гиперинсулинемия, сахарный диабет, карликовость Ларона, дефицит миелопероксидазы, первичный гипопаратиреодизм, меланома, гликаноз CDG типа 1, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственную гипофибриногенемию, дефицит ACT, несахарный диабет (DI), нейрофизиологический DI, нефрогенный DI, синдром Шарко-Мари-Тус, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Пика, некоторые полиглутаминовые неврологические нарушения, такие как болезнь Хантингтона, спинномозговая атаксия типа I, спинальная и бульбарная мышечная атрофия, дентаторубральная паллидарная и миотоническая дистрофия, а также спонгиоформные энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейцфельда-Якоба (обусловленная дефектом обработки прионного белка), болезнь Фабри, синдром Страусслера-Шейнкера, COPD, синдром «сухого глаза», или болезнь Шегрена, остеопороз, остеопения, исцеление костей и рост костей (включая восстановление костей, регенерацию костей, уменьшение резорбции костей и усиление депонирования кальция в костях), синдром Горхэма, хлоридные канлопатии, такие как врожденная миотония (формы Томсена и Беккера), синдром Бартера типа III, болезнь Дента, эпилепсия, гиперэкплексия, болезни лизосомного накопления, синдром Ангельмана и первичная цилиарная дискинезия (PCD), термин для наследственных нарушений структуры и/или функции ресничек, включая PCD с обратным расположением внутренних органов (также известную как синдром Картагенера), PCD без обратного расположения внутренних органов и цилиарная аплазия.

[000117] В некоторых вариантах способ включает лечение или уменьшение тяжести муковисцедоза у пациента, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены. В некоторых вариантах пациент имеет мутантные формы человеческого CFTR. В других вариантах пациент имеет одну или более из следующих мутаций ΔF508, R117H и G551D человеческого CFTR. В одном варианте способ включает лечение или уменьшение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего ΔF508 мутацию человеческого CFTR, включающий введение указанному пациенту одну из композиций, которые здесь определены. В одном варианте способ включает лечение или уменьшение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего G551D мутацию человеческого CFTR, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены. В одном варианте способ включает лечение или уменьшение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего ΔF508 мутацию человеческого CFTR по меньшей мере в одном аллеле, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые определены здесь. В одном варианте способ включает лечение или снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего ΔF508 мутацию человеческого CFTR в обоих аллелях, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые определены здесь. В одном варианте способ включает лечение или снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего G551D мутацию человеческого CFTR по меньшей мере в одном аллеле, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые определены здесь. В одном варианте способ включает лечение или снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего G551D мутацию человеческого CFTR в обоих аллелях, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые определены здесь.

[000118] В некоторых вариантах способ включает снижение тяжести муковисцедоза у пациента, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые определены здесь. В некоторых вариантах пациент имеет мутантные формы человеческого CFTR. В других вариантах пациент имеет одну или более из следующих мутаций ΔF508, R117H и G551D человеческого CFTR. В одном варианте способ включает снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего ΔF508 мутацию человеческого CFTR, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены. В одном варианте способ включает снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего G551D мутацию человеческого CFTR, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены. В одном варианте способ включает снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего ΔF508 мутацию человеческого CFTR по меньшей мере в одном аллеле, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены. В одном варианте способ включает снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего ΔF508 мутацию человеческого CFTR в обоих аллелях, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены. В одном варианте способ включает снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего G551D мутацию человеческого CFTR по меньшей мере в одном аллеле, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены. В одном варианте способ включает снижение тяжести муковисцедоза у пациента, имеющего G551D мутацию человеческого CFTR в обоих аллелях, включающий введение указанному пациенту одной из композиций, которые здесь определены.

[000119] В некоторых аспектах изобретение касается способа лечения или снижения тяжести остеопороза у пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000120] В некоторых вариантах способ лечения или снижения тяжести остеопороза у пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000121] В некоторых аспектах изобретение касается способа лечения или снижения тяжести остеопении у пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000122] В некоторых вариантах способ лечения или снижения тяжести остеопении у пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000123] В некоторых аспектах изобретение касается способа исцеления костей и/или восстановления костей у пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000124] В некоторых вариантах способ исцеления костей и/или восстановления костей у пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000125] В некоторых аспектах изобретение касается способа уменьшения резорбции костей у пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000126] В некоторых вариантах способ уменьшения резорбции костей у пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000127] В некоторых аспектах изобретение касается способа повышения депонирования кальция в костях пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000128] В некоторых вариантах способ повышения депонирования кальция в костях пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000129] В некоторых аспектах изобретение касается способа лечения или снижения тяжести COPD у пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000130] В некоторых вариантах способ лечения или снижения тяжести COPD у пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000131] В некоторых аспектах изобретение касается способа лечения или снижения тяжести вызванной дымом COPD у пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000132] В некоторых вариантах способ лечения или снижения тяжести вызванной дымом COPD у пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000133] В некоторых аспектах изобретение касается способа лечения или снижения тяжести хронического бронхита у пациента, включающий введение указанному пациенту соединения I, которое здесь описано.

[000134] В некоторых вариантах способ лечения или снижения тяжести хронического бронхита у пациента включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая здесь описана.

[000135] В некоторых вариантах настоящее изобретение касается способа лечения заболевания, связанного с нормальной функцией CFTR. Эти заболевания включают хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), хронический бронхит, рецидивирующий бронхит, острый бронхит, риносинусит, констипацию, панкреатит, в том числе хронический панкреатит, рецидивирующий панкреатит и острый панкреатит, недостаточность поджелудочной железы, бесплодие мужчин вследствие врожденного билатерального отсутствия семенных протоков (CBAVD), умеренную болезнь легких, идиопатический панкреатит, болезнь печени, наследственную эмфизему, желчный конкремент, гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь, желудочно-кишечную злокачественность, воспалительное заболевание кишечника, констипацию, диабет, артрит, остеопороз и остеопению.

[000136] В некоторых вариантах настоящее изобретение касается способа лечения заболевания, связанного с нормальной функцией CFTR, включая наследственный гемохроматоз, недостатки системы свертывания-фибринолиза, такие как дефицит белка C, наследственный ангионевротический отек типа 1, недостатки переработки липидов, такие как семейная гиперхолестеринемия, хиломикронемия типа 1, абеталипопротеинемия, лизосомные болезни накопления, такие как болезнь I-клеток/псевдо-Гурлер, мукополисахаридоз, болезнь Сандхоффа/Тея-Сакса, синдром Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатию/гиперинсулинемию, сахарный диабет, карликовость Ларона, дефицит миелопероксидазы, первичный гипопаратиреодизм, меланому, гликаноз CDG типа 1, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственную гипофибриногенемию, дефицит ACT, несахарный диабет (DI), нейрофизиологический DI, нефрогенный DI, синдром Шарко-Мари-Тус, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Пика, некоторые полиглутаминовые неврологические нарушения, такие как болезнь Хантингтона, спинномозговую атаксию типа I, спинальную и бульбарную мышечную атрофию, дентаторубральную паллидарную и миотоническую дистрофию, а также спонгиоформные энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейцфельда-Якоба (обусловленная дефектом обработки прионного белка), болезнь Фабри, синдром Страусслера-Шейнкера, синдром Горхэма, хлоридные канлопатии, врожденная миотония (формы Томсена и Беккера), синдром Бартера типа III, болезнь Дента, гиперэкплексию, эпилепсию, гиперэкплексию, болезни лизосомного накопления, синдром Ангельмана, первичную цилиарную дискинезию (PCD), PCD с обратным расположением внутренних органов (также известную как синдром Картагенера), PCD без обратного расположения внутренних органов и цилиарную аплазию или болезнь Шегрена, включающего стадию введения указанному млекопитающему эффективного количества формы A-HCl, формы B, формы B-HCl или любой комбинации этих форм, которые здесь описаны.

[000137] Согласно альтернативному предпочтительному варианту настоящее изобретение касается способа лечения муковисцедоза, включающего стадию введения указанному млекопитающему композиции, включающего стадию введения указанному млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей форму A-HCl, форму B, форму B-HCl или любую комбинацию этих форм, описанных здесь.

[000138] Согласно изобретению "эффективное количество" формы A-HCl, формы B, формы B-HCl, любой комбинации этих форм или их фармацевтически приемлемой композиции представляет собой количество, эффективное для лечения или снижения тяжести одного или более заболеваний, нарушений или состояний, которые перечислены выше.

[000139] Форму A-HCl, форму B, форму B-HCl, любую комбинацию этих форм или их фармацевтически приемлемую композицию можно вводить, используя любое количество и любой способ введения, эффективный для лечения или снижения тяжести одного или более заболеваний, нарушений или состояний, которые перечислены выше.

[000140] В некоторых вариантах форма A-HCl, форма B, форма B-HCl или любая комбинация этих форм, или их фармацевтически приемлемая композиция полезны для лечения или снижения тяжести муковисцедоза у пациентов, которые демонстрируют остаточную CFTR-активность в апикальной мембране респираторного и нереспираторного эпителия. Наличие остаточной CFTR-активности на эпителиальной поверхности можно легко детектировать, применяя методы, известные в данной области, например, стандартные электрофизиологические, биохимические или гистохимические методики. Такими методами идентифицируют CFTR-активность, применяя in vivo или ex vivo электрофизиологические методики, измерение потовых или слюнных концентраций Cl^- или ex vivo биохимические или гистохимические методики для контроля плотности клеток на поверхности. Применяя такие методы, можно легко детектировать остаточную CFTR-активность у пациентов, гетерозиготных или гомозиготных по множеству различных мутаций, включая пациентов, гомозиготных или гетерозиготных по наиболее общей мутации ΔF508.

[000141] В другом варианте форма A-HCl, форма B, форма B-HCl или любая комбинация этих описанных здесь форм или их фармацевтически приемлемая композиция полезна для лечения или снижения тяжести муковисцедоза у пациентов, которые имеют остаточную CFTR-активность, индуцированную или увеличенную применением фармакологических методов или генной терапии. Такие методы повышают количество CFTR, присутствующего на поверхности клеток, индуцируя тем самым отсутствующую до сих пор CFTR-активность у пациента или повышая имеющийся уровень остаточной CFTR-активности у пациента.

[000142] В одном варианте форма A-HCl, форма B, форма B-HCl или любая комбинация этих описанных здесь форм, или их фармацевтически приемлемая композиция полезны для лечения или снижения тяжести муковисцедоза у пациентов в рамках определенных генотипов, демонстрирующих остаточную CFTR-активность, например, мутации класса III (ухудшенная регуляция или воротный механизм), мутации класса IV (измененная проводимость) или мутации класса V (пониженный синтез) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cystic fibrosis Tansmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapy, Current Opinion in Pulmonary Medicine 6: 521-529, 2000). Другие генотипы пациентов, которые демонстрируют остаточную CFTR-активность, включают гомозиготных пациентов по одному из этих классов или гетерозиготных по другому классу мутаций, включая мутации класса I, мутации класса II или мутацию, которая не имеет классификации.

[000143] В одном варианте форма A-HCl, форма B, форма B-HCl или любая комбинация этих описанных здесь форм, или их фармацевтически приемлемая композиция полезны для лечения или снижения тяжести муковисцедоза у пациентов в рамках определенных клинических фенотипов, например, для клинического фенотипа, от умеренного до слабого, что обычно коррелирует с количеством остаточной CFTR-активности в апикальной мембране эпителия. Такие фенотипы включают пациентов, демонстрирующих недостаточность поджелудочной железы, или пациентов с диагнозом идиопатический панкреатит и врожденное билатеральное отсутствие семенных протоков или легкая болезнь легких.

[000144] Точное необходимое количество варьируют от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести инфицирования, конкретного агента, способа его введения и подобного. Соединения по изобретению предпочтительно готовят в виде стандартной дозированной формы для простоты введения и единообразия дозировки. Используемое здесь выражение "стандартная дозированная форма" относится к физически дискретной единице агента, подходящего для лечения пациента. Однако понятно, что общее дневное потребление соединений и композиций по настоящему изобретению определяет лечащий врач в рамках области обоснованного медицинского заключения. Конкретная эффективная величина дозы для всякого конкретного пациента или организма зависит от множества факторов, включающих нарушение, подлежащее лечению, и тяжесть этого нарушения; активность конкретного применяемого соединения; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента; время введения, способ введения и скорость экскреции конкретного используемого соединения; продолжительность лечения; лекарственные средства, применяемые в комбинации или согласованно с конкретным используемым соединением, и подобные факторы, хорошо известные в медицинской науке. Используемый здесь термин "пациент" обозначает животное, предпочтительно млекопитающее и наиболее предпочтительно человека.

[000145] Фармацевтически приемлемые композиции по данному изобретению можно вводить людям и другим животным перорально, ректально, парентерально, интрацистернально, интравагинально, внутрибрюшинно, локально (в виде порошков, мазей, капель или пластырей), буккально, в виде перорального или назального спрея или подобного в зависимости от тяжести подлежащего лечению инфицирования. В некоторых вариантах соединения по изобретению можно вводить перорально или парентерально при уровнях доз от примерно 0,01 мг/кг до примерно 50 мг/кг и предпочтительно от примерно 0,5 мг/кг до примерно 25 мг/кг массы тела субъекта в день, один или более раз в день для получения желательного терапевтического эффекта.

[000146] Жидкие дозированные формы для перорального введения включают, но не ограничены этим, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных соединений жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное масло, масло зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли, жирнокислотные эфиры сорбита и их смеси. Кроме инертных разбавителей пероральные композиции могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые агенты и отдушки.

[000147] Препараты для инъекций, например, вводимые посредством инъекций стерильные водные или масляные суспензии, можно приготовить известным способом, используя подходящие диспергирующие или смачивающие агенты и суспендирующие агенты. Вводимый посредством инъекции стерильный препарат также может представлять собой вводимый посредством инъекции стерильный раствор, суспензию или эмульсию в нетоксическом парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых наполнителей и растворителей, которые можно использовать, находятся вода, раствор Рингера, U.S.P. и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя и суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в препарате для инъекций используют жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

[000148] Вводимые посредством инъекции препараты можно стерилизовать, например, фильтрацией через фильтр, задерживающий бактерии, или включая стерилизующие агенты в виде стерильных твердых композиций, которые можно растворять или диспергировать перед применением в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекций.

[000149] Для продления эффекта соединения по настоящему изобретению часто желательно замедлить абсорбцию соединения после подкожной или внутримышечной инъекции. Этого можно добиться, используя жидкую суспензию кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в воде. К тому же, скорость абсорбции соединения зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, абсорбция парентерально вводимой формы соединения происходит с задержкой при растворении или суспендировании соединения в масляном наполнителе. Вводимые посредством инъекции формы с замедленным всасыванием готовят, формируя микрокапсулированные матрицы соединения в биологически разлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения соединения к полимеру и природы конкретного используемого полимера, можно регулировать скорость высвобождения соединения. Примеры других биологически разлагаемых полимеров включают поли(сложные ортоэфиры) и поли(ангидриды). Препараты для инъекций замедленного всасывания получают также посредством включения соединения в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.

[000150] Композиции для ректального или влагалищного введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые можно получить, смешивая соединения по данному изобретению с подходящими не раздражающими наполнителями или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, который является твердым при температуре окружающей среды и жидким при температуре тела и поэтому плавится в прямой кишке или влагалищной полости и высвобождает активное соединение.

[000151] Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах активное соединение смешано по меньшей мере с одним инертным, фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат и/или a) филлерами или наполнителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, b) связующими, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, c) увлажнителями, такими как глицерин, d) разрыхлителями, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенные силикаты и карбонат натрия, e) агентами, замедляющими растворение, такими как парафин, f) ускорителями абсорбции, такими как четвертичные аммониевые соединения, g) смачивающими агентами, такими как, например, цетиловый спирт и глицеринмоностеарат, h) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и i) лубрикантами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированная форма может также содержать буферные агенты.

[000152] Твердые композиции аналогичного типа можно также применять в качестве филлеров в заполняемых мягких и твердых желатиновых капсулах, используя такие наполнители, как лактоза или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой и подобное. Можно приготовить твердые дозированные формы - таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области получения фармацевтических препаратов. Они могут необязательно содержать агенты, придающие мутность, и также могут состоять из композиции, которая высвобождает активный ингредиент(ы) только или преимущественно в определенной части кишечного тракта, необязательно с задержкой. Примеры инкапсулирующих композиций, которые можно использовать, включают полимерные вещества и воски. Твердые композиции аналогичного типа можно также использовать в качестве филлеров в заполняемых мягких и жестких желатиновых капсулах, используя такие наполнители, как лактоза или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой и подобное.

[000153] Активные соединения также могут быть в микрокапсулированном виде с одним или большим количеством наполнителей, которые упоминаются выше. Можно получить твердые дозированные формы - таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия, покрытия с регулируемым высвобождением и другие покрытия, хорошо известные в области получения фармацевтических препаратов. В таких твердых дозированных формах активное соединение может быть смешано по меньшей мере с одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие дозированные формы могут также содержать, что является обычной практикой, дополнительные вещества, отличные от инертных разбавителей, например, лубриканты для таблетирования и другие вспомогательные средства для таблетирования, такие как стеарат магния и микрокристаллическая целлюлоза. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированные формы также могут содержать буферные агенты. Они могут необязательно содержать агенты, придающие мутность, и могут также состоять из композиции, которая высвобождает активный ингредиент(ы) только или преимущественно в определенной части кишечного тракта, необязательно с задержкой. Примеры инкапсулирующих композиций, которые можно использовать, включают полимерные вещества и воски.

[000154] Дозированные формы для локального или трансдермального введения соединения по данному изобретению включают мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, порошки, растворы, спреи, средства для ингаляции или пластыри. Активный компонент смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и необходимыми консервантами или буферами, которые могут потребоваться. Предполагается, что в область данного изобретения входит также глазной препарат, ушные капли и глазные капли. Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается применение трансдермальных пластырей, которые имеют дополнительное преимущество, обеспечивая регулируемую доставку соединения в организм. Такие дозированные формы готовят посредством растворения или диспергирования соединения в подходящей среде. Можно также использовать усилители абсорбции для увеличения потока соединения через кожу. Скорость можно регулировать, либо обеспечивая мембрану, регулирующую скорость, либо диспергируя соединение в полимерной матрице или геле.

[000155] Понятно также, что форму A-HCl, форму B, форму B-HCl или любую описанную здесь их комбинацию или фармацевтически приемлемую композицию можно использовать при комбинационной терапии, а именно, форму A-HCl, форму B, форму B-HCl или любую описанную здесь их комбинацию или фармацевтически приемлемую композицию можно вводить одновременно, до или после одного или большего количества других желательных терапевтических средств или медицинских процедур. При конкретной комбинации терапий (терапевтических средств или процедур) для применения в комбинационном режиме принимают во внимание совместимость желательных терапевтических средств и/или процедур и желательного терапевтического эффекта, которого требуется достичь. Понятно также, что применяемые терапии могут достичь желательного эффекта для одного и того же нарушения (например, заявляемое соединение можно вводить одновременно с другим агентом, применяемым для лечения того же нарушения), или они могут достигать различных эффектов (например, регулировать какие-либо вредные эффекты). Используемые здесь дополнительные терапевтические агенты, которые обычно вводят с целью лечения или предотвращения конкретного заболевания или состояния, известны как "подходящие для заболевания или состояния, подлежащего лечению".

[000156] В одном варианте дополнительный агент выбран из муколитического агента, бронходилататора, антибиотика, дезинфицирующего средства, противовоспалительного агента, CFTR-модулятора, отличного от соединения по настоящему изобретению, или пищевого агента.

[000157] В одном варианте дополнительный агент представляет собой антибиотик. Полезные здесь типичные антибиотики включают тобрамицин, в том числе тобрамициновый порошок для ингаляций (TIP), азитромицин, азтреонам, в том числе аэрозольную форму азтреонама, амикацин, в том числе его липосомные препараты, ципрофлоксацин, в том числе его препараты, подходящие для введения посредством ингаляции, левофлаксацин, в том числе его аэрозольные препараты, и комбинации двух антибиотиков, например, фосфомицина и тобрамицина.

[000158] В другом варианте дополнительный агент представляет собой муколит. Полезные здесь типичные муколиты включают Pulmozyme®.

[000159] В другом варианте дополнительный агент представляет собой бронходилататор. Типичные бронходилататоры включают альбутерол, метапротенерол сульфат, пирбутерол ацетат, салметерол или тетрабулин сульфат.

[000160] В другом варианте дополнительный агент представляет собой жидкость, эффективную для восстановления поверхности легочных дыхательных путей. Такие агенты улучшают движение соли в клетки и из них, делая слизь в легочных дыхательных путях более гидратированной и, следовательно, предоставляя возможность более легкого очищения. Такие типичные агенты включают гипертонический физиологический раствор, денуфозол тетранатрий ([[(3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1-ил)-3-гидроксиоксолан-2-ил]метоксигидроксифосфорил][[[(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-диоксопиримидин-1-ил)-3,4-дигидроксиоксолан-2-ил]метокси-гидроксифосфорил]оксигидроксифосфорил]гидрофосфат) или бронхитол (препарат маннита для ингалаций).

[000161] В другом варианте дополнительный агент представляет собой противовоспалительный агент, т.е. агент, который может уменьшать воспаление в легких. Полезные здесь такие типичные агенты включают ибупрофен, докозагексаеновую кислоту (DHA), силденафил, глутатион для инъекций, пиоглитазон, гидроксихлорхин или симавастатин.

[000162] В другом варианте дополнительный агент снижает активность блокатора эпителиальных натриевых каналов (ENaC), либо непосредственно блокируя канал, либо опосредованно, модулируя протеазы, что ведет к повышению EnaC-активности (например, серинпротеазы, протеазы, активирующие каналы). Такие типичные агенты включают камостат (ингибитор трипсин-подобных протеаз), QAU145, 552-02, GS-9411, INO-4995, Aerolytic и амилорид. Дополнительные агенты, которые снижают активность блокаторов эпителиальных натриевых каналов (ENaC), можно обнаружить, например в PCT публикации № WO2009/074575, полное содержание которой включено здесь во всей своей полноте.

[000163] Среди других описанных здесь заболеваний комбинации CFTR-модуляторов, таких как форма B, форма B-HCl и форма A-HCl, и агентов, которые снижают активность EnaC, применяют для лечения синдрома Лиддла, воспалительного или аллергического состояния, в том числе муковисцедоза, первичной цилиарной дискинезии, хронического бронхита, хронической обструктивной болезни легких, астмы, ксеростомии и сухого кератоконъюнктивита, инфекций дыхательных путей (острых и хронических; вирусных и бактериальных) и карциномы легких.

[000164] Комбинации CFTR-модуляторов, таких как форма B, форма B-HCl и форма A-HCl, и агентов, которые снижают активность EnaC, полезны также для лечения заболеваний, опосредованных блокадой эпителиальных натриевых каналов, включая также заболевания, отличные от респираторных заболеваний, которые связаны с аномальной регуляцией жидкости через эпителий, возможно включающих аномальную физиологию защитных поверхностных жидкостей на поверхности, например, ксеростомию (сухой рот) или сухой кератоконъюнктивит («сухой глаз»). Кроме того, блокаду эпителиальных натриевых каналов в почке можно применять для содействия диурезу и тем самым индуцировать гипотензивный эффект.

[000165] Астма включает врожденную (неаллергическую) астму и несвойственную (аллергическую) астму, легкую степень астмы, среднюю степень астмы, тяжелую степень астмы, бронхиальную астму, астму, вызванную физическими упражнениями, профессиональную астму и астму вследствие бактериальной инфекции. Лечение астмы также следует понимать как охватывающее лечение субъектов, например, детей младше 4- или 5-летнего возраста, демонстрирующих симптомы одышки, которые имеют или могут иметь диагноз как "дети, страдающие одышкой", признанной категории пациентов, о которых основная медицинская забота, и которых в настоящее время часто идентифицируют как начинающих астматиков или астматиков на ранней фазе. (Для удобства это конкретное астматическое состояние обозначают как "синдром детской одышки"). Профилактическая эффективность при лечении астмы будет очевидна при понижении частоты или тяжести симптоматических приступов, например, острых астматических или бронхоконстрикторных приступов, улучшении легочной функции или улучшении гиперреактивности дыхательных путей. Она может дополнительно подтверждаться снижением потребности в другой симптоматической терапии, т.е. терапии для снижения или прекращения (или предполагаемого снижения или прекращения) симптоматического приступа, если таковой случается, например, противовоспалительной (например, кортикостероид) или бронходиляторной. В частности, профилактическая польза при астме может быть очевидной у субъектов, предрасположенных к "утреннему купанию". "Утреннее купание" представляет собой признанный астматический синдром, общий для значительной части астматиков, и характеризуется астматическим приступом, например, около 4-6 часов утра, т.е. в момент времени, обычно значительно удаленный от какой-либо принятой ранее симптоматической астматической терапии.

[000166] Хроническая обструктивная болезнь легких включает хронический бронхит или диспноэ, связанные с последующей эмфиземой, а также обострение гиперреактивности дыхательных путей вследствие другой лекарственной терапии, в частности, другой ингаляционной лекарственной терапии. В некоторых вариантах комбинации CFTR-модуляторов, таких как форма B, форма B-HCl и форма A-HCl, и агентов, которые снижают активность EnaC, полезны для лечения бронхита любого типа или генезиса, в том числе, например, острого, арахидинового, катарального, крупозного, хронического или гнойного туберкулезного бронхита.

[000167] В другом варианте дополнительный агент представляет собой CFTR-модулятор, отличный от формы B, формы B-HCl и формы A-HCl, т.е. агент, который оказывает эффект модулирования CFTR-активности. Такие типичные агенты включают аталурен ("PTC 124®"; 3-[5-(2-фторфенил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]бензойную кислоту), синапултид, ланковутид, депелестат (человеческий рекомбинантный ингибитор эластазы нейтрофилов), кобипростон (7-{(2R,4aR,5R,7aR)-2-[(3S)-1,1-дифтор-3-метилпентил]-2-гидрокси-6-оксооктагидроциклопента[b]пиран-5-ил}гептановую кислоту) или (3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойную кислоту. В другом варианте дополнительный агент представляет собой (3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойную кислоту.

[000168] В другом варианте дополнительный агент представляет собой пищевой агент. Такие типичные агенты включают панкрелипазу (заменитель фермента поджелудочной железы), в том числе Pancrease®, Pancreacarb®, Ultrase® или Creon®, Liprotomase® (ранее Trizytek®), Aquadeks® или глутатионовую ингаляцию. В одном варианте дополнительным пищевым агентом является панкрелипаза.

[000169] В одном варианте дополнительным агентом является CFTR-модулятор, отличный от соединения по настоящему изобретению.

[000170] Количество дополнительного терапевтического агента, присутствующего в композициях по данному изобретению, не больше количества, которое обычно вводилось бы в композицию, содержащую этот терапевтический агент в качестве единственного активного агента. Предпочтительно количество дополнительного терапевтического агента в раскрываемой в настоящее время композиции соответствует диапазону от примерно 50% до 100% количества, обычно присутствующего в композиции, содержащей этот агент в качестве единственного терапевтически активного агента.

[000171] Форму A-HCl, форму B, форму B-HCl или любую описанную здесь их комбинацию или фармацевтически приемлемую композицию также можно включить в композиции для покрытия имплантируемого медицинского устройства, такого как протезы, искусственные клапаны, трансплантаты сосудов, стенты и катетеры. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение включает композицию для покрытия имплантируемого устройства, содержащую соединение по настоящему изобретению, которое описано в общих чертах выше, и из указанных здесь классов и подклассов, и носитель, подходящий для покрытия указанного имплантируемого устройства. Еще в одном аспекте настоящее изобретение включает имплантируемое устройство с покрытием из композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению, которое описано в общих чертах выше, и из указанных здесь классов и подклассов, и носитель, подходящий для покрытия указанного имплантируемого устройства. Подходящие покрытия и общее получение имплантируемых устройств с покрытием описаны в патентах США 6099562, 5886026 и 5304121. Покрытия обычно представляют собой биосовместимые полимерные материалы, такие как гидрогельный полимер, полиметилдисилоксан, поликапролактон, полиэтиленгликоль, полимолочная кислота, этиленвинилацетат и их смеси. Для придания композициям свойств регулируемого высвобождения можно необязательно нанести поверх покрытия дополнительное покрытие из фторсиликона, полисахаридов, полиэтиленгликоля, фосфолипидов или их комбинаций.

[000172] Другой аспект изобретения касается модулирования CFTR-активности в биологическом образце или у пациента (т.е., in vitro или in vivo), причем указанный способ включает введение пациенту или контакт с указанным биологическим образцом формы A-HCl, формы B, формы B-HCl или любой описанной здесь их комбинации или их фармацевтически приемлемой композиции. Используемое здесь выражение "биологический образец" включает без ограничения клеточные культуры или их экстракты; биопсийный материал, получаемый от млекопитающего, или его экстракты; и кровь, слюну, мочу, экскременты, сперму, слезы или другие жидкости организма или их экстракты.

[000173] Модуляция CFTR в биологическом образце полезна для множества целей, что известно специалисту в данной области. Примеры таких целей включают, но не ограничены этим, изучение CFTR при биологических и патологических явлениях и сравнительную оценку новых модуляторов CFTR.

[000174] Еще один вариант касается способа модулирования активности анионного канала in vitro или in vivo, включающего стадию контакта указанного канала с формой A-HCl, формой B, формой B-HCl или любой описанной здесь их комбинацией или их фармацевтически приемлемой композицией. В предпочтительных вариантах анионный канал представляет собой хлоридный канал или бикарбонатный канал. В других предпочтительных вариантах анионный канал представляет собой хлоридный канал.

[000175] Согласно альтернативному варианту, настоящее изобретение касается способа увеличения количества функционального CFTR в мембране клетки, включающего стадию контакта указанной клетки с формой A-HCl, формой B, формой B-HCl или любой описанной здесь их комбинацией или их фармацевтически приемлемой композицией.

[000176] Согласно другому предпочтительному варианту, активность CFTR определяют, измеряя трансмембранное напряжение. Можно применять любые из известных в данной области способов измерения напряжения поперек мембраны в биологическом образце, такие как оптическое исследование мембранного напряжения или другие электрофизиологические методы.

[000177] В оптическом исследовании мембранного напряжения используют вольтаж-чувствительные FRET сенсоры, описанные Gonzalez и Tsien (смотри работы Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1995) "Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells", Biophys J 69(4): 1272-80; и Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1997); "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer", Chem Biol 4(4): 269-77), в комбинации с измерительной аппаратурой для определения изменений флуоресценции, такой как регистрирующее устройство Voltage/Ion Probe Reader (VIPR) (смотри работу Gonzalez, J. E., K. Oades и др. (1999) "Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets" Drug Discov Today 4(9): 431-439).

[000178] Эти чувствительные к напряжению исследования основаны на изменении флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) между мембранорастворимым вольтаж-чувствительным красителем DiSBAC₂(3) и флуоресцентным фосфолипидом CC2-DMPE, который присоединен к внешнему листку плазматической мембраны и действует как FRET-донор. Изменения мембранного потенциала (V_m) вызывают перераспределение отрицательно заряженных DiSBAC₂(3) через плазматическую мембрану, и, соответственно, меняется количество переноса энергии от CC2-DMPE. Изменения флуоресцентной эмиссии можно отслеживать, применяя VIPR™II, который представляет собой интегрированный жидкостной блок управления, и флуоресцентный детектор, предназначенный для управления клеточными экранами на 96- или 384-ячеечных планшетах для микротитрования.

[000179] Другой аспект настоящего изобретения касается набора для определения активности CFTR или его фрагмента в биологическом образце in vitro или in vivo, включающего (i) композицию, содержащую форму A-HCl, форму B, форму B-HCl, любую их комбинацию или любые из приведенных выше вариантов; и (ii) инструкции по a) осуществлению контакта композиции с биологическим образцом и b) измерению активности указанного CFTR или его фрагмента. В одном варианте набор дополнительно содержит инструкции по a) осуществлению контакта дополнительного соединения с биологическим образцом; b) измерению активности указанного CFTR или его фрагмента в присутствии указанного дополнительного соединения и c) сравнению активности CFTR в присутствии дополнительного соединения с активностью CFTR в присутствии формы A-HCl, формы B, формы B-HCl или любой описанной здесь их комбинации. В одном варианте стадия сравнения активности указанного CFTR или его фрагмента включает измерение плотности указанного CFTR или его фрагмента. В предпочтительных вариантах для определения плотности CFTR применяют набор.

[000180] В одном аспекте изобретение включает способ получения соединения формулы 9a

или его фармацевтически приемлемой соли, включающий взаимодействие транс-4-аминоциклогексанола с Boc-ангидридом с получением соединения формулы A

взаимодействие соединения формулы А с метансульфоновой кислотой с получением соединения формулы B

взаимодействие соединения формулы B с трифторуксусной кислотой с получением соединения формулы C

и взаимодействие соединения формулы C с гидроксидом с получением соединения формулы 9a.

[000181] В другом варианте способ дополнительно включает взаимодействие соединения формулы 9а с соляной кислотой с получением соединения формулы 9:

[000182] Для более полного понимания описанного здесь изобретения далее приведены следующие примеры. Следует понимать, что эти примеры даны только для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения данного изобретения.

[000183] ПРИМЕРЫ

[000184] Способы и материалы

[000185] XRPD (рентгеновская дифракция порошка)

[000186] Установка 1

[000187] Данные по рентгеновской дифракции порошка (XRPD) регистрировали при комнатной температуре, используя настольный рентгеновский порошковый дифрактометр Rigaku/MSC MiniFlex (Rigaku, The Woodlands, TX). Рентгеновское излучение генерируется при использовании Cu-трубки, работающей при 30 кВ и 15 мА, с K фильтром подавления. Отклоняющая щель изменяется, притом, что щель рассеяния и принимающую щель устанавливают 4,2 градусов и 0,3 мм, соответственно. Способ сканирования: фиксированное время (FT) с шагом смещения 0,02 градусов и временем 2,0 сек. Порошковый рентгеновский дифрактометр калибруют, используя стандарты сравнения: 75% содалита (Na₃Al₄Si₄O₁₂Cl) и 25% кремния (Rigaku, Cat# 2100/ALS). Используют предметный столик с шестью образцами при нулевом фоне держателей образцов (SH-LBSI511-RNDB). Порошковый образец помещают в углубление и расплющивают предметным стеклом.

[000188] Установка 2

[000189] Альтернативно, определения рентгеновской дифракции порошка проводят на дифрактометре PANalytical's X-pert Pro при комнатной температуре с излучением меди (1,54060 A). Характерная система фокусировки пучка состоит из меняющейся отклоняющей щели для обеспечения постоянной освещаемой длины на образце и на части дифрагированного пучка. Используют быстрый линейный твердофазный детектор с активным участком 2,12 градусов 2 тета, определяемым в режиме сканирования. Порошковый образец уплотняют в углублении силиконового держателя с нулевым фоном и производят вращение для достижения лучшей статистики. Определяют симметричное изображение для 4-40 градусов 2 тета при величине шага 0,017 градусов и времени шага сканирования 15,5 сек.

[000190] Установка 3

[000191] Альтернативно, данные с высоким разрешением собирают при комнатной температуре с пучком излучения ID31 (European Synchrotron Radiation Facility in Grenoble, France). Рентгеновское излучение продуцируется тремя ex-vacuum ондуляторами с 11-мм зазором. Монохроматический пучок получают посредством криогенно охлаждаемого двухкристального монохроматора (кристаллы Si(111)). Охлаждаемые водой щели определяют размер пучка, падающего на монохроматор, и монохроматического пучка, посылаемого на образец, в диапазоне 0,5-2,5 мм (по горизонтали) на 0,1-1,5 мм (по вертикали). Длина волны, используемая для эксперимента, составляет 1,29984(3) Å. Дифрактометр включает набор из девяти детекторов с вертикальным сканированием для определения интенсивности дифракции как функции 2Θ. Каждому детектору предшествует рассеивательная призма-кристалл Si(111), и детекторные каналы находятся примерно в 2° друг от друга. Этот дифрактометр способен давать очень точные дифракционные картины с высоким разрешением, с шириной пиков не выше 0,003° и точностью положений пиков порядка 0,0001°. Данные по порошковой дифракции обрабатывают и индексируют, используя Materials Studio (коэффициент отражения). Структуру определяют, используя PowderSolve коэффициент из Materials Studio. Результирующее решение оценивают на структурную жизнеспособность и впоследствии конкретизируют, применяя методику детализации Rietveld.

[000192] XPRD-спектры, описанные в примерах для формы B, регистрировали на установке 1 (фиг. 7A) или установке 2 (фиг. 7B) с описанными выше настройками. XPRD-спектры, описанные в примерах для формы B-HCl и формы A-HCl, регистрировали на установке 2 с описанными выше настройками. Кристаллическую систему, пространственную группу и размеры элементарной ячейки для формы A-HCl и формы B-HCl определяли на установке 3.

[000193] Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

[000194] Дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) выполняют, используя TA ДСК Q2000 дифференциальный сканирующий калориметр (TA Instruments, New Castle, DE). Установку калибруют по индию. Образцы массой примерно 2-3 мг отвешивают в герметические кюветы, которые опрессовывают, используя крышки с одним отверстием. Образцы для ДСК сканируют от 25°C до 315°C при скорости нагрева 10°C/мин. Данные собирают при помощи программы Termal Advantage Q Series™ и анализируют с использованием программы Universal Analysis (TA Instruments, New Castle, DE).

[000195] Термогравиметрический анализ (ТГА)

[000196] Данные термогравиметрического анализа (ТГА) собирают на термогравиметрическом анализаторе TA Q500 (TA Instruments, New Castle, DE). Образец массой примерно 3-5 мг сканируют от 25°C до 350°C при скорости нагрева 10°C/мин. Данные собирают при помощи программы Termal Advantage Q Series™ и анализируют с использованием программы Universal Analysis (TA Instruments, New Castle, DE).

[000197] ФП-ИК спектроскопия

[000198] ФП-ИК спектры собирают на спектрометре Thermo Scientific, Nicolet 6700 FT-IR при помощи быстродействующей орбитальной камеры для отбора проб (многоходового устройства, работающего в режиме ослабления общего отражения), алмазная решетка при 45 градусах. Используемая для сбора и анализа данных программа: Omnic, 7.4. Настройки сбора данных следующие:

детектор: DTGS KBr;

расщепитель пучка: Ge на KBr;

источник: EverGlo IR;

диапазон сканирования: 4000-400 см^-1;

коэффициент усиления: 8,0;

оптическое быстродействие: 0,6329 см/сек.;

щель: 100;

количество сканирований: 32; и

разрешение: 4 см^-1.

[000199] Порошковый образец помещают непосредственно на алмазный кристалл и добавляют давление, приспосабливая поверхность образца к поверхности алмазного кристалла. Получают исходный спектр и затем получают спектр образца.

[000200] Твердотельная спектроскопия ядерного магнитного резонанса

[000201] Твердотельные спектры ядерного магнитного резонанса (ТТ ЯМР) спектры получают на спектрометре Bruker с частотой на протонах 400 МГц и широким отверстием. Получают времена продольной релаксации протонов (¹Н T₁), подгоняя данные по насыщению-восстановлению детектируемых протонов к экспоненциальной функции. Эти значения используют для установки оптимальной задержки при накоплении в углеродном эксперименте с кросс-поляризацией и вращением под магическим углом (¹³C CPMAS), которую обычно устанавливают от 1,2×¹Н T₁ до 1,5×¹Н T₁. Углеродные спектры получают при времени воздействия 2 мсек, применяя линейное изменение амплитуды по протонному каналу (от 50 до 100%) и 100 кГц TPPM развязку. Типичная скорость вращения под магическим углом (MAS) составляет 15,0 кГц. Спектры фтора получают, проводя MAS прямой поляризационный эксперимент с развязкой от протонов. Применяют 100 кГц TPPM развязку. Время задержки при накоплении устанавливают ≥5×¹⁹F T₁. Время продольной релаксации фтора (¹⁹F T₁) получают, подгоняя данные по насыщению-восстановлению для фтора с развязкой от протонов к экспоненциальной функции. Для спектров углерода, а также фтора в качестве внешнего стандарта сравнения используют резонанс твердофазного адамантана в более высоком поле при 29,5 м.д. Применяя эту методику, углеродные спектры опосредованно сравнивают со спектром тетраметилсилана, сигнал при 0 м.д., и спектры фтора опосредованно сравнивают со спектром нитрометана, сигнал при 0 м.д.

[000202] Пример получения гидрохлорида 7-азабицикло[2.2.1]гептана (9)

[000203] Получение транс-4-(трет-бутоксикарбониламино)циклогексанола (A), способ 1. Карбонат натрия (920,2 г, 8,682 моль, 2 экв.) добавляют в реакционный сосуд с последующим добавлением воды (3,000 л, 6 об.) и перемешиванием. Добавляют дихлорметан (ДХМ, 4,000 л, 4 об.), а затем транс-4-аминоциклогексанол (500,0 г, 4,341 моль), получая двухфазную реакционную смесь, которую энергично перемешивают при комнатной температуре. Затем в сосуд быстро добавляют по капле раствор Boc₂O (947,4 г, 997,3 мл, 4,341 моль, 1 экв.) в ДХМ (2 об.) и результирующую реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Далее реакционную смесь фильтруют, и осадок на фильтре промывают водой (2×8 об.). Продукт сушат с отсосом, пока он не станет компактным осадком. Затем осадок сушат в вакуумной печи при 35°C в течение 24 час., получая 830 г транс-4-(трет-бутоксикарбониламино)циклогексанола (A) в виде кристаллического твердого вещества.

[000204] Получение транс-4-(трет-бутоксикарбониламино)циклогексанола (A), способ 2. Каждую из двух трехгорлых круглодонных колб на 50 л снабжают механической мешалкой и термопарой. Колбы помещают в охлаждаемый бак и затем в каждую колбу загружают воду (8,87 л) и транс-4-аминоциклогексанол (1479 г). Примерно через 10-30 мин транс-4-аминоциклогексанол растворяется, и в каждую колбу добавляют карбонат калия (1774,6 г). Примерно через 10-20 мин карбонат калия растворяется, и в каждую колбу загружают ДХМ (2,96 л). Затем добавляют в каждую колбу Boc-ангидрид (3082,6 г) в ДХМ (1479 мл) с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру при 20-30°C. Используют баню лед/вода для регулирования экзотермической реакции и ускорения добавления, которое занимает от примерно 1 до 2 час. В течение добавления образуется суспензия, и реакционные смеси оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи, пока не закончится взаимодействие вследствие исчезновения Boc-ангидрида. Затем загружают в каждую колбу гептан (6 л) и смеси охлаждают до примерно 0-5°C. Из каждой колбы собирают твердые вещества фильтрованием, используя один фильтр. Объединенные твердые вещества промывают гептаном (6 л), а затем водой (8 л). Твердые вещества загружают в котел подходящего размера, снабженный механической мешалкой. Добавляют воду (12 л) и гептан (6 л) и результирующую суспензию механически перемешивают в течение 30-60 мин. Твердые вещества собирают фильтрованием и затем промывают на фильтре водой (8 л) и гептаном (8 л), сушат на воздухе на фильтре в течение трех дней и затем сушат в вакууме при 30-35°C до постоянной массы, получая продукт в виде белого твердого вещества.

[000205] Получение транс-4-(трет- бутоксикарбониламино)циклогексилметансульфоната (B), способ 1. Колбу на 12 л обеспечивают током азота и механической мешалкой. Вводят транс-4-(трет-бутоксикарбониламино)циклогексанол (750 г, 3,484 моль), а затем тетрагидрофуран (ТГФ, 6,000 л, 8 об.) и смесь перемешивают. Добавляют триэтиламин (370,2 г, 509,9 мл, 3,658 моль, 1,05 экв.) и смесь охлаждают до 0°C. Осторожно по капле добавляют метансульфонилхлорид (419,0 г, 283,1 мл, 3,658 моль, 1,05 экв.), поддерживая температуру смеси ниже 5°C. После добавления смесь перемешивают при 0°C в течение 3 час и затем постепенно нагревают до комнатной температуры (17°C) и перемешивают в течение ночи (около 15 час). Смесь гасят водой (6 об.) и перемешивают в течение 15 мин. Добавляют этилацетат (EtOAc, 9,000 л, 12 об.) и перемешивание продолжают в течение 15 мин. Перемешивание прекращают, смесь оставляют стоять в течение 10 мин и удаляют водную фазу. Добавляют 1н HCl (6 об., 4,5 л) и продолжают перемешивание в течение 15 мин. Перемешивание прекращают и водную фазу удаляют. Добавляют 10% масс./об. NaHCO₃ (4,5 л, 6 об.) и смесь перемешивают в течение 10 мин. Перемешивание прекращают и водную фазу удаляют. Добавляют воду (6 об., 4,5 л) и смесь перемешивают в течение 10 мин. Водный слой удаляют, и органический слой окончательно фильтруют и концентрируют до 4 об. Добавляют гептан (5,5 об., 4 л) и смесь концентрируют снова досуха, получая 988 г транс-4-(трет- бутоксикарбониламино)циклогексилметансульфоната.

[000206] Получение транс-4-(трет- бутоксикарбониламино)циклогексилметансульфоната (B), способ 2. Трехгорлую круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, капельной воронкой, вводом азота, термопарой и осушающей трубкой, помещают в охлаждающий бак. Добавляют в колбу транс-4-(трет-бутоксикарбониламино)циклогексанол (2599 г, 12,07 моль, 1,0 экв.), тетрагидрофуран (ТГФ) (20,8 л) и триэтиламин (1466 г, 14,49 моль, 1,2 экв.). Смесь охлаждают на бане с водой и льдом и перемешивают. При помощи капельной воронки добавляют по капле метансульфонилхлорид (1466 г, 12,80 моль, 1,06 экв.) за 1 час. По завершении добавления охлаждающую баню удаляют и реакционную смесь перемешивают до тех пор, пока ТСХ не покажет использование исходного материала (около 30 мин). Далее реакционную смесь гасят водным раствором соляной кислоты (223 мл HCl в 6,7 л воды) и EtOAc (10,4 л). Смесь перемешивают в течение примерно 10-20 мин при температуре окружающей среды и затем переносят в делительную воронку. Слои разделяют и водный слой отбрасывают. Органический слой промывают водой (2×4,5 л), насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (1×4,5 л) и сушат над безводным сульфатом магния при перемешивании в течение 5-10 мин. Смесь фильтруют и осадок на фильтре промывают EtOAc (2×600 мл). Объединенные смывы и фильтрат концентрируют при пониженном давлении и 40°C, оставляя белое твердое вещество. Твердое вещество переносят в гептан (3 л) и охлаждают в охлаждающем баке со льдом/метанолом. Добавляют еще гептан (5 л) и смесь перемешивают при 0-5°C не менее 1 час. Далее твердые вещества собирают фильтрованием, промывают холодным гептаном (0-5°C, 2×1,3 л) и сушат в вакууме при 40°C до постоянной массы, получая указанное в заголовке соединение.

[000207] Примечание: можно использовать реактор с кожухом вместо круглодонной колбы с охлаждающим баком и бани со льдом.

[000208] Получение транс-4-аминоциклогексилметансульфоната (C), способ 1. Транс-4-(трет-бутоксикарбониламино)циклогексилметансульфонат (985 г, 3,357 моль) вводят в 3-горлую колбу на 12 л, снабженную мешалкой, в атмосфере азота и с открытым выпускным отверстием. Добавляют ДХМ (1,970 л, 2 об.) при комнатной температуре и начинают перемешивание. Медленно добавляют к смеси трифторуксусную кислоту (TFA, ТФУ) (2,844 кг, 1,922 л, 24,94 моль, 2 об.) двумя порциями, каждая по 1 л. После первого добавления смесь перемешивают в течение 30 мин, а затем производят второе добавление. Смесь перемешивают в течение ночи (15 час) при комнатной температуре, получая прозрачный раствор. Затем добавляют к реакционной смеси 2-метилтетрагидрофуран (4 об.), перемешивают смесь в течение 1 час. Далее смесь аккуратно фильтруют в вытяжном шкафу и сушат с отсосом, получая 1100 г TFA-соли транс-4-аминоциклогексилметансульфоната с избытком TFA.

[000209] Получение транс-4-аминоциклогексилметансульфоната (C), способ 2. Трехгорлую круглодонную колбу на 50 л снабжают механической мешалкой, капельной воронкой и термопарой и помещают в охлаждающий бак. В колбу добавляют транс-4-(трет- бутоксикарбониламино)циклогексилметансульфонат (3474 г, 1,0 экв.) и ДХМ (5,9 л). Результирующую суспензию перемешивают в течение 5-10 мин при температуре окружающей среды и затем медленно добавляют трифторуксусную кислоту (TFA, 5,9 л) при помощи капельной воронки за 2,5 час, регулируя результирующую экзотермическую реакцию и скорость выделения газа. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и затем охлаждают до 15-20°C, используя баню с водой и льдом. Затем добавляют 2-метилтетрагидрофуран (2-МеТГФ, 11,8 л) при помощи капельной воронки с такой скоростью, чтобы поддерживать внутреннюю температуру ниже 25°C (примерно 1,5 час). Добавление первых 4-5 л 2-МеТГФ является экзотермическим. Результирующую суспензию перемешивают в течение 1 час. Твердые вещества собирают фильтрованием и затем промывают 2-МеТГФ (2×2,2 л) и далее сушат в вакууме при температуре окружающей среды до постоянной массы, получая указанное в заголовке соединение в виде белого твердого вещества.

[000210] Получение 7-азабицикло[2.2.1]гептан гидрохлорида (9), способ 1. TFA-соль транс-4-аминоциклогексилметансульфоната (200 г, 650,9 ммоль) вводят в 3-горлую колбу на 3 л с последующим добавлением воды (2,200 л, 11 об.). Медленно добавляют NaOH (78,11 г, 1,953 моль, 3 экв.), поддерживая температуру реакционной смеси ниже 25°C и смесь перемешивают в течение ночи. Затем добавляют ДХМ (1,4 л, 7 об.) и смесь перемешивают, органический слой отделяют. Затем экстрагируют водный слой второй раз посредством ДХМ (1,4 л, 7 об.), и ДХМ-слои объединяют. Затем добавляют HCl (108,5 мл, 12M, 1,3020 моль, 2 экв.), смесь перемешивают в течение 30 мин и далее концентрируют на роторном испарителе досуха. Добавляют ацетонитрил (10 об.) и смесь концентрируют. Это повторяют 3 раза, пока следы воды не будут азеотропно удалены, получая 7-азабицикло[2.2.1]гептан гидрохлорид (9). Сырой продукт перекристаллизовывают из ацетонитрила (10 об.), получая 7-азабицикло[2.2.1]гептан гидрохлорид (9) в виде бесцветного кристаллического твердого вещества. ¹H ЯМР (ДМСО-d₆) м.д. 8,02-8,04 (д); 7,23-7,31 (м); 4,59 (с); 3,31 (с); 2,51-3,3 (м); 1,63-1,75 (м); 1,45-1,62 (м).

[000211] В качестве замечания, вместо добавления ДХМ для экстракции сырой продукт можно также перегнать при температуре около 95-97°C и дополнительно перекристаллизовать.

[000212] Получение 7-азабицикло[2.2.1]гептан гидрохлорида (9), способ 2. Трехгорлую круглодонную колбу на 50 л, снабженную механической мешалкой, капельной воронкой и термопарой, помещают в нагревательный кожух. Добавляют в колбу транс-4-аминоциклогексилметансульфонат трифторацетат (3000 г, 1 экв.) и воду (30 л). Смесь перемешивают, в то время как добавляют 50% NaOH (2343 г, 29,29 моль, 3 экв.) при помощи капельной воронки с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру ниже 25°C, так как добавление является слегка экзотермическим. По завершении добавления NaOH реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Продукт выделяют фракционированной перегонкой при температуре кипения с обратным холодильником (примерно 100°C) с температурой в верхней части 95-98°C. pH каждой фракции доводят до 2, добавляя HCl, и концентрируют при пониженном давлении при 55°C, оставляя густую пасту. Добавляют ацетонитрил (ACN 1,5 л ) и результирующую суспензию перемешивают в течение 30 мин, а затем охлаждают до 0-5°C в течение 1 час. Твердые вещества собирают фильтрованием, промывают холодным (0-5°C) ACN (2×600 мл) и сушат в вакууме при 50°C до постоянной массы.

[000213] Трехгорлую круглодонную колбу на 22 л снабжают механической мешалкой, термопарой и холодильником и помещают в нагревательный кожух. Добавляют в колбу собранные твердые вещества (2382 г), метанол (4,7 л) и 2-МеТГФ (4,7 л). Результирующую суспензию перемешивают и нагревают до кипения с обратным холодильником (примерно 65°C). Реакционную колбу переносят в охлаждающий бак и смесь перемешивают. Затем добавляют 2-МеТГФ (4,7 л) при помощи капельной воронки за 30 мин. Результирующую суспензию охлаждают до 0-5°C и перемешивают при данной температуре в течение 30 мин. Твердые вещества собирают фильтрованием, промывают холодным (0-5°C) 2-МеТГФ (2×600 мл) и затем сушат в вакууме при 55°C до постоянной массы.

[000214] Трехгорлую круглодонную колбу на 12 л, снабженную механической мешалкой, термопарой, вводом азота и холодильником, помещают в нагревательный кожух. Добавляют в колбу сырой продукт (2079 г) и ACN (6,2 л). Результирующую суспензию перемешивают и нагревают до кипения с обратным холодильником (примерно 82°C) в течение 30 мин. Колбу переносят в охлаждающий бак, и суспензию медленно охлаждают до 0-5°C и поддерживают при этой температуре в течение 1 час. Твердые вещества собирают фильтрованием, промывают холодным (0-5°C) ACN (3×600 мл) и сушат в вакууме при 55°C до постоянной массы, получая указанный в заголовке продукт.

[000215] Пример 1A: получение 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (7).

[000216] Получение диэтил 2-((2-хлор-5-(трифторметил)фениламино)метилен)малоната (4). 2-Хлор-5-(трифторметил)анилин (2) (200 г, 1,023 моль), диэтил 2- (этоксиметилен)малонат (3) (276 г, 1,3 моль) и толуол (100 мл) объединяют в атмосфере азота в 3-горлой круглодонной колбе на 1 л, снабженной холодильником Дина-Старка. Раствор нагревают при перемешивании до 140°C и поддерживают температуру в течение 4 час. Реакционную смесь охлаждают до 70°C и медленно добавляют гексан (600 мл). Результирующую суспензию перемешивают и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Твердое вещество собирают фильтрованием, промывают 10% этилацетатом в гексане (2×400 мл) и затем сушат в вакууме, получая продукт диэтил 2-((2-хлор-5-(трифторметил)фениламино)метилен)малонат (4) в виде белого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 11,28 (д, J=13,0 Гц, 1H), 8,63 (д, J=13,0 Гц, 1H), 8,10 (с, 1H), 7,80 (д, J=8,3 Гц, 1H), 7,50 (дд, J=1,5, 8,4 Гц, 1H), 4,24 (кв., J=7,1 Гц, 2H), 4,17 (кв., J=7,1 Гц, 2 H), 1,27 (м, 6H).

[000217] Получение этил 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилата (5A), способ 1. В 3-горлую колбу на 1 л загружают Dowtherm® (200 мл, 8 мл/г) и дегазируют при 200°C в течение 1 час. Растворитель нагревают до 260°C и загружают порциями за 10 мин диэтил 2-((2-хлор-5-(трифторметил)фениламино)метилен)малонат (4) (25 г, 0,07 моль). Результирующую смесь перемешивают при 260°C в течение 6,5 час и результирующий побочный продукт этанол удаляют отгонкой. Смесь оставляют медленно охлаждаться до 80°C. Медленно добавляют гексан (150 мл) за 30 мин, а затем добавляют дополнительно 200 мл гексана одной порцией. Суспензию перемешивают до достижения комнатной температуры. Твердое вещество отфильтровывают, промывают гексаном (3×150 мл) и затем сушат в вакууме, получая этил 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилат (5A) в виде желто-коричневого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 11,91 (с, 1H), 8,39 (с, 1H), 8,06 (д, J=8,3 Гц, 1H), 7,81 (д, J=8,4 Гц, 1H), 4,24 (кв., J=7,1 Гц, 2H), 1,29 (т, J=7,1 Гц, 3H).

[000218] Получение этил 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилата (5 A), способ 2. Соединение 4 (2000 г, 5,468 моль) вводят в реактор. Загружают в реактор Dowtherm (4,000 л) и дегазируют при комнатной температуре в течение ночи, продувая азотом. Затем смесь перемешивают и нагревают до 260°C. Получаемый EtOH отгоняют. За взаимодействием следят и завершают через 5,5 час, взаимодействие по существу завершается. Источник тепла удаляют, реакционную смесь охлаждают до 80°C и загружают гептан (2,000 л). Смесь перемешивают в течение 30 мин. К перемешиваемой смеси загружают гептан (6,000 л) и продолжают перемешивание в течение ночи. Твердые вещества отфильтровывают, промывают гептаном (4,000 л) и сушат в вакуумной печи при 50°C, получая соединение 6A.

[000219] Получение этил 4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоксилат (6). В 3-горлую колбу на 5 л загружают этил 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилат (5A) (100 г, 0,3 моль), этанол (1250 мл, 12,5 мл/г) и триэтиламин (220 мл, 1,6 моль). Затем загружают в сосуд 10 г 10% Pd/C (влажность 50%) при 5°C. Реакционную смесь энергично перемешивают в атмосфере водорода в течение 20 час. при 5°C, после чего реакционную смесь концентрируют до объема примерно 150 мл. Продукт этил 4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоксилат (6) берут непосредственно на следующую стадию в виде суспензии с Pd/C.

[000220] Получение 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (7). Этил 4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоксилат (6) (58 г, 0,2 моль, сырая реакционная суспензия, содержащая Pd/C) суспендируют в NaOH (814 мл 5 M, 4,1 моль) в колбе на 1 л с обратным холодильником и нагревают при 80°C в течение 18 час с последующим дополнительным нагреванием при 100°C в течение 5 час. Реакционную смесь фильтруют теплой через уплотненный целит для удаления Pd/C и целит ополаскивают 1н NaOH. Фильтрат подкисляют до примерно pH 1, получая густой белый осадок. Осадок отфильтровывают, затем ополаскивают водой и холодным ацетонитрилом. Далее твердое вещество сушат в вакууме, получая 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновую кислоту (7) в виде белого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 15,26 (с, 1H), 13,66 (с, 1H), 8,98 (с, 1H), 8,13 (дд, J=1,6, 7,8 Гц, 1H), 8,06-7,99 (м, 2H).

[000221] Пример 1B: альтернативное получение 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (7).

[000222] Получение 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (5B). Этил 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилат (5A) (1200 г, 3,754 моль) загружают в реакционный сосуд, а затем добавляют 2-пропанол (1,200 л) и воду (7,200 л) и перемешивают. Гидроксид натрия (600,6 г, 7,508 моль) и воду (1,200 л) смешивают и оставляют охлаждаться до комнатной температуры. Результирующую смесь загружают в реакционный сосуд и затем нагревают до 80°C при перемешивании в течение 3,5 час, получая темную гомогенную смесь. Еще через час добавляют при помощи капельной воронки уксусную кислоту (9,599 л 20% масс./об., 31,97 моль) за 45 мин. Реакционную смесь охлаждают при перемешивании до 22°C со скоростью 6°C/час. Результирующее твердое вещество отфильтровывают и промывают водой (3 л), получая влажный осадок (1436 г). Фильтрат сушат в вакуумной печи с продувкой азотом над Drierite®, получая 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновую кислоту (5B) в виде коричневого твердого вещества (1069 г). 8-Хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновую кислоту (5B) очищают, суспендируя в 1,5 л метаноле и перемешивая в течение 6 час. Затем ее фильтруют и сушат, получая 968,8 г очищенной 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (5B).

[000223] Получение 4-оксо-5-(трифторметилдигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (7). 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновую кислоту (5B) (18,5 г, 1,00 экв., лимитирующий реагент) загружают в реакционный сосуд и добавляют MeOH (118 мл, 6,4 об.) в инертной атмосфере при перемешивании. Добавляют в реактор метилат натрия (3,53 г, 1,00 экв.) частями за 10 мин. Смесь перемешивают до тех пор, пока все твердые вещества не окажутся в растворе (5-10 мин). Затем добавляют к реакционной смеси палладий на угле (2,7 г, 0,03 экв.). Добавляют к реакционной смеси формиат калия (10,78 г, 2 экв.), растворенный в MeOH (67 мл, 3,6 об.), за 30 мин и перемешивают в течение примерно 4,5 час при температуре окружающей среды. Взаимодействие считают завершенным, когда 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота составляет не более 1,0% относительно 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (7). Когда взаимодействие завершено, смесь фильтруют через набивку из целита (масса используемого целита составляет примерно 2 массы 8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (5B), загруженной в сосуд вначале) для удаления твердых веществ. Осадок на целите промывают MeOH (37 мл, 2 об.). Фильтрат загружают в чистый реакционный сосуд и перемешивают. К перемешиваемому раствору непрерывно загружают уксусную кислоту (7,22 мл, 2 экв.) в течение по меньшей мере 45 мин и результирующую суспензию перемешивают в течение 5-16 час. Твердое вещество отфильтровывают и осадок промывают MeOH (56 мл, 3 об.), сушат с отсосом и затем сушат в вакууме, получая продукт в виде белого/не совсем белого твердого вещества.

[000224] Альтернативно, реагент формиат калия можно заменить газообразным водородом.

[000225] Пример 2A: получение 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11A).

[000226] Получение 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептана (10A), способ 1. В колбу, содержащую гидрохлорид 7-азабицикло[2.2.1]гептана (9) (4,6 г, 34,43 ммоль), добавляют раствор 4-фтор-1-нитро-2-(трифторметил)бензола (8) (6,0 г, 28,69 ммоль) и триэтиламина (8,7 г, 12,00 мл, 86,07 ммоль) в ацетонитриле (50 мл) в атмосфере азота. Реакционную колбу нагревают при 80°C в атмосфере азота в течение 16 час. Далее реакционную смесь оставляют охлаждаться и распределяют между водой и дихлорметаном. Органический слой промывают 1M HCl, сушат над Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют досуха. Очистка методом хроматографии на силикагеле (0-10% этилацетат в гексане) дает 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептан в виде желтого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 8,03 (д, J=9,1 Гц, 1H), 7,31 (д, J=2,4 Гц, 1H), 7,25 (дд, J=2,6, 9,1 Гц, 1H), 4,59 (с, 2H), 1,69-1,67 (м, 4H), 1,50 (д, J=7,0 Гц, 4H).

[000227] Получение 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептана (10A), способ 2. 4-Фтор-1-нитро-2-(трифторметил)бензол (8) (901 г, 4,309 моль) вводят в сосуд на 30 л с кожухом вместе с карбонатом натрия (959,1 г, 9,049 моль) и ДМСО (5 л, 5,5 об.) в атмосфере азота при перемешивании. Затем добавляют в сосуд порциями 7-азабицикло[2.2.1]гептан гидрохлорид (9) (633,4 г, 4,740 моль) и постепенно повышают температуру до 55°C. За взаимодействием следят методом ВЭЖХ, и когда субстрат составляет <1% AUC, взаимодействие считается завершенным. Затем смесь разбавляют 10 объемами EtOAc и три раза промывают водой (5,5 об.). Далее концентрируют органический слой до 4 об., добавляют циклогексан и концентрируют до 4 об. Процесс добавления циклогексана и концентрирования результирующего раствора до 4 об. повторяют до удаления всего EtOAc, и общий объем в колбе составляет около 4 объемов, содержащих циклогексан. Реакционную смесь нагревают до 60°C на роторном испарителе в течение 30 мин. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры при перемешивании или вращении в течение 3 час. Все твердое вещество кристаллизуется, и раствор концентрируют досуха, получая 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептан (10A).

[000228] Получение 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептана (10A), способ 3. К 4-фтор-1-нитро-2-(трифторметил)бензолу (8), растворенному в 3 об. ДХМ, добавляют тетрабутиламмонийбромид (0,05 экв.) и 50% масс. KOH (3,6 экв.). Затем добавляют 7-азабицикло[2.2.1]гептан гидрохлорид (9) при 0-5°C. Реакционную смесь нагревают до температуры окружающей среды. За взаимодействием следят методом ВЭЖХ, и когда субстрат составляет <1% AUC, взаимодействие считается завершенным, и слои разделяют. Органический слой промывают 1M HCl, и водный слой отбрасывают. Далее органический слой промывают один раз водой, один раз насыщенным раствором соли и выпаривают. Результирующее вещество перекристаллизовывают из циклогексана при кипячении с обратным холодильником. Твердое вещество отфильтровывают, промывают циклогексаном и сушат в вакуумной печи при 45°C в атмосфере азота, получая 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2,2.l]гептан.

[000229] Получение 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11A). Колбу с загрузкой из 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептана (10A) (7,07 г, 24,70 ммоль) и 10% Pd/C (0,71 г, 6,64 ммоль) вакуумируют и затем промывают азотом. Добавляют этанол (22 мл) и монтируют реакционную колбу с водородным баллоном. После энергичного перемешивания в течение 12 час реакционную смесь продувают азотом и удаляют Pd/C фильтрованием. Фильтрат концентрируют до темного масла при пониженном давлении, масло очищают методом хроматографии на силикагеле (0-15% этилацетат в гексане), получая 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилин (11A) в виде пурпурного твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 6,95 (дд, J=2,3, 8,8 Гц, 1H), 6,79 (д, J=2,6 Гц, 1H), 6,72 (д, J=8,8 Гц, lH), 4,89 (с, 2H), 4,09 (с, 2H), 1,61-1,59 (м, 4H) и 1,35 (д, J=6,8 Гц, 4H).

[000230] Пример 2B: получение гидрохлорида 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11B).

[000231] Получение гидрохлорида 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилин (11B), способ 1. Палладий на угле (150 г, 5% масс./масс.) загружают в реактор гидрирования Бучи (емкость 20 л) в атмосфере азота, а затем добавляют 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептан (10A, 1500 г), который получают выше в примере 2A (способ 2), и 2-метилтетрагидрофуран (10,5 л, 7 об.). Затем реактор гидрирования продувают газообразным водородом и далее непрерывно подают его к смеси при давлении на 0,5 бар выше атмосферного давления. Затем смесь перемешивают при температуре от 18°C до 23°C при охлаждении кожуха сосуда. Сосуд вакуумируют, когда более не потребляется газообразный водород и когда более не происходит экзотермической реакции. Затем подают в сосуд газообразный азот при 0,5 бар и снова вакуумируют, затем делают вторую загрузку газообразного азота при 0,5 бар. Если ВЭЖХ отфильтрованной аликвоты не показывает оставшегося 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептана (10A) (например, <0,5%), реакционную смесь переносят в колбу-приемник в атмосфере азота через фильтровальную воронку с использованием целитного фильтра. Осадок на целитном фильтре промывают 2-метилтетрагидрофураном (3 л, 2 об.). Смывы и фильтрат загружают в сосуд с перемешиванием, контролем температуры и атмосферой азота. В сосуд непрерывно добавляют 4M HCl в 1,4-диоксане (1 об.) в течение 1 час при 20°C. Смесь перемешивают в течение по меньшей мере еще 10 час, фильтруют, промывают 2-метилтетрагидрофураном (2 об.) и сушат, получая 1519 г соли гидрохлорида 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11B) в виде белого кристаллического твердого вещества.

[000232] В этом примере также можно заменить растворители альтернативными. Например, вместо 2-МеТГФ можно использовать MeOH и/или EtOH.

[000233] Получение 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилин гидрохлорида (11B), способ 2. В реактор гидрирования Бучи (емкость 20 л) вводят палладий на угле (5% масс./масс., 150 г) в атмосфере азота, а затем добавляют 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептан (1500 г) и 2-метилтетрагидрофуран (10,5 л, 7 об.). Затем реактор гидрирования продувают газообразным водородом и далее непрерывно вводят его к перемешиваемой смеси при давлении на 0,5 бар, превышающем атмосферное давление. Температуру реакционной смеси поддерживают 18-23°C при охлаждении кожуха сосуда. Сосуд вакуумируют, когда более не потребляется газообразный водород и когда более не происходит экзотермическая реакция. Далее загружают в сосуд газообразный азот и снова вакуумируют, затем загружают газообразный азот при 0,5 бар. Взаимодействие считается завершенным, если ВЭЖХ отфильтрованной аликвоты демонстрирует, что 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептан не детектируется (≤0,5%). Далее реакционную смесь фильтруют через целит. Оставшуюся суспензию переносят в колбу-приемник в атмосфере газообразного азота посредством фильтровальной воронки, содержащей целитный фильтр. Осадок на целите промывают 2-метилтетрагидрофураном (3 л, 2 об.). Фильтрат и смывы переносят в сосуд, снабженный перемешивающим механизмом, с температурным контролем и атмосферой азота. В сосуд непрерывно добавляют 4M HCl в 1,4-диоксане (1 об.) в течение 1 час при 20°C. Результирующую смесь перемешивают еще в течение 10 час, фильтруют, промывают 2-метилтетрагидрофураном (2 об.) и сушат, получая 1519 г 7-[4-амино-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептан гидрохлорида (11B) в виде белого кристаллического твердого вещества.

[000234] В этом примере также можно заменить растворители альтернативными. Например, вместо 2-МеТГФ можно использовать MeOH и/или EtOH.

[000235] Пример 3A: получение N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (форма A).

[000236] К раствору 4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоновой кислоты (7) (9,1 г, 35,39 ммоль) и 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11A) (9,2 г, 35,74 ммоль) в 2-метилтетрагидрофуране (91,00 мл) добавляют при комнатной температуре циклический ангидрид пропилфосфоновой кислоты (T3P (50% раствор в этилацетате), 52,68 мл, 88,48 ммоль) и пиридин (5,6 г, 5,73 мл, 70,78 ммоль). Реакционную колбу нагревают при 65°C в течение 10 час в атмосфере азота. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляют этилацетатом и гасят насыщенным раствором Na₂CO₃ (50 мл). Слои разделяют, и водный слой еще дважды экстрагируют этилацетатом. Объединенные органические слои промывают водой, сушат над Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют до желто-коричневого твердого вещества. Сырое твердое вещество суспендируют в смеси 2:1 этилацетат-диэтиловый эфир, собирают вакуумным фильтрованием и промывают еще дважды смесью этилацетат/диэтиловый эфир, получая сырой продукт в виде светло-желтого кристаллического порошка. Этот порошок растворяют в теплом этилацетате и абсорбируют на целит. Очистка методом хроматографии на силикагеле (0-50% этилацетат в дихлорметане) дает N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамид (соединение I) в виде белого кристаллического твердого вещества формы A. ЖХ/МС m/z 496,0 [M+H]⁺, время удерживания 1,48 мин (RP-С₁₈, 10-99% CH₃CN/0,05% TFA в течение 3 мин). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 13,08 (с, 1H), 12,16 (с, 1H), 8,88 (с, 1H), 8,04 (дд, J=2,1, 7,4 Гц, 1H), 7,95-7,88 (м, 3H), 7,22 (дд, 2,5, 8,9 Гц, 1H), 7,16 (д, J=2,5 Гц, 1H), 4,33 (с, 2H), 1,67 (д, J=6,9 Гц, 4H), 1,44 (д, J=6,9 Гц, 4H).

[000237] Пример 3B: получение N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (форма A-HCl)

[000238] 2-Метилтетрагидрофуран (0,57 л, 1,0 об.) загружают в реакционный сосуд на 30 л с кожухом, а затем добавляют соль гидрохлорид 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11B) (791 г, 2,67 моль), 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновую кислоту (7) (573 г, 2,23 моль) и дополнительно 5,2 л (9,0 об.) 2-метилтетрагидрофурана. Начинают перемешивание и добавляют к реакционной смеси T3P в 2-метилтетрагидрофуране (2,84 кг, 4,46 моль) за 15 мин. Затем добавляют по капле пиридин (534,0 г, 546,0 мл, 6,68 моль) при помощи капельной воронки за 30 мин. Смесь нагревают до 45°C примерно за 30 мин и перемешивают в течение 12-15 час. Далее смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют 2-метилтетрагидрофуран (4 об., 2,29 л), а затем воду (6,9 об., 4 л), поддерживая температуру ниже 30°C. Водный слой удаляют, и органический слой дважды тщательно промывают насыщенным водным раствором NaHCO₃. Затем органический слой промывают 10% масс./масс. лимонной кислотой (5 об.) и в заключение водой (7 об.). Смесь окончательно фильтруют и переносят в другой сухой сосуд. Добавляют затравочные кристаллы гидрохлорида N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (форма A-HCl) (3,281 г, 5,570 ммоль). Барботируют газообразный HCl (10 экв.) в течение 2 час и смесь перемешивают в течение ночи. Результирующую суспензию фильтруют, промывают 2-метилтетрагидрофураном (4 об.), сушат с отсосом и сушат в печи при 60°C, получая соединение I как форму A-HCl.

[000239] На фигуре 1 показана порошковая дифрактограмма формы A-HCl.

[000240] Ниже в таблице 1 приведены типичные XRPD пики формы A-HCl.

Таблица 1
XPRD пики формы A-HCl 2-Тета (градусы) Относительная интенсивность (%) 7,1 44,3 8,2 33,3 10,8 1,5 11,7 1,5 12,1 5,8 13,7 3,3 14,1 32,1 14,7 16,9 15,0 5,7 16,1 3,0 16,4 16,9 16,6 3,7 16,8 1,9 17,6 0,6 18,7 12,4 18,9 1,9 19,7 5,4 19,8 6,9 20,3 1,5 21,2 100,0 21,7 10,6 21,9 12,3 22,2 4,0 22,8 21,9 23,4 9,8 24,6 34,3 25,0 17,9 25,2 8,6 25,9 3,6 26,5 1,5 26,9 7,0 27,5 8,3 28,0 5,3 28,3 1,6 28,7 3,5 29,0 4,8 29,2 7,5 29,8 1,40 30,1 1,8 31,0 5,4 31,3 2,6 31,9 1,7 32,3 4,6 32,4 3,7 32,8 2,3 33,3 3,9 34,3 1,8 34,5 3,6 34,7 8,7 35,3 3,0 35,6 12,7 35,6 18,9 36,1 3,2 36,8 3,3 37,2 1,7 37,8 3,1 38,5 2,8 39,1 3,1 39,7 2,3

[000241] Отдельный кристалл формы A-HCl соединения 1 определяют как имеющий моноклинную кристаллическую систему, пространственную группу P21/C и следующие размеры элементарной ячейки: a=13,6175(4) Å, b=21,614(3) Å, c=8,3941(4) Å, α=90°, β=112,303° и γ=90°.

[000242] Типичный образец формы A-HCl также оценивают посредством микроскопии.

[000243] ДСК-кривая для типичного образца формы A-HCl приведена на фигуре 2.

[000244] ТГА-кривая для типичного образца формы A приведена на фигуре 3.

[000245] Типичный образец формы A-HCl дает ФП-ИК спектр, приведенный на фигуре 4.

[000246] В таблице 2 приведены характеристические значения ФП-ИК абсорбции для формы A-HCl.

Таблица 2
Значения ФП-ИК абсорбции формы A-HCl Положение (см^-1) Интенсивность
(отражательная способность, %) 407,6 51,1 422,7 69,7 445,7 62,6 479,1 51,8 508,4 55,7 538,1 58,6 568,4 56,7 586,3 65,7 614,9 66,8 640,5 55,8 663,2 44,2 669,3 53,2 687,2 58,2 752,1 34,4 796,2 32,5 821,7 40,0 836,8 62,0 868,2 60,8 884,7 60,5 900,2 56,1 940,0 59,0 965,4 56,3 1052,4 35,1 1065,7 40,0 1109,5 23,9 1122,8 27,3 1147,7 38,8 1159,3 42,1 1212,8 37,9 1237,0 65,1 1255,3 51,4 1270,6 46,6 1300,8 47,0 1328,6 45,1 1434,1 41,6 1452,0 61,6 1521,8 40,2 1568,2 64,0 1608,8 55,2 1688,5 54,5 2256,5 68,0 2880,9 73,2 3676,3 90,5

[000247] Типичный образец формы A-HCl также анализируют методом твердотельного (ТТ) ^l3C и ¹⁹F ЯМР. Соответствующие ЯМР-спектры приведены на фигурах 5 и 6. Несколько пиков, обнаруженных в спектрах ¹³C ТТ ЯМР и ¹⁹F ТТ ЯМР, описаны ниже в таблицах 3 и 4.

Таблица 3
Пики ¹³C ТТ ЯМР для формы A-HCl Пик № Химический сдвиг (м.д.) 1 175,7 2 163,7 3 142,6 4 140,8 5 137,2 6 131,5 7 129,0 8 126,0 9 124,8 10 123,8 11 121,5 12 117,8 13 112,4 14 65,7 15 29,2 16 28,3 17 26,1

Таблица 4
Пики ¹⁹F ТТ ЯМР для формы A-HCl Пик № Химический сдвиг (м.д.) 1
2 -57,0
-60,5

[000248] Пример 4A: получение N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторометил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (формы B).

[000249] 2-Метилтетрагидрофуран (1 об.) загружают в реакционный сосуд на 30 л с кожухом, затем добавляют соль гидрохлорид 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11B) (1,2 экв.) и 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновую кислоту (7) (573 г, 2,228 моль). Загружают в сосуд дополнительное количество 2-метилтетрагидрофурана (9 об.) и начинают перемешивание. Добавляют к реакционной смеси T3P в 2-метилтетрагидрофуране (2 экв.) в течение 15-минутного периода. Быстро добавляют по капле пиридин (3 экв.), используя капельную воронку. Далее смесь нагревают при перемешивании до 45°C в течение примерно 30-минутного периода и поддерживают данную температуру примерно в течение 5 час. Смесь охлаждают до комнатной температуры. Добавляют 2-метилтетрагидрофуран (4 об.), затем медленно добавляют воду (6,9 об.) и сохраняют температуру реакционной смеси ниже 30°C. Водный слой удаляют, и органический слой дважды промывают насыщенным водным раствором NaHCO₃. Затем аккуратно промывают органический слой 10% масс./масс. лимонной кислотой (5 об.) и водой (7 об.), окончательно фильтруют и затем переносят в другой сухой сосуд. Добавляют 2-метилтетрагидрофуран (10 об.) и начинают перемешивание. Быстро добавляют по капле гептан (10 об.) при перемешивании. Смесь перемешивают в течение примерно 12-часового периода и затем подвергают вакуумному фильтрованию. Твердый осадок с фильтра вносят в другой сосуд. Загружают в сосуд воду (15 об.) и суспензию энергично перемешивают в течение 48 час и затем фильтруют. Твердый осадок промывают водой (5 об.) и сушат при 45°C до постоянной массы, получая форму B соединения I.

[000250] Порошковая дифрактограмма формы B соединения I показана на фигурах 7A и 7B.

[000251] Таблица 5: типичные XRPD пики формы B

Таблица 5
XPRD пики формы B 2 тета (градусы) Относительная интенсивность (%) 6,7 36,6 9,4 37,2 10,0 29,5 11,2 35,3 13,4 70,6 14,8 18,1 15,2 88,8 15,4 16,6 17,2 49,5 17,8 48,0 18,1 83,8 18,8 13,6 19,2 47,6 20,1 68,9 21,2 71,8 22,0 42,6 22,6 7,6 23,5 18,1 24,0 100,0 25,0 9,6 25,9 9,7 26,2 44,8 26,9 26,3 27,2 86,7 27,7 37,8 28,2 7,4 28,9 49,0 29,6 21,3 30,3 8,6 30,6 5,5 31,2 19,3 32,3 5,5 33,7 11,4 34,2 8,9 34,7 12,4 35,1 8,0 36,7 6,5 38,1 4,7 39,3 5,3

[000252] ДСК-кривая для типичного образца формы B приведена на фигуре 8.

[000253] ТГА-кривая для типичного образца формы B приведена на фигуре 9.

[000254] Типичный образец формы B дает ФП-ИК спектр, приведенный на фигуре 10.

[000255] В таблице 6 приведены характеристические значения ФП-ИК абсорбции для формы B.

Таблица 6
Значения ФП-ИК абсорбции для формы B Положение (см^-1) Интенсивность (отражательная способность, %) 406,1 78,6 435,2 93,3 450,0 91,0 464,3 87,9 473,7 84,0 490,7 81,3 505,1 81,12 531,7 81,5 565,2 79,3 586,1 80,5 603,0 75,9 642,5 77,3 66109 74,3 682,5 78,0 726,9 80,7 749,6 68,8 766,4 81,9 798,7 81,3 823,2 63,4 842,9 93,6 876,8 83,5 902,3 92,2 919,5 85,7 976,3 72,4 1045,8 71,0 1073,6 76,6 1109,0 65,5 1119,4 65,2 1139,6 58,8 1167,6 71,4 1197,9 92,0 1206,6 90,3 1227,8 81,9 1253,9 79,2 1272,8 77,9 1285,0 78,6 1301,1 74,6 1329,6 83,8 1349,7 76,6 1435,1 75,5 1466,6 78,2 1501,3 75,0 1534,8 68,4 1577,4 82,6 1620,4 83,5 1657,4 79,7 2952,5 92,2 2988,6 92,1

[000256] Типичный образец формы B также анализируют методом твердотельного ¹³C и ¹⁹F ЯМР. Соответствующие ЯМР-спектры приведены на фигурах 11 и 12. Несколько пиков, обнаруженных в спектрах ¹³C ТТ ЯМР и ¹⁹F ТТ ЯМР, описаны ниже в таблицах 7 и 8.

Таблица 7
Пики ¹³C ТТ ЯМР для формы B Пик № Химический сдвиг (м.д.) 1 175,3 2 165,3 3 145,9 4 141,4 5 132,9 6 126,8 7 123,5 8 117,4 9 113,4 10 58,3 11 29,2 12 26,9

Таблица 8
Пики ¹⁹F ТТ ЯМР для формы B Пик № Химический сдвиг (м.д.) 1
2 -56,1
-62,1

[000257] Отдельный кристалл формы B соединения 1 устанавливают на рамке MicroMount и центрируют в дифрактометре, который снабжен запечатанной медной рентгеновской трубкой и детектором Apex II CCD. Сначала получают 3 набора из 40 кадров для определения предварительной элементарной ячейки. Впоследствии получают полный набор данных, включающий 15 сканирований и 6084 кадров. Сбор данных осуществляют при комнатной температуре. Данные объединяют и масштабируют, используя программу Apex II от Bruker AXS. В результате объединения и масштабирования получают 6176 отражений, 2250 из которых являются однозначными. Структуру решают прямыми способами в пространственной группе P21/C, используя программу SHELXTL. Проводят детализацию способом наименьших квадратов для полной матрицы на F2, используя также программу SHELXTL. При детализации используют все 392 параметра, получая отношение отражений к параметрам 5,74. Финальный коэффициент детализации составляет wR2=0,0962 и R1=0,0682 (wR2=0,0850 и R1=0,0412 для отражений с I>2 сигма(I).

[000258] Отдельный кристалл N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида в форме B определяют как имеющий моноклинную кристаллическую систему, пространственную группу P21/C и следующие размеры элементарной ячейки: a=13,5429(4) Å, b=13,4557(4) Å, c=12,0592(4) Å, α=90°, β=101,193° и γ=90°.

[000259] Пример 4B: получение N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (форма B-HCl)

[000260] В атмосфере азота загружают 100 мл 2-метилтетрагидрофурана в 3-горлую колбу, снабженную мешалкой. Добавляют в колбу форму A-HCl соединения I (55 г, 0,103 моль), затем 349 мл 2-метилтетрагидрофурана и начинают перемешивание. Добавляют в колбу 28 мл воды и колбу нагревают до внутренней температуры 60°C и перемешивают в течение 48 час. Колбу охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение 1 час. Реакционную смесь подвергают вакуумному фильтрованию, пока осадок на фильтре не станет сухим. Твердый осадок на фильтре дважды промывают 2-метилтетрагидрофураном (4 об.). Твердый осадок на фильтре оставляют с вакуумным отсосом примерно на 30 мин и переносят на сушильный лоток. Осадок с фильтра сушат в вакууме при 60°C, получая форму B-HCl в виде белого кристаллического твердого вещества.

[000261] Порошковая дифрактограмма формы B-HCl показана на фигуре 13.

[000262] Ниже, в таблице 9 приведены типичные XRPD пики формы B-HCl.

Таблица 9
XPRD пики формы B 2 тета (градусы) Относительная интенсивность (%) 8,3 93,7 9,0 8,4 10,9 0,8 11,4 1,4 13,0 4,9 14,1 19,8 14,8 32,7 15,2 12,6 16,7 23,8 17,8 37,8 18,0 90,0 18,2 28,6 19,3 19,0 19,5 17,5 19,9 2,7 20,4 9,4 20,6 6,2 21,7 41,2 22,0 22,2 23,0 100,0 23,6 20,5 23,9 4,0 24,1 3,9 24,5 9,2 24,7 13,0 24,9 31,9 25,2 22,6 25,7 12,6 26,1 3,3 26,7 4,5 27,1 21,3 27,9 10,6 28,1 18,7 28,5 4,3 28,7 5,8 29,7 11,1 29,8 14,2 30,1 4,0 30,5 8,2 31,1 30,2 31,5 9,1 32,3 11,4 32,8 3,8 33,1 9,2 33,4 11,3 33,8 11,1 33,9 10,1 34,1 5,6 34,6 8,5 34,9 6,4 35,2 10,8 36,0 4,1 36,2 13,2 36,4 4,7 37,2 5,9 37,6 3,7 37,9 2,2 38,2 7,5 38,5 22,3 38,6 13,8 39,9 10,7

[000263] Отдельный кристалл формы B-HCl соединения 1 определяют как имеющий моноклинную кристаллическую систему, пространственную группу P2₁/a и следующие размеры элементарной ячейки: a=12,57334(5) Å, b=19,68634(5) Å, c=8,39399(5) Å, α=90°, β=90,0554° и γ=90°.

[000264] Типичный образец формы B-HCl также оценивают посредством микроскопии.

[000265] ДСК-кривая для типичного образца формы B-HCl приведена на фигуре 14.

[000266] ТГА-кривая для типичного образца формы B-HCl приведена на фигуре 15.

[000267] Типичный образец формы B-HCl дает ФП-ИК спектр, приведенный на фигуре 16.

[000268] В таблице 10 приведены характеристические величины ФП-ИК абсорбции для формы B-HCl.

Таблица 10
Значения ФП-ИК абсорбции для формы B-HCl Положение (см^-1) Интенсивность (отражательная способность, %) 406,3 48,8 428,2 70,9 453,1 66,8 478,2 52,3 507,5 59,5 537,8 58,9 563,8 51,8 585,3 63,9 610,1 56,4 641,1 50,5 664,7 44,8 694,5 60,2 740,0 52,2 763,5 40,3 797,8 49,9 809,9 47,5 833,6 34,0 874,2 48,7 888,5 47,7 907,6 56,1 936,0 62,1 969,6 57,1 1051,0 39,2 1070,2 44,3 1113,2 30,4 1126,7 26,9 1142,4 39,3 1166,0 53,4 1208,0 56,3 1233,6 49,7 1254,4 50,8 1270,7 47,3 1291,5 47,6 1328,3 50,5 13558 58,6 1372,4 67,3 1434,1 43,3 1463,9 48,0 1520,9 33,0 1574,4 56,8 1612,6 60,1 1653,8 61,0 2709,5 63,0 2994,4 68,3

[000269] Форму B-HCl также анализируют методом твердотельного ¹³C и ¹⁹F ЯМР. Соответствующие ЯМР-спектры приведены на фигурах 17 и 18. Несколько пиков, обнаруженных в спектрах ¹³C ТТ ЯМР и ^l9F ТТ ЯМР приведены в таблицах 11 и 12.

Таблица 11
Пики ¹³C ТТ ЯМР для формы B-HCl Пик № Химический сдвиг (м.д.) 1 176,3 2 168,2 3 148,7 4 143,2 5 138,8 6 131,6 7 129,6 8 129,1 9 126,7 10 125,8 11 122,7 12 119,8 13 112,3 14 69,0 15 66,9 16 28,3 17 23,9

Таблица 12
Пики ¹⁹F ТТ ЯМР для формы B-HCl Пик № Химический сдвиг (м.д.) 1
2 -55,6
-62,0

[000270] Пример 4C: альтернативное получение N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (форма B-HCl).

[000271] Форму A-HCl (14,638 г, 27,52 ммоль) загружают в круглодонную колбу на 100 мл. Добавляют EtOH (248,9 мл) и воду (27,82 мл). Белую суспензию нагревают до кипения с обратным холодильником. Получают прозрачный раствор при 77°C. Реакционную смесь охлаждают до 45°C и оставляют перемешиваться на 30 мин и затем охлаждают до 20°C. Смесь оставляют перемешиваться еще на 3 час при 20°C. Продукт отфильтровывают и осадок промывают EtOH. Твердое вещество сушат в вакуумной печи при 45°C с продувкой азотом, получая форму B-HCl соединения I в виде белого твердого вещества. XRPD анализ подтверждает идентичность твердого вещества с формой B-HCl.

[000272] Отметим, что можно использовать другие комбинации растворителей, например, MeOH/H₂0 и IPA/H₂O или подобные, вместо EtOH/H₂O, как описано в данном примере. Примеры альтернативных комбинаций растворителей приведены в таблице 13.

Таблица 13
Другие растворители, которые можно использовать для получения формы B-HCl Растворитель Объем растворителя Т°С MeOH
MeOH:H₂O
MeOH:H₂O
MeOH:H₂O
MeOH:H₂O 10
10:0,2
10:0,5
10:1
10:1,5 60
60
60
60
60 IPA:H₂O
IPA:H₂O
MeOH:H₂O 10:1
10:1,5
10:1 75
75
65 EtOH
EtOH:H₂O
EtOH:H₂O
EtOH:H₂O
EtOH:H₂O 10
10:0,2
10:0,5
10:1
10:1,5 70
70
70
70
70

[000273] Еще одно замечание, в примерах 3A, 3B и 4A-4C можно использовать в качестве растворителя EtOAC вместо 2-МеТГФ.

[000274] Исследования с целью детектирования и измерения ΔF508-CFTR потенцирующих свойств соединений

[000275] Оптические методы определения мембранного потенциала для исследования ΔF508-CFTR модулирующих свойств соединений

[000276] В исследовании применяют флуоресцентные, чувствительные к напряжению красители для определения изменений в мембранном потенциале с использованием флуоресцентного планшет-ридера (например, FLIPR III, Molecular Devices, Inc.) в качестве устройства вывода данных для повышения функционального ΔF508-CFTR в клетках NIH 3T3. Движущей силой для отклика является создание градиента хлорид иона в сопряжении с активацией каналов на отдельной стадии добавления жидкости после предварительной обработки клеток соединениями и последующей загрузки чувствительного к напряжению красителя.

[000277] Идентификация потенцирующих соединений

[000278] Для идентификации ΔF508-CFTR потенцирующих средств разработан вид исследования с двойным добавлением HTS. В данном HTS исследовании используют флуоресцентные чувствительные к напряжению красители для определения изменений мембранного потенциала на FLIPR IIΙ в качестве меры усиления при воротном механизме (проводимости) ΔF508 CFTR в температурно-скорректированных ΔF508 CFTR NIH 3T3 клетках. Движущей силой для отклика является градиент Cl^- ионов в сопряжении с активацией каналов форсколином на отдельной стадии добавления жидкости с использованием флуоресцентного планшет-ридера, такого как FLIPR III, после предварительной обработки клеток потенцирующими соединениями (или контрольным наполнителем - ДМСО) и последующей загрузки перераспределяющего красителя.

[000279] Растворы

[000280] Раствор для обработки № 1: (в мМ) NaCl 160, KCl 4,5, CaCl₂ 2, MgCl₂ 1, HEPES 10, pH 7,4 с NaOH.

[000281] Альтернатива раствору для обработки № 1 включает раствор для обработки, в котором соли хлориды заменены на соли глюконаты.

[000282] Клеточные культуры

[000283] Для оптических измерений мембранного потенциала используют NIH3T3 мышиные фибробласты, стабильно экспрессирующие ΔF508-CFTR. Клетки выдерживают при 37°C, 5% CO₂ и 90% влажности в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 2 мМ глютамина, 10% фетальной бычьей сывороткой, 1 X NEAA, β-ΜΕ, 1 X Pen/Strep и 25 мМ HEPES, в 175-см² склянках для культур. Для всех оптических исследований клетки высевают с плотностью ~20000/ячейка на 384-ячеечные планшеты, покрытые матригелем, и культивируют в течение 2 час при 37°C до культивирования при 27°C в течение 24 час с целью исследования потенцирующего средства. Для коррекционных исследований клетки культивируют при 27°C или 37°C с соединениями или без них в течение 16-24 час.

[000284] Электрофизиологические исследования с целью изучения ΔF508-CFTR модулирующих свойств соединений.

[000285] 1. Исследование с камерой Уссинга

[000286] С целью дополнительной характеристики модуляторов ΔF508-CFTR, идентифицируемых в оптических исследованиях, проводят эксперименты с камерой Уссинга на поляризованных эпителиальных клетках дыхательных путей, экспрессирующих ΔF508-CFTR. Выделяют не-CF и CF эпителий дыхательных путей из бронхиальной ткани, культивируемой, как описано ранее (Galietta, L.J.V., Lantero, S., Gazzolo, A., Sacco, O., Romano, L., Rossi, G.A., & Zegarra-Moran, O. (1998) In Vitro Cell. Dev. Biol. 34, 478-481), и высевают на фильтры Costar® Snapwell™, которые предварительно покрывают NIH3T3-кондиционированной средой. Через четыре дня апикальную среду удаляют и перед применением выращивают клетки на поверхности раздела воздух-жидкость в течение >14 дней. В результате этого получают монослой полностью дифференциированных цилиндрических клеток, которые являются реснитчатыми, что характеристично для эпителия дыхательных путей. Выделяют не-CF HBE из организма некурильщиков, которые не имеют никакой известной болезни легких. CF-HBE выделяют из организма пациентов гомозиготных по ΔF508-CFTR.

[000287] Вставки клеточных культур HBE, выращенных на Costar® Snapwell™, укрепляют в камере Уссинга (Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA) и определяют трансэпителиальное сопротивление и ток короткого замыкания в присутствии базолатерально-апикального градиента Cl^- (I_sc), применяя систему фиксации напряжения (Department of Bioengineering, University of Iowa, IA). Кратко говоря, HBE исследуют в условиях фиксации напряжения (V_hold=0 мВ) при 37°C. Базолатеральный раствор содержит (в мМ) 145 NaCl, 0,83 K₂HPO₄, 3,3 KH₂PO₄, 1,2 MgCl₂, 1,2 CaCl₂, 10 глюкозы, 10 HEPES (pH доводят до 7,35 при помощи NaOH), и апикальной раствор содержит (в мМ) 145 Na-глюконата, 1,2 MgCl₂, 1,2 CaCl₂, 10 глюкозы, 10 HEPES (pH доводят до 7,35 при помощи NaOH).

[000288] Идентификация потенцирующих соединений

[000289] В типичном протоколе применяют базолатерально-апикальный мембранный градиент концентрации Cl^-. Для установки этого градиента используют нормальный раствор Рингера на базолатеральной мембране, тогда как апикальный NaCl заменяют эквимолярным глюконатом натрия (титруют до pH 7,4 посредством NaOH), получая большой градиент концентрации Cl^- поперек эпителия. Добавляют форсколин (10 мкМ) и все другие исследуемые соединения с апикальной стороны вставок клеточных культур. Эффективность предполагаемых ΔF508-CFTR потенцирующих средств сравнивают с эффективностью известного потенцирующего средства генистеина.

[000290] 2. Пэтч-кламп регистрация

[000291] Следят за общим током Cl^- в ΔF508-NIH3T3 клетках, применяя конфигурацию регистрации в виде перфорированной накладки, как описано ранее (Rae, J., Cooper, K., Gates, P., & Watsky, M. (1991) J. Neurosci. Methods 37, 15-26). Регистрацию в режиме фиксации напряжения проводят при 22°C, используя пэтч-кламп усилитель Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, CA). Раствор в пипетке содержит (в мМ) 150 N-метил-D-глюкамина (NMDG)-Cl, 2 MgCl_2, 2 CaCl₂, 10 EGTA, 10 HEPES и 240 мкг/мл амфотерицина-B (pH доводят до 7,35 при помощи HCl). Внеклеточная среда содержит (в мМ) 150 NMDG-Cl, 2 MgCl₂, 2 CaCl₂, 10 HEPES (pH доводят до 7,35 при помощи HCl). Генерацию импульсов, накопление данных и анализ проводят, используя ПК с интерфейсом Digidata 1320 A/D в сопряжении с Clampex 8 (Axon Instruments Inc.). Для активации ΔF508-CFTR добавляют в кювету 10 мкМ форсколина и 20 мкМ генистеина и контролируют соотношение ток-напряжение каждые 30 сек.

[000292] Идентификация потенцирующих соединений

[000293] Способность ΔF508-CFTR потенцирующих средств стабильно увеличивать микроскопический ΔF508-CFTR ток Cl^- в клетках NIH3T3, экспрессирующих ΔF508-CFTR, также исследуют, используя методики регистрации с перфорированной накладкой. Потенцирующие средства идентифицируют по вызываемому в оптических исследованиях зависимому от дозы увеличению IΔ_F508 с одинаковой силой и эффективностью, наблюдаемому при оптических исследованиях. Во всех исследованных клетках потенциал реверсии до и во время применения потенцирующего средства составляет величину около -30 мВ, что соответствует рассчитанному EQ (-28 мВ).

[000294] Клеточная культура

[000295] Для регистрации клеток в целом используют NIH3T3 мышиные фибробласты, стабильно экспрессирующие ΔF508-CFTR. Клетки выдерживают при 37°C, 5% CO₂ и 90% влажности в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 2 мМ глютамина, 10% фетальной бычьей сывороткой, 1 X NEAA, β-ΜΕ, 1 X Pen/Strep и 25 мМ HEPES, на 175-см² склянках для культивирования. Для регистрации клеток в целом высевают 2500-5000 клеток на стеклянные покровные стекла, покрытые поли-1-лизином и культивируют в течение 24-48 час при 27°C до применения тестируемой активности потенцирующих средств; и инкубируют с корректирующим соединением и без него при 37°C для определения активности корректирующих веществ.

[000296] 3. Регистрации отдельных каналов

[000297] Наблюдают активность воротного механизма wt-CFTR и скорректированных по температуре ΔF508-CFTR, экспрессированных в NIH3T3 клетках, производя регистрацию с использованием накладки из вырезанной вывернутой наизнанку мембраны, как описано ранее (Dalemans, W., Barbry, P., Champigny, G., Jallat, S., Dott, K., Dreyer, D., Crystal, R.G., Pavirani, A., Lecocq, J-P., Lazdunski, M. (1991) Nature 354, 526-528), применяя Axopatch 200B пэтч-кламп усилитель (Axon Instruments Inc.). Пипетка содержит (в мМ): 150 NMDG, 150 аспарагиновой кислоты, 5 CaCl₂, 2 MgCl₂ и 10 HEPES (pH доводят до 7,35 при помощи Tris-основания). Кювета содержит (в мМ): 150 NMDG-Cl, 2 MgCl₂, 5 EGTA, 10 TES и 14 Tris-основания (pH доводят до 7,35 при помощи HCl). После иссечения wt- и ΔF508-CFTR активируют, добавляя 1 мМ Mg-АТФ, 75 нМ каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы (PKA; Promega Corp. Madison, WI) и 10 мМ NaF для ингибирования протеинфосфатаз, которые предотвращают снижение тока. Потенциал пипетки поддерживают при 80 мВ. Активность канала анализируют по мембранным накладкам, содержащим ≤2 активных каналов. Максимальное количество одновременных открытий определяет количество активных каналов в течение эксперимента. Для определения амплитуды тока одного канала данные, зарегистрированные из 120 сек ΔF508-CFTR активности, фильтруют автономно при 100 Гц и затем используют для составления полных гистограмм амплитуд, которые подгоняют к мультигауссовым функциям, используя программу Bio-Patch Analysis (Bio-Logic Comp. France). Общий микроскопический ток и вероятность открытия (P_o) определяют из 120 сек активности каналов. P_o определяют, используя программу Bio-Patch или из соотношения P_o=I/i(N), где I=средний ток, i=амплитуда тока одного канала и N=количество активных каналов в накладке.

[000298] Клеточная культура

[000299] При пэтч-кламп регистрации для вырезанной мембраны используют NIH3T3 мышиные фибробласты, стабильно экспрессирующие ΔF508-CFTR. Клетки выдерживают при 37°C, 5% CO₂ и 90% влажности в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 2 мМ глютамина, 10% фетальной бычьей сывороткой, 1 X NEAA, β-ΜΕ, 1 X Pen/Strep и 25 мМ HEPES, в 175-см² склянках для культур. Для регистрации одного канала высевают 2500-5000 клеток на стеклянные покровные стекла, покрытые поли-1-лизином, и культивируют в течение 24-48 час при 27°C перед использованием.

[000300] Форма соединения I полезна в качестве модулятора АТФ-связывающих кассетных транспортеров. Определено, что EC₅₀ (мкм) формы соединения I составляет менее 2,0 мкΜ. Рассчитана эффективность формы соединения I, которая составляет от 100% до 25%. Следует отметить, что 100% эффективность соответствует максимальному отклику, полученному для 4-метил-2-(5-фенил-1H-пиразол-3-ил)фенола.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым твердым формам N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (формы A-HCl, формы B, формы B-HCl). Также изобретение относится к фармацевтической композиций на основе формы A-HCl, или формы B, или формы B-HCl, или их комбинации; к способу лечения заболеваний, вызванных мутацией в CFTR; к способу модулирования CFTR-активности в биологическом образце. Технический результат: получены новые стабильные твердые формы N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, обладающие биологической активностью. 10 н. и 22 з.п. ф-лы, 24 ил., 13 табл., 8 пр.

1. N-(4-(7-Азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамид, охарактеризованный как форма А-HCl, где форма А-HCl характеризуется одним или большим количеством пиков на картине рентгеновской дифракции порошка, выбранных из группы, включающей пик около 7,1 градусов, пик около 21,2 градусов, пик в области от примерно 6,9 до примерно 7,3 градусов, пик в области от примерно 8,0 до примерно 8,4 градусов, пик в области от примерно 13,9 до примерно 14,3 градусов, пик в области от примерно 21,0 до примерно 21,4 градусов, пик в области от примерно 14,5 до примерно 14,9 градусов, пик в области от примерно 16,2 до примерно 16,6 градусов, пик в области от примерно 18,5 до примерно 18,9 градусов и пик в области от примерно 22,6 до примерно 23,0 градусов; или
где форма А-HCl характеризуется отдельным кристаллом, который определяют как имеющий моноклинную кристаллическую систему; пространственную группу P2₁/c и следующие размеры элементарной ячейки:
а=13,6175(4) Å;
b=21,614(3) Å;
с=8,3941(4) Å;
α=90°;
β=112,303°; и
γ=90°.

2. Форма А-HCl по п.1, где форма А-HCl характеризуется пиком в области от примерно 6,9 до примерно 7,3 градусов, пиком в области от примерно 8,0 до примерно 8,4 градусов, пиком в области от примерно 13,9 до примерно 14,3 градусов и пиком в области от примерно 21,0 до примерно 21,4 градусов на картине рентгеновской дифракции порошка.

3. Форма А-HCl по п.1, где форма А-HCl характеризуется одним или большим количеством пиков в ¹³С ЯМР-спектре, выбранных из группы, включающей пик около 163,7 м.д., пик около 137,2 м.д. и пик около 121,5 м.д.

4. Форма А-HCl по п.3, где форма А-HCl характеризуется пиком около 163,7 м.д., пиком около 137,2 м.д. и пиком около 121,5 м.д. в ¹³С ЯМР-спектре.

5. Форма А-HCl по п.1, где форма А-HCl характеризуется одним или большим количеством пиков в ¹⁹F ЯМР-спектре, выбранных из группы, включающей пик около -57,0 м.д., и пик около -60,5 м.д.

6. Фармацевтическая композиция, обладающая модулирующей CFTR-активностью, содержащая форму А-HCl по п.1 и фармацевтически приемлемый адъювант или носитель.

7. N-(4-(7-Азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамид, охарактеризованный как форма В, где форма В характеризуется одним или большим количеством пиков на картине рентгеновской дифракции порошка, выбранных из группы, включающей пик в области от примерно 6,5 до примерно 6,9 градусов, пик в области от примерно 9,2 до примерно 9,6 градусов, пик в области от примерно 11,0 до примерно 11,4 градусов, пик в области от примерно 13,2 до примерно 13,6 градусов, пик в области от примерно 15,0 до примерно 15,4 градусов, пик в области от примерно 17,0 до примерно 17,4 градусов, пик в области от примерно 17,6 до примерно 18,0 градусов, пик в области от примерно 17,9 до примерно 18,3 градусов, пик в области от примерно 19,1 до примерно 19,5 градусов, пик в области от примерно 19,9 до примерно 20,3 градусов, пик в области от примерно 21,0 до примерно 21,5 градусов, пик в области от примерно 21,8 до 22,2 градусов, пик в области от примерно 23,8 до примерно 24,2 градусов, пик в области от примерно 26,0 до примерно 26,4 градусов, пик в области от примерно 27,1 до примерно 27,5 градусов, пик в области от примерно 27,5 до примерно 27,9 градусов и пик в области от примерно 28,7 до примерно 29,1 градусов; или где форма В характеризуется пиком в области от примерно 6,5 до примерно 6,9 градусов; пиком в области от примерно 9,8 до примерно 10,2 градусов; пиком в области от примерно 11,0 до примерно 11,4 градусов; пиком в области от примерно 13,2 до примерно 13,6 градусов и пиком в области от примерно 23,8 до примерно 24,2 градусов на картине рентгеновской дифракции порошка; или
где форма В характеризуется отдельным кристаллом, определенным как имеющий моноклинную кристаллическую систему, пространственную группу P2₁/c и следующие размеры элементарной ячейки:
а=13,5429(4) Å;
b=13,4557(4) Å;
с=12,0592(4) Å;
α=90°;
β=101,193°; и
γ=90°.

8. Форма В по п.7, где форма В характеризуется пиком в области от примерно 6,5 до примерно 6,9 градусов; пиком в области от примерно 9,8 до примерно 10,2 градусов; пиком в области от примерно 11,0 до примерно 11,4 градусов; пиком в области от примерно 13,2 до примерно 13,6 градусов и пиком в области от примерно 23,8 до примерно 24,2 градусов на картине рентгеновской дифракции порошка.

9. Форма В по п.7, где форма В характеризуется пиком около 6,7 градусов; пиком около 10,0 градусов; пиком около 11,2 градусов; пиком около 13,4 градусов и пиком около 24,2 градусов на картине рентгеновской дифракции порошка.

10. Форма В по п.7, где форма В характеризуется одним или большим количеством пиков в ¹³С ЯМР-спектре, выбранных из группы, включающей пик около 165,3 м.д., пик около 145,9 м.д., пик около 132,9 м.д. и пик около 113,4 м.д.

11. Форма В по п.10, где форма В характеризуется пиком около 165,3 м.д., пиком около 145,9 м.д., пиком около 132,9 м.д. и пиком около 113,4 м.д. в ¹³С ЯМР-спектре.

12. Форма В по п.7, где форма В характеризуется одним или большим количеством пиков в ¹⁹F ЯМР-спектре, выбранных из группы, включающей пик около -56,1 м.д. и пик около -62,1 м.д.

13. Фармацевтическая композиция, обладающая модулирующей CFTR-активностью, содержащая форму В по п.7 и фармацевтически приемлемый адъювант или носитель.

14. N-(4-(7-Азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамид, охарактеризованный как форма В-HCl, где форма В-HCl характеризуется одним или большим количеством из следующих пиков: пик в области от примерно 8,1 до примерно 8,5 градусов, пик в области от примерно 14,6 до примерно 15,1 градусов, пик в области от примерно 16,5 до примерно 16,9 градусов, 3 пика в области от примерно 17,6 до примерно 18,4 градусов, 2 пика в области от примерно 21,4 до примерно 22,1 градусов, 2 пика в области от примерно 22,8 до примерно 23,8 градусов, 2 пика в области от примерно 24,7 до примерно 25,4 градусов, пик в области от примерно 26,1 до примерно 27,3 градусов, пик в области от примерно 30,9 до примерно 31,3 градусов и пик в области от примерно 38,2 до примерно 38,7 градусов; или
где форма В-HCl характеризуется пиком в области от примерно 8,1 до примерно 8,5 градусов; пиком в области от примерно 8,8 до примерно 9,2 градусов; пиком в области от примерно 12,8 до примерно 13,2 градусов; пиком в области от примерно 17,8 до примерно 18,2 градусов и пиком в области от примерно 22,8 до примерно 23,2 градусов на картине рентгеновской дифракции порошка; или
где форма В-HCl характеризуется отдельным кристаллом, определенным как имеющий моноклинную кристаллическую систему, пространственную группу P2₁/a и следующие размеры элементарной ячейки:
а=12,57334 (5) Å;
b=19,68634(5) Å;
c=8,39399(5) Å;
α=90°;
β=90,0554°; и
γ=90°.

15. Форма В-HCl по п.14, где форма В-HCl характеризуется пиком в области от примерно 8,1 до примерно 8,5 градусов, пиком в области от примерно 14,6 до примерно 15,1 градусов, пиком в области от примерно 16,5 до примерно 16,9 градусов, 3 пиками в области от примерно 17,6 до примерно 18,4 градусов, 2 пиками в области от примерно 21,4 до примерно 22,1 градусов, 2 пиками в области от примерно 22,8 до примерно 23,8 градусов, 2 пиками в области от примерно 24,7 до примерно 25,4 градусов, пиком в области от примерно 26,1 до примерно 27,3 градусов, пиком в области от примерно 30,9 до примерно 31,3 градусов и пиком в области от примерно 38,2 до примерно 38,7 градусов на картине рентгеновской дифракции порошка.

16. Форма В-HCl по п.14, где форма В-HCl характеризуется пиком в области от примерно 8,1 до примерно 8,5 градусов; пиком в области от примерно 8,8 до примерно 9,2 градусов; пиком в области от примерно 12,8 до примерно 13,2 градусов; пиком в области от примерно 17,8 до примерно 18,2 градусов и пиком в области от примерно 22,8 до примерно 23,2 градусов на картине рентгеновской дифракции порошка.

17. Форма В-HCl по п.14, где форма В-HCl характеризуется одним или большим количеством пиков в ¹³С ЯМР-спектре, выбранных из группы, включающей пик около 168,2 м.д., пик около 148,7 м.д., пик около 138,8 м.д., пик около 119,8 м.д. и пик около 23,9 м.д.

18. Форма В-HCl по п.17, где форма В-HCl характеризуется пиком около 168,2 м.д., пиком около 148,7 м.д., пиком около 138,8 м.д., пиком около 119,8 м.д. и пиком около 23,9 м.д. в ¹³С ЯМР-спектре.

19. Форма В-HCl по п.14, где форма В-HCl характеризуется одним или большим количеством пиков в ¹⁹F ЯМР-спектре, выбранных из группы, включающей пик около -55,6 м.д. и пик около -62,0 м.д.

20. Фармацевтическая композиция, обладающая модулирующей CFTR-активностью, содержащая форму В-HCl по п.14 и фармацевтически приемлемый адъювант или носитель.

21. Способ лечения или снижения тяжести заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из следующих: муковисцедоз, астма, вызванная дымом COPD, хронический бронхит, риносинусит, констипация, панкреатит, недостаточность поджелудочной железы, бесплодие мужчин вследствие врожденного билатерального отсутствия семенных протоков (CBAVD), умеренная болезнь легких, идиопатический панкреатит, аллергический бронхолегочный аспергиллез (АВРА), болезнь печени, наследственная эмфизема, наследственный гемохроматоз, недостатки системы свертывания-фибринолиза, такие как дефицит белка С, наследственный ангионевротический отек типа 1, недостатки переработки липидов, такие как семейная гиперхолестеринемия, хиломикронемия типа 1, абеталипопротеинемия, лизосомные болезни накопления, такие как болезнь I-клеток/псевдо-Гурлер, мукополисахаридоз, болезнь Сандхоффа/Тея-Сакса, синдром Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатия/гиперинсулинемия, сахарный диабет, карликовость Ларона, дефицит миелопероксидазы, первичный гипопаратиреодизм, меланома, гликаноз CDG типа 1, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственная гипофибриногенемия, дефицит ACT, несахарный диабет (DI), нейрофизиологический DI, нефрогенный DI, синдром Шарко-Мари Tуc, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Пика, некоторые полиглутаминовые неврологические нарушения, такие как болезнь Хантингтона, спинномозговая атаксия типа I, спинальная и бульбарная мышечная атрофия, дентаторубральная паллидарная и миотоническая дистрофия, а также спонгиоформные энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейцфельда-Якоба (обусловленная дефектом обработки прионного белка), болезнь Фабри, синдром Страусслера-Шейнкера, COPD, синдром «сухого глаза» или болезнь Шегрена, остеопороз, остеопения, исцеление костей и рост костей (включая восстановление костей, регенерацию костей, уменьшение резорбции костей и усиление депонирования кальция в костях), синдром Горхэма, хлоридные канлопатии, такие как врожденная миотония (формы Томсена и Беккера), синдром Бартера типа III, болезнь Дента, эпилепсия, гиперэкплексия, болезни лизосомного накопления, синдром Ангельмана и первичная цилиарная дискинезия (PCD), термин для наследственных нарушений структуры и/или функции ресничек, включая PCD с обратным расположением внутренних органов (также известную как синдром Картагенера), PCD без обратного расположения внутренних органов и цилиарная аплазия, причем указанный способ включает стадию введения указанному пациенту эффективного количества формы А-HCl, формы В, формы В-HCl по любому из пп.1-5, 7-12 или 14-19 или любой комбинации этих форм.

22. Способ по п.21, где указанное заболевание представляет собой муковисцедоз.

23. Способ лечения или снижения тяжести заболевания у пациента, где указанное заболевание связано с пониженной функцией CFTR вследствие мутации гена, кодирующего CFTR, или факторами окружающей среды, включающий стадию введения указанному пациенту эффективного количества формы А-HCl, формы В, формы В-HCl по любому из пп.1-5, 7-12 или 14-19 или любой комбинации этих форм.

24. Способ по п.23, где указанное заболевание представляет собой муковисцедоз, хронический бронхит, рецидивирующий бронхит, острый бронхит, бесплодие мужчин вследствие врожденного билатерального отсутствия семенных протоков (CBAVD), бесплодие женщин вследствие врожденного отсутствия матки и влагалища (CAUV), идиопатический хронический панкреатит (ICP), идиопатический рецидивирующий панкреатит, идиопатический острый панкреатит, хронический риносинусит, первичный склерозирующий холангит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, диабет, «сухой глаз», констипацию, аллергический бронхолегочный аспергиллез (АВРА), заболевания костей и астму.

25. Способ лечения или снижения тяжести заболевания у пациента, где указанное заболевание связано с нормальной функцией CFTR, причем указанный способ включает стадию введения указанному пациенту эффективного количества формы А-HCl, формы В, формы В-HCl по любому из пп.1-5, 7-12 или 14-19 или любой комбинации этих форм.

26. Способ по п.25, где заболевание представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), хронический бронхит, рецидивирующий бронхит, острый бронхит, риносинусит, констипацию, хронический панкреатит, рецидивирующий панкреатит и острый панкреатит, недостаточность поджелудочной железы, бесплодие мужчин вследствие врожденного билатерального отсутствия семенных протоков (CBAVD), умеренную болезнь легких, идиопатический панкреатит, болезнь печени, наследственную эмфизему, желчный конкремент, гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь, желудочно-кишечную злокачественность, воспалительное заболевание кишечника, констипацию, диабет, артрит, остеопороз и остеопению.

27. Способ по п.25, где заболевание представляет собой наследственный гемохроматоз, недостатки системы свертывания-фибринолиза, такие как дефицит белка С, наследственный ангионевротический отек типа 1, недостатки переработки липидов, такие как семейная гиперхолестеринемия, хиломикронемию типа 1, абеталипопротеинемию, лизосомные болезни накопления, такие как болезнь I-клеток/псевдо-Гурлер, мукополисахаридоз, болезнь Сандхоффа/Тея-Сакса, синдром Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатию/гиперинсулинемию, сахарный диабет, карликовость Ларона, дефицит миелопероксидазы, первичный гипопаратиреодизм, меланому, гликаноз CDG типа 1, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственную гипофибриногенемию, дефицит ACT, несахарный диабет (DI), нейрофизиологический DI, нефрогенный DI, синдром Шарко-Мари Tyc, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Пика, некоторые полиглутаминовые неврологические нарушения, такие как болезнь Хантингтона, спинномозговую атаксию типа I, спинальную и бульбарную мышечную атрофию, дентаторубральную паллидарную атрофию и миотоническую дистрофию, а также спонгиоформные энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейцфельда-Якоба (обусловленная дефектом обработки прионного белка), болезнь Фабри, синдром Страусслера-Шейнкера, синдром Горхэма, хлоридные каналопатии, врожденную миотонию (формы Томсена и Беккера), синдром Бартера типа III, болезнь Дента, гиперэкплексию, эпилепсию, болезни лизосомного накопления, синдром Ангельмана, первичную цилиарную дискинезию (PCD), PCD с обратным расположением внутренних органов (также известную как синдром Картагенера), PCD без обратного расположения внутренних органов и цилиарную аплазию или болезнь Шегрена.

28. Способ модулирования CFTR-активности в биологическом образце, включающий стадию контакта указанного CFTR с формой А-HCl, формой В, формой В-HCl по любому из пп.1-5, 7-12 или 14-19 или любой комбинацией этих форм.

29. Способ по п.21, где пациент имеет трансмембранный рецептор муковисцедоза (CFTR) с гомозиготной ΔF508 мутацией.

30. Способ по п.21, где пациент имеет трансмембранный рецептор муковисцедоза (CFTR) с гомозиготной G551D мутацией.

31. Способ по п.21, где пациент имеет трансмембранный рецептор муковисцедоза (CFTR) с гетерозиготной ΔF508 мутацией.

32. Способ по п.21, где пациент имеет трансмембранный рецептор муковисцедоза (CFTR) с гетерозиготной G551D мутацией.