СПОСОБЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПРЕВРАЩЕНИЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ БЕЛКОВ В ИХ ДВУХЦЕПОЧЕЧНУЮ ФОРМУ Российский патент 2015 года по МПК C07K14/33 

[01] Эта заявка на патент претендует на приоритет согласно 35 U.S.С. § 119(е) Предварительной Заявки на Патент США Серийный No. 61/286963, поданной 25 января 2010, включенной сюда во всей полноте посредством ссылки.

[02] Способность клостридиальных токсинов, таких как, например, нейротоксины Botulinum (BoNTs), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G и нейротоксины Tetanus (TeNT), ингибировать нейрональную трансмиссию, находит широкое терапевтическое и косметическое применение, см. например, William J. Lipham, cosmetic and clinical applications of botulinum toxin (Slack, Inc., 2004). Клостридиальные токсины, имеющиеся в продаже в виде фармацевтических составов, включают препараты BoNT/A, такие как, например, ВОТОХ® (Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT®/RELOXIN®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, England), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, South Korea) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) и XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Germany); и препараты BoNT/B, такие как, например, MYOBLOC™/NEUROBLOC™ (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). В качестве примера, ВОТОХ® iв настоящее время применяется в одной или более странах по следующим показаниям: ахалазия, спазмы у взрослых, анальная трещина, боль в спине, блефароспазм, бруксизм, шейная дистония, эссенциальный тремор, межбровные морщины или мимические морщины лица, головная боль, гемифасциальный спазм, гиперактивность мочевого пузыря, гипергидроз, детский церебральный паралич, рассеянный склероз, миоклонические заболевания, носогубные морщины, спастическая дисфония, косоглазие и расстройство VII нерва.

[03] Терапевтическое использование клостридиальных токсинов расширилось за пределы существующего применения для мышечной релаксации до лечения связанных с чувствительными нервами недомоганий, таких как, например, различные виды хронической боли, нейрогенное воспаление и урогенитальные расстройства, а также несвязанных с нервной системой болезней, такие как, например, панкреатит. Один подход, который в настоящее время используется для расширения терапевтического применения клостридиальных токсинов, включает модификацию клостридиального токсина таким образом, чтобы модифицированный таксин обладал измененной способностью связываться с клеткой, не являющейся мишенью для клостридиального токсина. Такая способность связываться с новой мишенью достигается путем замещения природного связывающегося с мишенью домена клостридиального токсина связывающимся с мишенью доменом, показывающим избирательную активность по отношению к рецептору, не являющемуся рецептором для клостридиального токсина, присутствующему в не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке. В результате такой модификации домена связывающегося с мишенью домена получается модифицированный токсин, обладающий способностью избирательно связываться с рецептором, не являющимся рецептором к клостридиальному токсину (рецептором-мишенью), присутствующим в не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке (измененной мишени). Клостридиальный токсин с измененной мишенью с активностью по отношению к не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке может связываться с рецептором, присутствующим в не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке, транслоцированным в цитоплазме и оказывающим протеолитическое действие на SNARE комплекс не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетки.

[04] Не имеющие ограничительного характера примеры клостридиальных токсинов с измененной мишенью с активностью по отношению к не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке описаны, например, в Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, Патент США 5989545; Clifford С. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, Патент США 6461617; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Патент США 6500436; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, Патент США 6632440; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, Патент США 6843998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Патент США 7419676; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Патент США 7514088; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, Публикация Патента США 2003/0180289; and Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, Международная Публикация Патента США WO 2005/023309. Способность изменять мишени терапевтических эффектов, связанных с клостридиальными токсинами, сильно расширила число медицинских применений, в которых возможно использовать терапию клостридиальным токсином. В качестве не имеющего ограничительного характера примера модифицированных клостридиальных токсинов, измененная мишень которых - чувствительные нейроны, используемых в лечении различных типов хронической боли, таких как, например, гиперальгезия и аллодиния, невропатическая боль и воспалительная боль, см., например, Foster, выше, (1999); и Donovan, выше, (2002); и Stephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components, Патент США 7,022,329. В качестве не имеющего ограничительного характера примера модифицированных клостридиальных токсинов, измененная мишень которых - панкреатические клетки, используемых в лечении панкреатита, см., например, Steward, выше, (2005).

[05] Клостридиальные токсины, природные или модифицированные, преобразуются в двуцепочечную форму для того чтобы достигнуть полной активности. Все природные клостридиальные токсины транслируются как одноцепочечный полипептид примерно 150 кДа, который затем протеолитически расщепляется внутри дисульфидной петли природной протеазой (Фигура 1). Это расщепление происходит внутри дискретного двуцепочечного участка петли, образованного между двумя цистеиновыми остатками, которые формируют дисульфидный мостик. В ходе этого посттрансляционного процесса образуется двуцепочечная молекула, содержащая примерно 50 кДа легкую цепь (LC), содержащую энзимный домен, и примерно 100 кДа тяжелую цепь (НС), содержащую транслокационный домен и клеточный домен связывания, LC и НС удерживаются вместе одной дисульфидной связью и нековалентными взаимодействиями (Фигура 1). В образованных путем рекомбинации клостридиальных токсинах природный двуцепочечный петлевой сайт расщепления протеиназой обычно замещается сайтом расщепления экзогенной протеиназой (Фигура 2). См. напр., Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7,419,676, включенный сюда во всей полноте посредством ссылки. Хотя клостридиальные токсины с измененной мишенью варьируют по своей полной молекулярной массе из-за размера связывающегося с мишенью компонента, процесс активации и его зависимость от экзогенных сайтов расщепления практически одинаковы для рекомбинантно произведенных клостридиальных токсинов. См. напр., Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, Публикации. Патента США 2009/0005313; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, Патент США Application 11/776,075; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, Публикацию Патента США 2008/0241881, каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[06] До настоящего времени превращение одноцепочечной формы рекомбинантно произведенного клостридиального токсина или модифицированного клостридиального токсина в его двуцепочечную форму требовало процесса активации in vitro. Во-первых, в бактериальных клетках, используемых для рекомбинантного производства этих токсинов, отсутствует природная протеаза, имеющаяся в штаммах клостридий, которые вырабатывают природные токсины. Во-вторых, нет большой необходимости рекомбинантно производить активированные токсины в бактериальных клетках, поскольку манипуляции с активированными токсинами подняли проблемы безопасности. См., например, Dolly, U.S. 7419676, выше, (2008). Однако, если эти проблемы возможно будет преодолеть, производство рекомбинантных активированных токсинов упростит производственный процесс выработки рекомбинантных клостридиальных токсинов или модифицированных клостридиальных токсинов. Например, в настоящее время производство рекомбинантных клостридиальных токсинов или модифицированных клостридиальных токсинов включает следующие этапы очистки: 1) аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металлов, 2) диализ с обменом буфера, 3) реакция расщепления протеазой, 4) ионообменная хроматография и 5) добавление PEG и быстрое замораживание для хранения при -80°С, Использование бактериальной клетки, которая может протеолитически расщеплять рекомбинантный клостридиальный токсин внутриклеточно, продолжая при этом экспрессировать токсин, может уменьшить число этапов очистки до следующих: 1) аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металлов, 2) диализ с обменом буфера, 3) ионообменная хроматография и 4) добавление PEG и быстрое замораживание для хранения при -80°С.

[07] Настоящее описание раскрывает способ превращения одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, в двуцепочечную форму, который не требует процесса in vitro для превращения одноцепочечной формы токсина в двуцепочечную форму. Это возможно благодаря использованию клеток, которые экспрессируют как белок, так и протеазу, необходимую для превращения белка в активную двуцепочечную форму.

[08] Таким образом, аспекты настоящего описания предоставляют двойной экспрессионный конструкт, который включает открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, и открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке. В дополнительных аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. Полинуклеотиды, а также клостридиальные токсины, содержащие двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, которые они кодируют, описаны, например, в Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7132259; Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7419676, каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки. Полинуклеотиды, а также белки, содержащие энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, которые они кодируют, описаны, например, в Steward, L.E. et al., Mnltivalent Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2009/0048431; Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2009/0069238; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, Заявка на Патент США 11/776,075; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, Публикация Патента США 2008/0241881; Foster, K.A. et al., Fusion Proteins, Публикация Патента США 2009/0035822; Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, Публикация Патента США 2009/0162341; Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2008/0032931; Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, Публикация Патента США 2008/0187960; Steward, L.E. et al., Degradable Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2008/0213830; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridial Toxin Target Cells, Публикация Патента США 2008/0241881; Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7,419,676; и сопутствующая заявка на патент Ghanshani, et al., Modified Clostridial Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain, Attorney Docket No. 18468 PROV (ВОТ), каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[09] Другие аспекты настоящего описания предоставляют клетку, содержащую двойной экспрессионный конструкт, который включает открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, и открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке. В дополнительных аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

[010] Другие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при первой температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной плотности клеток, двойной экспрессионный конструкт содержит: i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую протеазу; при этом протеаза может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке; б) рост клетки при второй температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной индукции экспрессии белка на открытой рамке считывания, кодирующей одноцепочечный белок, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и протеазы из двойного экспрессионного конструкта; при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[011] Дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина в двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение от около 2 до около 3,5 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный клостридиальный токсин, одноцепочечный клостридиальный токсин, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, домен связывания и дзуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую протеазу; при этом протеаза может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечной петле; б) рост клетки при 22°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного клостридиального токсина и протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный клостридиальный токсин в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный клостридиальный токсин в его двуцепочечную форму.

[012] Дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[013] Дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°C С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[014] Другие дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[015] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[016] Другие аспекты настоящего описания предоставляют экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

[017] Другие аспекты настоящего описания предоставляют экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[018] Другие аспекты настоящего описания предоставляют клетку, содержащую экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токина, домен связывания не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

[019] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки, содержащей i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; б) рост клетки при второй температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной индукции экспрессии белка на открытой рамке считывания, кодирующей одноцепочечный белок, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и протеазы из экспрессионного конструкта; при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[020] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 3,5 часов, клетка содержит i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный клостридиальный токсин, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, домен связывания и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; б) рост клетки при 22°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного клостридиального токсина и протеазы из экспрессионных конструктов; и при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный клостридиальный токсин в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный клостридиальный токсин в его двуцепочечную форму.

[021] Дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит: i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[022] Дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит: i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°С в течение от около 1 6 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[023] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит: i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С при от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[024] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°С при от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[025] Фигура 1 показывает доменную организацию встречающихся в природе клостридиальных токсинов. Одноцепочечная форма изображает линейную организацию от аминного к карбоксильному концу, включающую энзимный домен, транслокационных домен, и Не связывающий домен. Двуцепочечный петлевой участок, расположенный между транслокационным и энзимным доменами, отмечен двойной SS скобкой. Этот участок содержит двуцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой, после протеолитического расщепления которого встречающейся в природе протеазой, такой как, например эндогенная протеаза клостридиального токсина или встречающаяся в природе протеаза, вырабатываемая клеточным окружением, одноцепочечная форма токсина превращается в двуцепочечную форму.

[026] Фигура 2 показывает схему существующей на данный момент парадигмы высвобождения нейтротрансмиттера и интоксикации клостридильным токсином в центральном и периферийном нейроне. Фигура 2А показывает схему механизма высвобождения нейротрансмиттера из центрального и периферийного нейрона. Процесс высвобождения можно описать как содержащий два этапа: 1) стыковка везикулы, когда связанный с везикулой связанный SNARE белок везикулы, содержащей молекулы нейротрансмиттера, соединяется со связанными с мембраной SNARE белками, находящимися на плазматической мембране; и 2) высвобождение нейротрансмиттера, когда везикула сливается с плазматической мембраной и молекулы нейротрансмиттера подвергаются экзоцитозу. Фигура 2В показывает схему механизма интоксикации при активности столбнячного и ботулинового токсина в центральном и периферийном нейроне. Этот процесс интоксикации можно описать как содержащий четыре этапа: 1) связывание рецептора, при котором клостридиальный токсин связывается с системой клостридиального рецептора и инициирует процесс интоксикации; 2) интернализация комплекса, когда после связывания токсина везикула, содержащая системный комплекс токсин/рецептор, эндоцитируется в клетку; 3) транслокацию легкой цепи, когда, как предполагается, происходят множественные события, включая, например изменения во внутреннем рН везикулы, формирование перового канала, содержащего H_N домен тяжелой цепи клостридиального токсина, отделение легкой цепи клостридиального токсина от тяжелой цепи, и высвобождение активной легкой цепи и 4) энзимная модификация мишени, когда активированная легкая цепь клостридиального токсина протеолитически расщепляет свою мишень SNARE субстрат, такой как, например SNAP-25, VAMP или Синтаксин, тем самым предотвращая стыковку везикулы и высвобождение нейротрансмиттера.

[027] Клостридиальные токсины, вырабатываемые Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium baratii и Clostridium butyricum, очень широко используются в терапевтическом и косметическом лечении людей и других млекопитающих. Штаммы С.botulinum вырабатывают семь антигенно различных типов ботулиновых токсинов (BoNTs), которые были идентифицированы при исследованиях вспышек ботулизма у людей (BoNT/A, /В, /Е и /F), животных (BoNT/C1 и /D), или выделены из почвы (BoNT/G). BoNTs обладают примерно на 35% идентичными аминокислотами и имеют одинаковую организацию функционального домена и общую структурную композицию. Специалистам будет ясно, что внутри каждого типа клостридиального токсина могут быть подтипы, которые в какой-то степени отличаются по своей аминокислотной последовательности, и также по нуклеиновым кислотам, кодирующим данные белки. Например, в настоящее время есть четыре подтипа BoNT/A: BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3 и BoNT/A4, при этом определенные подтипы показывают примерно 89% аминокислотной идентичности при сравнении с другими подтипами BoNT/A. Хотя все семь BoNT серотипов имеют сходную структуру и фармакологические свойства, каждый также демонстрирует гетерогенные бактериологические характеристики. В сравнение, токсин столбняка (TeNT) вырабатывается однородной группой С.tetani. Два других вида Clostridia, С.baratii и С.butyricum, вырабатывают токсины, BaNT и BuNT, которые сходны с BoNT/F и BoNT/E соответственно.

[028] Каждая зрелая двуцепочечная молекула содержит три функционально различных домена: 1) энзимный домен, находящийся в LC, который включает участок металлопротеазы, обладающий цинк-зависимой эндопептидазной активностью, специфичной мишенью которой являются центральные компоненты аппарата высвобождения нейтротрансмиттера; 2) транслокационный домен (H_N), находящийся ближе к аминному концу НС, который содействует высвобождению LC из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени; и 3) домен связывания (H_C), находящийся ближе к карбоксильному концу НС, который определяет связывающую активность и специфичность связывания токсина с рецепторным комплексом, находящимся на поверхности клетки-мишени. Домен H_C содержит два различных структурных компонента примерно одного размера, которые указывают на функцию и обозначаются как H_CN и H_CC субдомены. В Таблице 1 представлены приблизительные участки связывания для каждого домена, находящегося в приведенных в качестве примеров клостридиальных токсинах.

[029]

[030] Связывающая, транслокационная и энзимная активность этих трех функциональных доменов необходима для токсичности. Хотя все детали этого процесса еще точно не известны, общий клеточный интоксикационный механизм, посредством которого клостридиальные токсины входят в нейрон и ингибируют выброс нейтротрансмиттера, одинаков вне зависимости от серотипа или подтипа. Хотя податели заявки не имеют желания ограничиваться следующим описанием, механизм интоксикации можно описать как содержащий по крайней мере четыре этапа: 1) связывание рецептора, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи, и 4) энзимная модификация мишени. Процесс начинается, когда НС домен клостридиального токсина связывается с токсин-специфичной рецепторной системой, локализованной на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Полагают, что специфичность связывания с рецепторным комплексом достигается, в числе прочего, благодаря специфическим комбинациям ганглиозидных и белковых рецепторов, которые, по всей видимости, включают каждый комплекс клостридиального токсин-рецептора. Связавшись, комплексы токсин/рецептор интернализируются путем эндоцитоза и интернализованные везикулы сортируются по специфичным внутриклеточным путям. Этап транслокации, по-видимости, запускается ацидификацией компармента везикулы.

Этот процесс, видимо, инициируется двумя важными pH-зависимыми структурными перестройками, которые повышают гидрофобность и стимулируют формирование

двуцепочечной формы токсина. После активации эндопептидазой легкая цепь токсина высвобождается из внутриклеточной везикулы в цитозол, где для нее, по видимости, специфичной мишенью служит один из трех центральных компонентов аппарата высвобождения нейтротрансмиттера. Эти ключевые белки, везикуло-ассоциированный мембранный белок (VAMP)/синаптобревин, синаптосомально-ассоциированный белок 25 кДа (SNAP-25) и Синтаксин необходимы для стыковки везикулы с синапсом и слияния нервного окончания и установленных членов семейства растворимых чувствительных к N-этилмалеимиду факторов, обеспечивающий прикрепление белков-рецепторов. BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP-25 в карбоксильно-концевом участке, высвобождая девять или двадцать шесть аминокислотных сегментов, соответственно, и BoNT/C1 также расщепляет SNAP-25 рядом с карбоксильным концом. Ботулиновые серотипы BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G, и столбнячный токсин, действуют на законсервированную центральную порцию VAMP и высвобождают амино-терминальную порцию VAMP в цитозол. BoNT/C1 расщепляет синтаксин в одном сайте рядом с поверхностью цитозольной мембраны. Селективный протеолиз синаптических SNARE отвечает за блокировкую высвобождения нейротрансмиттера, к чему приводят клостридиальные токсины in vivo. SNARE белковые мишени клостридиальных токсинов обычны для экзоцитозов во множестве не-нейронных типов; в этих клетках, как в нейронах, пептидазная активность легкой цепи ингибирует экзоцитоз, см., например, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Eliochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

[031] В аспекте этого изобретения, модифицированный клостридиальный токсин содержит, в числе прочего, одноцепочечный модифицированный клостридиальный токсин и двуцепочечный модифицированный клостридиальный токсин. Как обсуждалось выше, клостридиальные токсины, встречающиеся или же не встречающиеся в природе, первично синтезируются как одноцепочечный полипептид. Эта одноцепочечная форма затем расщепляется протеазой в сайте расщепления протеазой, находящемся внутри дискретного двуцепочечного петлевого участка, образованного между двумя цистеиновыми остатками, которые формируют дисульфидный мостик. В ходе этого посттрансляционного процесса образуется двуцепочечная молекула, содержащая легкую цепь (LC) и тяжелую цепь. Использованный здесь термин "двуцепочечный петлевой участок" обозначает петлевой участок встречающегося в природе или не встречающегося в природе клостридиального токсина, образованный дисульфидным пестиком, находящимся между LC доменом и НС доменом. Использованный здесь термин "одноцепочечный модифицированный клостридиальный токсин" обозначает любой модифицированный клостридиальный токсин, раскрытый в настоящем описании, который присутствует в своей одноцепочечной форме, то есть токсин, не расщепленный в сайте расщепления протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, посредством родственной ему протеазы. Использованный здесь термин "двуцепочечный модифицированный клостридиальный токсин" обозначает любой модифицированный клостридиальный токсин, раскрытый в настоящем описании, который присутствует в своей двуцепочечной форме, то есть токсин, расщепленный в сайте расщепления протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, посредством родственной ему протеазы.

[032] Аспекты настоящего изобретения предоставляют, в числе прочего, полинуклеотидные молекулы. Использованный здесь термин "полинуклеотидная молекула" является синонимом "молекулы нуклеиновой кислоты" и означает полимерную форму нуклеотидов, такую как, например рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды, любой длины. Используемые молекулы полинуклеотидов включают, не ограничиваясь тем самым, встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе молекулы ДНК и встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе молекулы РНК. Не имеющие ограничительного характера примеры встречающихся в природе и не встречающихся в природе молекул ДНК включают молекулы однонитевой ДНК, молекулы двунитевой ДНК, молекулы геномной ДНК, молекулы кДНК, векторные конструкты, такие как, например плазмидные конструкты, фагмидные конструкты, бактериофаговые конструкты, ретровирусные конструкты и искусственные хромосомные конструкты. Не имеющие ограничительного характера примеры встречающихся в природе и не встречающихся в природе молекул РНК включают однонитевые РНК, двунитевые РНК и мРНК.

[033] Общепринятые техники молекулярной биологии, которые могут быть необходимы для создания полинуклеотидной молекулы, кодирующей модифицированный клостридиальный токсин, раскрытый в настоящем описании, включают, не имея ограничительного характера, процедуры, включающие полимеразную цепную реакцию (PCR) амплификации, энзимные реакции рестрикции, электрофорез в агарозном геле, лигацию нуклеиновых кислот, бактериальную трансформацию, очистку нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот и основанные на рекомбинации техники, являющиеся общепринятыми и находящимися в пределах компетенции специалистов в данной области и соответствующие объему изложенных здесь сведений. Не имеющие ограничительного характера примеры специфических протоколов, необходимых для создания полинуклеотидной молекулы, кодирующей модифицированный клостридиальный токсин, описаны, например, в MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); и CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004). Кроме того, широко доступны различные имеющееся в продаже продукты, используемые для создания полинуклеотидной молекулы, кодирующей модифицированный клостридиальный токсин. Эти протоколы являются общепринятыми процедурами, находящимися в пределах компетенции специалистов в данной области и соответствующими объему изложенных здесь сведений.

[034] Способы, раскрытые в данном описании, включают, в числе прочего, открытую рамку считывания. Использованный здесь термин "открытая рамка считывания" синонимичен "ORF" и означает любую полинуклеотидную молекулу, которая кодирует белок или часть белка. Открытая рамка считывания обычно начинается со стартового кодона (представленного как, например, AUG для молекулы РНК и ATG в молекуле ДНК в стандартном коде) и читается в кодон-триплетаз пока рамка не кончается STOP кодоном (представленным как, например, UAA, UGA или UAG для РНК молекулы и ТАА, TGA или TAG в ДНК молекуле в стандартном коде). Использованный здесь термин "кодон" означает последовательность трех нуклеотидов в полинуклеотидной молекуле, которая специфична для определенной аминокислоты во время синтеза белка; также называется триплетом или кодон-триплетом.

[035] Способы, раскрытые в данном описании, включают, в числе прочего, экспрессионный конструкт. Экспрессионный конструкт содержит полинуклеотидную молекулу, включающую открытую рамку считывания, раскрытую в настоящем описании, функционально связанную с вектором экспрессии, пригодным для экспрессии полинуклеотидной молекулы в клетке или бесклеточном экстракте. Широкое множество векторов экспрессии может использоваться для экспрессии полинуклеотидной молекулы, раскрытой в настоящем описании, включая, без ограничительного характера, вирусный вектор экспрессии; прокариотический вектор экспрессии; эукариотические векторы экспрессии, такие как, например дрожжевой вектор экспрессии, вектор экспрессии насекомого и вектор экспрессии млекопитающего; и бесклеточный (in vitro) вектор экспрессии. Далее понятно, что экспрессионные векторы, используемые в практических аспектах этих способов, могут включать те, которые экспрессируют полинуклеотидную молекулу под контролем конститутивного, тканеспецифичного, клеткоспецифичного или индуцируемого промоторного элемента, энхансерного элемента или обоих. Не имеющие ограничительного характера примеры экспрессионных векторов, а также общепринятых реагентов и условий для создания и использования экспрессионных конструктов из таких экспрессионных векторов, легко доступны у торговых поставщиков, которые включают, без ограничительного характера, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; и Stratagene, La Jolla, CA. Выбор, приготовление и использование подходящего экспрессионного вектора являются общепринятыми процедурами, находящимися в пределах компетенции специалистов в данной области и в объеме изложенных здесь сведений.

[036] Экспрессионный конструкт, раскрытый в настоящем описании, может содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок, включающий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, при этом расщепление сайта расщепления эндогенной протеазой превращает одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму. В аспектах этого варианта воплощения вирусный вектор экспрессии функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей белок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли; прокариотический вектор экспрессии функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей белок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли; дрожжевой вектор экспрессии функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей белок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли; вектор экспрессии насекомых функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей белок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли; и вектор экспрессии млекопитающих функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей белок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли. В других аспектах этого варианта воплощения экспрессионный конструкт, подходящий для экспрессии полинуклеотидной молекулы, раскрытой в настоящем описании, может экспрессироваться с использованием бесклеточного экстракта. В аспекте этого варианта воплощения бесклеточный вектор экспрессии функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей белок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли.

[037] В варианте воплощения изобретения экспрессионный конструкт, раскрытый в настоящем описании, может содержать открытую рамку считывания, кодирующую клостридиальный токсин, содержащий двуцепочечный участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В аспектах этого воплощения изобретения экспрессионный конструкт, раскрытый в настоящем описании, может содержать открытую рамку считывания, кодирующую клостридиальный токсин, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В аспектах этого воплощения изобретения одноцепочечный клостридиальный токсин содержит следующую линейную амино-карбоксильную очередность 1) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина; 2) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, связывающий домен клостридиального токсина и транслокационный домен клостридиального токсина; 3) связывающий домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и энзимный домен клостридиального токсина; 4) связывающий домен клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и транслокационный домен клостридиального токсина; 5) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, энзимный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина; или 6) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, связывающий домен клостридиального токсина и энзимный домен клостридиального токсина.

[038] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1) энзимный домен BoNT/A токсина, транслокационный домен BoNT/A, связывающий домен BoNT/A и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/B и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/C1, связывающий домен BoNT/C1 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/D, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 5) энзимный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/E связывающий домен BoNT/E, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 6) энзимный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/F, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 7) энзимный домен BoNT/G, транслокационный домен BoNT/G, связывающий домен BoNT/G, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 8) энзимный домен TeNT, транслокационный домен TeNT, связывающий домен TeNT, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 9) энзимный домен BaNT, транслокационный домен BaNT, связывающий домен BaNT, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 10) энзимный домен BuNT, транслокационный домен BuNT, связывающий домен BuNT, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[039] В других дальнейших аспектах этого варианта воплощения экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1) энзимный домен BoNT/A токсина, транслокационный домен BoNT/A, связывающий домен BoNT/A, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 2) энзимный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/B, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 3) энзимный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/C1, связывающий домен BoNT/C1, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 4) энзимный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/D и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 5) энзимный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/E, связывающий домен BoNT/E и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 6) энзимный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/F, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 7) энзимный домен BoNT/G, транслокационный домен BoNT/G, связывающий домен BoNT/G и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 8) энзимный домен TeNT, транслокационный домен TeNT, связывающий домен TeNT и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 9) энзимный домен BaNT, транслокационный домен BaNT, связывающий домен BaNT и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; 10) энзимный домен BuNT, транслокационный домен BuNT, связывающий домен BuNT и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой.

[040] Примеры таких клостридиальных токсинов, содержащих двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, описаны, например, в: J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Патент США 7,132,529; J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Патент США 7419676; Lance Steward, et al., Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins, Патент США 6903187; Lance Steward, et al., Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins, Патент США 7393925; Wei-Jen Lin, et al., Neurotoxins with Enhanced Target Specificity, Патент США 7273722; Lance Steward et al., Modified Botulinum Neurotoxins, Патент США 7491799; Lance E. Steward, et al., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type E, Патент США Publication 2008/0138893; Ester Fernandez-Salas, et al., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type А, Патент США Publication 2008/0057575; каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[041] В другом воплощении изобретения экспрессионный конструкт, раскрытый в настоящем описании, может содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В аспектах этого варианта воплощения, одноцепочечный белок содержит следующую амино-карбоксильную очередность: 1) клостридиальный энзимный домен, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, клостридиальный транслокационный домен и неклостридиальный связывающий домен; 2) клостридиальный энзимный домен, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, неклостридиальный связывающий домен и клостридиальный транслокационный домен; 3) неклостридиальный связывающий домен, транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и энзимный домен клостридиального токсина; 4) неклостридиальный связывающий домен, энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и транслокационный домен клостридиального токсина; 5) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, энзимный домен клостридиального токсина и неклостридиальный связывающий домен; либо 6) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, неклостридиальный связывающий домен и энзимный домен клостридиального токсина.

[042] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания опиоидов и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В. дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания энкефалина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания бычьего адреномедуллярного-22 (ВАМ22) пептида и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания эндоморфина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания эндорфина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания динорфина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ноцицептина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 7) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания геморфина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 8) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания риморфина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[043] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида меланокортина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания меланоцит-стимулирующего гормона и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания адренокортикотропина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания липотропина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[044] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида галанина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую; 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания галанина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания связанного с сигналом галанина пептида (GMAP) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[045] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида гранина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания хромогранина А и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания хромогранина В и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания хромогранина С и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[046] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида тахикинина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания субстанции Р и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейропептида K и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейропептида гамма и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейрокинина А и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания гемокинина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания эндокинина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[047] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида, родственного нейропептиду Y, и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейропептида Y (NPY) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида YY (PYY) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания панкреатического пептида (РР) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания панкреатического икозапептида (PIP) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[048] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида нейрогормона и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания кортикотропин-высвобождающего гормона (CCRH) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания паратироидного гормона (РТН) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания тиротропин-высвобождающего гормона (TRH) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания соматостатина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[049] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида цитокина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания гликофорина-А (GPA) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания интерлейкина (IL) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания оностатина М и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания кардиотрофина-1 (СТ-1) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 7) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания кардиотрофин-подобного цитокина (CLC) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 8) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейролейкина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[050] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида кинина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания брадикинина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания каллидина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания брадикинина desArg9 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания брадикинина desArg10 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[051] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида фактора роста фибробластов (FGF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания FGF-1 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания FGF-2 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания FGF-4 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания FGF-8 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания FGF-9 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания FGF-17 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания FGF-18 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[052] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида нейротрофина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания фактора роста нервов (NGF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейротрофина-3 (NT-3) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейротрофина-4/5 (NT-4/5) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида активатора головы (НА) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[053] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида фактора опухолевого некроза (TNF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[054] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида фактора роста глии (GDNF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания нейротурина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания персефина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания артемина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[055] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида трансформационного фактора роста β (TGFβ) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания TGFβ1 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания TGFR2 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания TGFR3 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания TGFR4 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[056] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида костного морфогенетического белка β (BMP) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ВМР2 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ВМР3 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ВМР4 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ВМР5 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ВМР6 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ВМР7 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 7) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ВМР8 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 8) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания BMP10 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[057] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида фактора дифференциации роста β (GDF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF1 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF2 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF3 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF5 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF6 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF7 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 7) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF8 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 8) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF10 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 9) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF11 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 10) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания GDF15 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[058] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида активина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания активина А и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания активина В и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания активина С и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания активина Е и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания ингибина А и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[059] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[060] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида инсулинового фактора роста (IGF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания IGF-1 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания IGF-2 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[061] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида эпидермального фактора роста (EGF) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[062] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида глюкагон-подобного гормона и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания секретина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания глюкагон-подобного пептида и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[063] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза (РАСАР), и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[064] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH). и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[065] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH), и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[066] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида вазоактивного кишечного пептида (VIP) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания VIP1 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания VIP2 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[067] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида желудочного ингибиторного полипептида (GIP) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[068] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания кальцитонин-родственного пептидвисцерального кишечного пептида и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания гастрина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания гастрин-высвобождающего пептида и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания холецистокинина (CCK) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[069] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания пептида активируемого протеазой рецептора (PAR) и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания PAR1 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания PAR2 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания PAR3 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; либо 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, домен связывания PAR3 и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[070] Примеры таких белков, содержащих двуцепочечный петлевой участок, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой описаны, например, в J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Патенте США 7,132,529; J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Патенте США 7,419,676; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Патенте США 7,514,088; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, международная публикация патента WO 2005/023309; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2008/0032930; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2008/0032931; Lance E, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2008/0161226; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2008/0221012; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2009/0004224; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2009/0005313; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2009/0018081; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Публикации Патента США 2009/0069238; and Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Патент США Publication 2009/0048431, каждый аз которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[071] В другом воплощении изобретения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, и интегрированный с сайтом расщепления домен связывания. В некоторых аспектах этого варианта воплощения, одноцепочечный белок содержит следующую линейную амино-карбоксильную очередность 1) интегрированный с сайтом расщепления домен связывания, транслокационный домен клостридиального токсина и энзимный домен клостридиального токсина; 2) интегрированный с сайтом расщепления домен связывания, энзимный домен клостридиального токсина, и транслокационный домен клостридиального токсина; 3) энзимный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления домен связывания и транслокационный домен клостридиального токсина; 4) транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления домен связывания и энзимный домен клостридиального токсина; 5) транслокационный домен клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина и интегрированный с сайтом расщепления домен связывания; и 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и интегрированный с сайтом расщепления домен связывания.

[072] В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания энкефалина; 2) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания бычьего адреномедуллярного-22 (ВАМ22); 3) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндоморфина; 4) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндорфина; 5) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания динорфина; 6) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания ноцицептина; 7) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания геморфина; либо 8) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания риморфина.

[073] Примеры таких белков, содержащих интегрированный с сайтом расщепления протеазой домен связывания, описаны, например, в совместной патентной заявке Sanjiv Ghanshani, et al., Modified Clostridial Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain, которая включена сюда во всей полноте посредством ссылки.

[074] Экспрессионные конструкты, раскрытые в настоящем описании, могут содержать открытую рамку считывания, кодирующую протеазу. В некоторых аспектах этого варианта воплощения, вирусный вектор экспрессии функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей протеазу; вектор экспрессии прокариота функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей протеазу; вектор экспрессии дрожжей функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей протеазу; вектор экспрессии насекомого функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей протеазу; и вектор экспрессии млекопитающего функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей протеазу. В других аспектах этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт, подходящий для экспрессии полинуклеотидной молекулы, раскрытой в данном описании, может экспрессироваться с использованием бесклеточного экстракта. В одном аспекте этого варианта воплощения, вектор экспрессии бесклеточного экстракта функционально связан с полинуклеотидной молекулой, кодирующей протеазу.

[075] В одном аспекте этого варианта воплощения, экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирует энтерокиназу, протеазу человеческого риновируса 3С, протеазу человеческого энтеровируса 3С, протеазу вируса табачной мозаики (TEV), протеазу вируса просветления жилок турнепса (TVMV), субтилизин протеазу, или каспазу 3 протеазу. Примеры энтерокиназ протеаз и кодирующих их полинуклеотидных молекул описаны, например, в Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, Патент США 5665566; Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, Патент США 6746859, каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки. Примеры субтилизин протеаз и кодирующих их полинуклеотидных молекул описаны, например, в Donn N. Rubingh, et al., Subtillisin Protease Variants having Ammo Acid Deletions and Substitutions in Defined Epitope Regions, Патент США 6586224, который включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[076] В другом аспекте этого варианта воплощения, энтерокиназа представляет собой SEQ ID NO:11. В другом аспекте этого варианта воплощения, энтерокиназа содержит аминокислоты 239-1035 из SEQ ID NO:11. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, энтерокиназа представляет собой природный вариант энтерокиназы, как то, например, изоформу энтерокиназы. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, энтерокиназа представляет собой не встречающийся в природе вариант энтерокиназы, как то, например, консервативный вариант энтерокиназы, неконсервативный вариант энтерокиназы, химерную энтерокиназу, активный фрагмент энтерокиназы, или любое их сочетание. В другом аспекте этого варианта воплощения, энтерокиназа представляет собой описанную в Патенте США 5,665,566 или Патенте США 6,746,859. В другом аспекте этого варианта воплощения, энтерокиназа, природный вариант энтерокиназы, или не встречающийся в природе вариант энтерокиназы получен из разновидности млекопитающих, как то, например, человек, корова или грызун.

[077] В других аспектах этого варианта воплощения, энтерокиназа содержит полипептид, имеющий аминокислоты, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% идентичные SEQ ID NO:11; либо не более чем на 70%, не более чем на 75%, не более чем на 80%, не более чем на 85%, не более чем на 90% или не более чем на 95% идентичные SEQ ID NO:11. В некоторых иных аспектах этого варианта воплощения, энтерокиназа содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:11; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:11. В прочих аспектах этого варианта воплощения, энтерокиназа содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:11; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:11.

[078] В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза человеческого риновируса 3С представляет собой SEQ ID NO:12. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, иротеаза человеческого риновируса 3С представляет собой природный вариант протеазы человеческого риновируса 3С, как то, например, изоформу протеазы человеческого риновируса 3С. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, протеаза человеческого риновируса 3С представляет собой не встречающийся в природе вариант протеазы человеческого риновируса 3С, как то, например, консервативный вариант протеазы человеческого риновируса 3С, неконсервативный вариант протеазы человеческого риновируса 3С, химерную протеазу человеческого риновируса 3С, активный фрагмент протеазы человеческого риновируса 3С или любое их сочетание. В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза человеческого риновируса 3С, природный вариант протеазы человеческого риновируса 3С, или не встречающийся в природе вариант протеазы человеческого риновируса 3С получен из разновидности Rhinovirus.

[079] В других аспектах этого варианта воплощения, протеаза человеческого риновируса 3С содержит полипептид, имеющий аминокислоты, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% идентичные SEQ ID NO:12; либо не более чем на 70%, не более чем на 75%, не более чем на 80%, не более чем на 85%, не более чем на 90% или не более чем на 95% идентичные SEQ ID NO:12. В некоторых иных аспектах этого варианта воплощения, протеаза человеческого риновируса 3С содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:12; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:12. В прочих аспектах этого варианта воплощения, протеаза человеческого риновируса 3С содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:12; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:12.

[080] В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза человеческого энтеровируса 3С представляет собой SEQ ID NO:13. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, протеаза человеческого энтеровируса 3С представляет собой природный вариант протеазы человеческого энтеровируса 3С, как то, например, изоформу протеазы человеческого энтеровируса 3С. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, энтерокиназа представляет собой не встречающийся в природе вариант протеазы человеческого энтеровируса 3С, как то, например, консервативный вариант протеазы человеческого энтеровируса 3С, неконсервативный вариант протеазы человеческого энтеровируса 3С, химерную протеазу человеческого энтеровируса 3С, активный фрагмент протеазы человеческого энтеровируса 3С, или любое их сочетание. В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза человеческого энтеровируса 3С, природный вариант протеазы человеческого энтеровируса 3С, или не встречающийся в природе вариант протеазы человеческого энтеровируса 3С получен из разновидности Enterovirus.

[081] В других аспектах этого варианта воплощения, протеаза человеческого энтеровируса 3С содержит полипептид, имеющий аминокислоты, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% идентичные SEQ ID NO:13; либо не более чем на 70%, не более чем на 75%, не более чем на 80%, не более чем на 85%, не более чем на 90% или не более чем на 95% идентичные SEQ ID NO:13. В некоторых иных аспектах этого варианта воплощения, протеаза человеческого энтеровируса 3С содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:13; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:13. В прочих аспектах этого варианта воплощения, протеаза человеческого энтеровируса 3С содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:13; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:13.

[082] В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза TEV представляет собой SEQ ID NO:14. В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза TEV содержит аминокислоты 2038-2270 из SEQ IS NO:14. В другом аспекте этого варианта воплощения. протеаза TEV содержит SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, или SEQ ID NO:23. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, протеаза TEV представляет собой природный вариант протеазы TEV, как то, например, изоформу протеазы TEV. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, протеаза TEV представляет собой не природный вариант протеазы TEV, как то, например, консервативный вариант протеазы TEV, неконсервативный вариант протеазы TEV, химерную протеазу TEV, активный фрагмент протеазы TEV или любое их сочетание. В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза TEV, природный вариант протеазы TEV, или не природный вариант протеазы TEV получен из разновидности Potyvirus.

[083] В других аспектах этого варианта воплощения, протеаза TEV содержит полипептид, имеющий аминокислоты, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% идентичные SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, либо SEQ ID NO:23; либо не более чем на 70%, не более чем на 75%, не более чем на 80%, не более чем на 85%, не более чем на 90% или не более чем на 95% идентичные SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, либо SEQ ID NO:23. В некоторых иных аспектах этого варианта воплощения, протеаза TEV содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, либо SEQ ID NO:23; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, либо SEQ ID NO:23. В прочих аспектах этого варианта воплощения, протеаза TEV содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, либо SEQ ID NO:23; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, либо SEQ ID NO:23.

[084] В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза TVMV представляет собой SEQ ID NO:24. В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза TVMV содержит аминокислоты 2002-2236 из SEQ ID NO:24. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, протеаза TVMV представляет собой природный вариант протеазы TVMV, как то, например, изоформу протеазы TVMV. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, протеаза TVMV представляет собой не природный вариант протеазы TVMV, как то, например, консервативный вариант протеазы TVMV, неконсервативный вариант протеазы TVMV, химерную протеазу TVMV, активный фрагмент протеазы TVMV, или любое их сочетание. В другом аспекте этого варианта воплощения, протеаза TVMV, природный вариант протеазы TVMV, или не встречающийся в природе вариант протеазы TVMV получен из разновидности Potyvirus.

[085] В других аспектах этого варианта воплощения, протеаза TVMV содержит полипептид, имеющий аминокислоты, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% идентичные SEQ ID NO:24 или аминокислотам 2002-2236 из SEQ IS NO:24; либо не более чем на 70%, не более чем на 75%, не более чем на 80%, не более чем на 85%, не более чем на 90% или не более чем на 95% идентичные SEQ ID NO:24 или аминокислотам 2002-2236 из SEQ IS NO:24. В некоторых иных аспектах этого варианта воплощения, протеаза TVMV содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:24 или аминокислотами 2002-2236 из SEQ IS NO:24; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:24 или аминокислотами 2002-2236 из SEQ IS NO:24. В прочих аспектах этого варианта воплощения, протеаза TVMV содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:24 или аминокислотами 2002-2236 из SEQ IS NO:24; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:24 или аминокислотами 2002-2236 из SEQ IS NO:24.

[086] В другом аспекте этого варианта воплощения, субтилизин протеаза представляет собой SEQ ID NO:25. В другом аспекте этого варианта воплощения, субтилизин протеаза содержит аминокислоты 107-365 из SEQ ID NO:25. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, субтилизин протеаза представляет собой природный вариант субтилизин протеазы, как то, например, изоформу субтилизин протеазы. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, субтилизин протеаза представляет собой не встречающийся в природе вариант субтилизин протеазы, как то, например, консервативный вариант субтилизин протеазы, неконсервативный вариант субтилизин протеазы, химерную субтилизин протеазу, активный фрагмент субтилизин протеазы, или любое их сочетание. В другом аспекте этого варианта воплощения, субтилизин протеаза, природный вариант субтилизин протеазы, или не встречающийся в природе вариант субтилизин протеазы получен из разновидности Bacillus.

[087] В других аспектах этого варианта воплощения, субтилизин протеаза содержит полипептид, имеющий аминокислоты, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% идентичные SEQ ID NO:25 или аминокислотам 107-365 из SEQ IS NO:25; либо не более чем на 70%, не более чем на 75%, не более чем на 80%, не более чем на 85%, не более чем на 90% или не более чем на 95% идентичные SEQ ID NO:25 или аминокислотам 107-365 из SEQ IS NO:25. В некоторых иных аспектах этого варианта воплощения, субтилизин протеаза содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:25 или аминокислотами 107-365 из SEQ IS NO:25; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:25 или аминокислотами 107-365 из SEQ IS NO:25. В прочих аспектах этого варианта воплощения, субтилизин протеаза содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:25 или аминокислотами 107-365 из SEQ IS NO:25; либо не более чем на 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:25 или аминокислотами 107-365 из SEQ IS NO:25.

[088] В другом аспекте этого варианта воплощения, каспаза 3 протеаза представляет собой SEQ ID NO:26. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, каспаза 3 протеаза представляет собой природный вариант каспазы 3 протеазы, как то, например, изоформу каспазы 3 протеазы. В еще одном аспекте этого варианта воплощения, каспаза 3 протеаза представляет собой не встречающийся в природе вариант каспазы 3 протеазы, как то, например, консервативный вариант каспазы 3 протеазы, неконсервативный вариант каспазы 3 протеазы, химерную каспазу 3 протеазу, активный фрагмент каспазы 3 протеазы, или любое их сочетание. В другом аспекте этого варианта воплощения, каспаза 3 протеаза, природный вариант каспазы 3 протеазы, или не встречающийся в природе вариант каспазы 3 протеазы получен из разновидности млекопитающих, как то, например, человек, корова или грызун.

[089] В других аспектах этого варианта воплощения каспаза 3 протеаза содержит полипептид, имеющий аминокислоты, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% идентичные SEQ ID NO:26; либо не более чем на 70%, не более чем на 75%, не более чем на 80%, не более чем на 85%, не более чем на 90% или не более чем на 95% идентичные SEQ ID NO:26. В некоторых иных аспектах этого варианта воплощения, каспаза 3 протеаза содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:26; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 несмежных делений, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:26. В прочих аспектах этого варианта воплощения, каспаза 3 протеаза содержит полипептид, включающий, например, не менее чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:26; либо не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, или 100 смежных делеций, вставок и/или замен аминокислот в сравнении с SEQ ID NO:26.

[090] Способы, раскрытые в настоящем описании, включают, в числе прочего, двойной экспрессионный конструкт. Двойной экспрессионный конструкт содержит две полинуклеотидных молекулы, каждая из которых включает открытую рамку считывания, раскрытую в настоящем описании, функционально связанную с экспрессионным вектором, используемым для экспрессии обеих полинуклеотидных молекул в клетке или бесклеточном экстракте.. Для экспрессии полинуклеотидных молекул, раскрытых в настоящем описании, может использоваться широкое множество двойных экспрессионных векторов, включая, без ограничительного характера, вирусный двойной экспрессионный вектор; прокариотический двойной экспрессионный вектор; эукариотический двойной экспрессионный вектор, такой как, например, дрожжевой двойной экспрессионный вектор, двойной экспрессионный вектор насекомого и двойной экспрессионный вектор млекопитающего; и двойной экспрессионный вектор бесклеточного экстракта. В дальнейшем понятно, что двойные экспрессионные векторы, используемые в практических аспектах этих способов, могут включать те, которые экспрессируют полинуклеотидные молекулы под контролем конститутивного, тканеспецифичного, клеткоспецифичного или индуцируемого промоторного элемента, энхансерного элемента или обоих элементов. Не несущие ограничительного характера примеры двойных экспрессионных векторов, вкупе с хорошо известными реагентами и условиями для изготовления и использования экспрессионного конструкта из таких экспрессионных векторов, легко доступны у торговых поставщиков, которые включают, без ограничительного характера, EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI. Выбор, изготовление и использование подходящего двойного экспрессионного вектора являются общеизвестными процедурами, находящимися в пределах компетенции специалистов в данной области и в объеме изложенных здесь сведений..

[091] Двойные экспрессионные конструкты, раскрытые в настоящем описании, могут включать открытую рамку считывания, кодирующую белок, включающий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, и другую открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[092] Таким образом, в этом варианте воплощения двойной экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании, и другую открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли, как раскрыто в настоящем описании.

[093] В одном аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт может содержать открытую рамку считывания, кодирующую клостридиальный токсин, включающий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, и другую открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу. В другом аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт может содержать открытую рамку считывания, кодирующую клостридиальный токсин, включающий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, и другую открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу. В еще одном аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт может содержать открытую рамку считывания, кодирующую клостридиальный токсин, включающий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина связывающий домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок и сайт расщепления TEV протеазой, при этом сайт расщепления TEV протеазой находится внутри двуцепочечного петлевого участка, и другую открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу.

[094] В одном аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, и другую открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли. В другом аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт может содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, и другую открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу. В еще одном аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт может содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок и сайт расщепления TEV протеазой, при этом сайт расщепления TEV протеазой находится внутри двуцепочечного петлевого участка, и другую открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу.

[095] В одном аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и интегрированный с сайтом расщепления протеазой связывающий домен. В другом аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт может содержать одну открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой связывающий домен и другую открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу. В еще одном аспекте этого варианта воплощения двойной экспрессионный конструкт может содержать одну открытую рамку считывания, кодирующую белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой связывающий домен, при этом сайт расщепления TEV протеазой находится внутри двуцепочечного петлевого участка, и другую открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу.

[096] Положение одной из открытых рамок считывания, содержащихся в двойном экспрессионном конструкте, может быть любым по отношению к положению другой открытой рамки считывания, при условии, что транскрипция может происходить с обеих открытых рамок считывания. Когда двойной экспрессионный конструкт создан, инициация транскрипции с первого промоторного участка обычно транскрибирует обе открытые рамки считывания, при этом инициация транскрипции со второго промоторного участка обычно транскрибирует только одну из открытых рамок считывания. Таким образом, в зависимости от локализации открытой рамки считывания, связанной с первым и вторым промоторными участками, с одной из открытых рамок считывания может быть сделано в два раза больше транскриптов.

[097] Таким образом, в одном варианте воплощения, открытая рамка считывания, кодирующая протеазу, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков. В одном аспекте этого варианта воплощения открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая клостридиальный токсин, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, локализованная внутри двуцепочечного петлевого участка, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков. В другом аспекте этого варианта воплощения открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков. В еще одном аспекте этого варианта воплощения открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой связывающий домен, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков.

[098] В другом варианте воплощения открытая рамка считывания, кодирующая белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая протеазу, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков. В одном аспекте этого варианта воплощения открытая рамка считывания, кодирующая клостридиальный токсин, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков. В другом аспекте этого варианта воплощения открытая рамка считывания, кодирующая белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков. В еще одном аспекте этого варианта воплощения открытая рамка считывания, кодирующая белок, содержащий энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой связывающий домен, находится под контролем первого промоторного участка, тогда как открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу, находится под контролем как первого, так и второго промоторных участков.

[099] 5'-3' ориентация одной из открытых рамок считывания, содержащихся внтури двойного экспрессионного конструкта, может быть любой по отношению к 5'-3' ориентации другой открытой рамки считывания, при условии, что транскрипция может происходить с обеих открытых рамок считывания. В одном варианте воплощения 5'-3' ориентация одной из открытых рамок считывания находится в том же направлении, что и 5'-3' ориентация другой открытой рамки считывания. В другом одном варианте воплощения 5'-3' ориентация одной из открытых рамок считывания находится в противоположном направлении 5'-3' ориентации другой открытой рамки считывания. В одном аспекте этого варианта воплощения 5'-3' ориентация одной из открытых рамок считывания перевернута по сравнению с 5'-3' ориентацией другой открытой рамки считывания. В другом аспекте этого варианта воплощения 5'-3' ориентация одной из открытых рамок считывания отклоняется по сравнению с 5'-3' ориентацией другой открытой рамки считывания.

[0100] Способы, раскрытые в настоящем описании, включают, в числе прочего, белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. Использованный здесь термин "двуцепочечный петлевой участок" означает аминокислотную последовательность клостридиального токсина, содержащую сайт расщепления протеазой, используемый для превращения одноцепочечной формы клостридиального токсина в его двуцепочечную форму. Не имеющие ограничительного характера примеры двуцепочечного петлевого участка клостридиального токсина включают двуцепочечный петлевой участок BoNT/A, содержащий аминокислоты 430-454 из SEQ ID NO:1; двуцепочечный петлевой участок BoNT/B содержащий аминокислоты 437-446 из SEQ ID NO:2; двуцепочечный петлевой участок BoNT/C1 содержащий аминокислоты 437-453 из SEQ ID NO:3; двуцепочечный петлевой участок BoNT/D содержащий аминокислоты 437-450 из SEQ ID NO:4; двуцепочечный петлевой участок BoNT/E содержащий аминокислоты 412-426 из SEQ ID NO:5; двуцепочечный петлевой участок BoNT/F содержащий аминокислоты 429-445 из SEQ ID NO:6; двуцепочечный петлевой участок BoNT/G содержащий аминокислоты 436-450 из SEQ ID NO:7; двуцепочечный петлевой участок TeNT содержащий аминокислоты 439-467 из SEQ ID NO:8; двуцепочечный петлевой участок BaNT содержащий аминокислоты 421-435 из SEQ ID NO:9; и двуцепочечный петлевой участок BuNT содержащий аминокислоты 412-426 из SEQ ID NO:10 (Таблица 2).

[0101]

Таблица 2 Двуцепочечный петлевой участок клостридиальных токсинов Токсин Участок легкой петли Двуцепочечный петлевой участок, содержащий природный сайт расщепления протеазой Участок тяжелой цепи BoNT/A NMNFTKLKNFTGLFEFYKLL CVRGIITSKTKSLDKGYNK*--ALNDLC IKVNNWDL BoNT/B KQAYEEISKEHLAVYKIQM CKSVK*-------APGIC IDVDNEDL BoNT/C1 PALRKVNPENMLYLFTKF CHKAIDGRSLYNK*----TLDC RELLVKNTDL BoNT/D PALQKLSSESVVDLFTKV CLRLTKNSR*-----DDSTC IKVKNNRL BoNT/E PRIITPITGRGLVKKIIRF CKNIVSVKGIR*-----KSIC IEINNGEL BoNT/F PKIIDSIPDKGLVEKIVKF CKSVIPRKGTK*----APPRLC IRVNNSEL BoNT/G KEAYEEISLEHLVIYRIAM CKPVMYKNTGK*-----SEQC IIVNNEDL TeNT TNAFRNVDGSGLVSKLIGL CKKIIPPTNIRENLYNRTA*SLTDLGGELC IKIKNEDL BaNT SRIVGPIPDNGLVERFVGL CKS-IVSKKGTK*----NSLC IKVNNRDL BuNT PRIITPITGRGLVKKIIRF CKN-IVSVKGIR*-----KSIC IEINNGEL Показаны следующие аминокислотные последовательности: BoNT/A, остатки 410-462 из SEQ ID No:1; BoNT/B, остатки 418-454 из SEQ ID No:2; BoNT/C1, остатки 419-463 из SEQ ID No:3; BoNT/D, остатки 419-458 из SEQ ID No:4; BoNT/E, остатки 393-434 из SEQ ID No:5; BoNT/F, остатки 410-453 из SEQ ID No:6; BoNT/G, остатки 419-458 из SEQ ID No:7; TeNT, остатки 422-475 из SEQ ID No:8; BaNT, остатки 402-443 из SEQ ID No:9; и BuNT, остатки 393-434 из SEQ ID No:10. Звездочкой (*) указана пептидная связь, в которой клостридиальный токсин расщепляется протеазой.

[0102] Как упомянуто выше, клостридиальные токсины транслируются как одноцепочечный полипептид приблизительно 150 кДа, который затем расщепляется путем протеолитического расщепления внутри дисульфидной петли природной протеазой. Этот посттрансляционный процесс приводит к появлению двуцепочечной молекулы, содержащей примерно 50 кДа легкую цепь (LC) и примерно 100 кДа тяжелую цепь, (НС), удерживаемых вместе одной дисульфидной связью и нековалентными взаимодействиями. Хотя протеаза в настоящее время неизвестна, двуцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой определен для многих клостридиальных токсинов. У BoNTs расщепление в K448-А449 превращает одиночную форму полипептида BoNT/A в двуцепочечную форму; расщепление в K441-А442 превращает одиночную форму полипептида BoNT/B в двуцепочечную форму; расщепление в K449-Т450 превращает одиночную форму полипептида BoNT/C1 в двуцепочечную форму; расщепление в R445-D446 превращает одиночную форму полипептида BoNT/D в двуцепочечную форму; расщепление в R422-K423 превращает одиночную форму полипептида BoNT/E в двуцепочечную форму; расщепление в K439-А440 превращает одиночную форму полипептида BoNT/F в двуцепочечную форму; и расщепление в K446-S447 превращает одиночную форму полипептида BoNT/G в двуцепочечную форму. Протеолитическое расщепление одиночной формы полипептида TeNT в A457-S458 приводит к двуцепочечной форме. Протеолитическое расщепление одиночной формы полипептида BaNT в K431-N432 приводит к двуцепочечной форме. Протеолитическое расщепление одиночной формы полипептида BuNT в R422-K423 приводит к двуцепочечной форме. Такой двуцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой функционально связан с рамкой считывания в модифицированном клостридиальном токсине как гибридный белок. Однако следует также заметить, что расщепление дополнительных сайтов расщепления внутри двуцепочечной петли также, по видимому, приводит к тому, что теряется маленький пептидный фрагмент. В качестве примера, не имеющего ограничительного характера, расщепление BoNT/A одноцепочечного полипептида в конечном итоге приводит к потере фрагмента из десяти аминокислот внутри двуцепочечной петли.

[0103] Предполагается, что любая молекула, которая содержит двуцепочечный петлевой участок, может быть модифицирована для включения сайта расщепления экзогенной протеазой, используемого для раскрытых способов. Примеры молекул, которые могут иметь двуцепочечную петлю, модифицированную для включения сайта расщепления экзогенной протеазой, используемого для раскрытых спсобов, включают, например, Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, Патент США 5,989,545; Clifford С.Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, Патент США 6,461,617; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, Патент США 6,632,440; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, Патент США 6,843,998; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Патент США 7,244,437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Патент США 7,413,742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Патент США 7,425,338; каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[0104] Двуцепочечный петлевой участок модифицируется добавлением сайта расщепления экзогенной протеазой. Использованный здесь термин "сайт расщепления экзогенной протеазой" синонимичен "сайту расщепления не природной протеазой" или "сайту расщепления не нативной протеазой" и относится к сайту расщепления протеазой, который в норме не присутствует в двуцепочечном петлевом регионе из природного клостридиального токсина. Предполагается, что любые без исключения сайты расщепления экзогенной протеазой, которые можно использовать для превращения одноцепочечной полипептидной формы клостридиального токсина в двуцепочечную форму, пригодны для практических аспектов настоящего изобретения. Не имеющие ограничительного характера примеры сайтов расщепления экзогенной протеазой включают, например, сайт расщепления энтерокиназой протеазой, сайт расщепления человеческого риновируса 3С протеазой, сайт расщепления человеческого энтеровируса 3С протеазой, сайт расщепления вируса мозаики табака (TEV) протеазой, сайт расщепления вируса просветления жилок турнепса протеазой, сайт расщепления субтилизин протеазой, или сайт расщепления каспазой 3 протеазой.

[0105] Предполагается, что в аспектах настоящего изобретения может быть использован сайт расщепления экзогенной протеазой любой без исключения длины, при условии, что сайт расщепления экзогенной протеазой возможно расщепить соответствующей протеазой. Таким образом, в аспектах этого варианта воплощения, сайт расщепления экзогенной протеазой может иметь длину, например, не менее чем 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 60 аминокислот; или не более чем 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 60 аминокислот.

[0106] В варианте воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления экзогенной протеазой. В аспектах этого варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок модифицирован для включения, например, сайта расщепления энтерокиназой протеазой, сайта расщепления вируса мозаики табака (TEV) протеазой, сайта расщепления вируса просветления жилок турнепса протеазой, сайта расщепления человеческого риновируса 3С протеазой, сайта расщепления человеческого энтеровируса 3С протеазой, сайта расщепления субтилизином, и сайта расщепления каспазой 3. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой находится внутри двуцепочечной петли, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT или BuNT. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой находится внутри двуцепочечной петли белка, раскрытого, например, в Патенте США 5989545; Патенте США 6461617; Патенте США 6632440; Патенте США 6843998; Патенте США 7244437; Патенте США 7413742; и Патенте США 7425338.

[0107] В одном аспекте этого варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления вируса мозаики табака протеазой, имеющий консенсную последовательность E-P5-P4-Y-P2-Q*-G (SEQ ID NO:27) или E-P5-P4-Y-P2-Q*-S (SEQ ID NO:28), где P2, P4 и Р5 может быть любой аминокислотой. В других аспектах варианта воплощения, двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления вируса мозаики табака протеазой, содержащий SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:38. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления вируса мозаики табака протеазой находится внутри двуцепочечной петли например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, или BuNT. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления вируса мозаики табака протеазой находится внутри двуцепочечной петли белка, раскрытого, например, в Патенте США 5,989,545; Патенте США 6,461,617; Патенте США 6,632,440; Патенте США 6,843,998; Патенте США 7,244,437; Патенте США 7,413,742 и Патенте США 7,425,338.

[0108] В другом аспекте этого варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления вируса просветления жилок турнепса протеазой, имеющий консенсную последовательность P6-P5-V-R-F-Q*-G (SEQ ID NO:39) или P6-P5-V-R-F-Q*-S (SEQ ID NO:40), где Р5 и Р6 может быть любой аминокислотой. В других аспектах варианта воплощения, двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления вируса просветления жилок турнепса протеазой, содержащий SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, или SEQ ID NO:44. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления вируса просветления жилок турнепса протеазой находится внутри двуцепочечной петли, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, или BuNT. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления вируса просветления жилок турнепса протеазой находится внутри двуцепочечной петли белка, раскрытого, в например, Патенте США 5989545; Патенте США 6461617; Патенте США 6632440; Патенте США 6843998; Патенте США 7244437; Патенте США 7413742 и Патенте США 7425338.

[0109] В еще одном аспекте этого варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления человеческого риновируса 3С протеазой, имеющий консенсную последовательность P5-P4-L-F-Q*-G-P (SEQ ID NO:45), где Р4 представляет собой G, А, V, L, I, M, S или Т и Р5 может быть любой аминокислотой, при этом D или Е предпочтительны. В других аспектах варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления человеческого риновируса 3С протеазой, содержащий SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 или SEQ ID NO:51. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления человеческого риновируса 3С протеазой находится внутри двуцепочечной петли, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, или BuNT. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления человеческого риновируса 3С протеазой находится внутри двуцепочечной петли белка, раскрытого, например, в Патенте США 5989545; Патенте США 6461617; Патенте США 6632440; Патенте США 6843998; Патенте США 7244437; Патенте США 7413742; и Патенте США 7425338.

[0110] В еще одном аспекте этого варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления субтилизином протеазой, имеющий консенсную последовательность P6-P5-P4-P3-H*-Y (SEQ ID NO:52) или P6-P5-P4-P3-Y-H* (SEQ ID NO:53), где Р3, Р4 и Р5 и Р6 может быть любой аминокислотой. В других аспектах варианта воплощения, двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления субтилизином протеазой, содержащий SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, или SEQ ID NO:56. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления субтилизином протеазой находится внутри двуцепочечной петли, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, или BuNT. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления субтилизином протеазой находится внутри двуцепочечной петли белка, раскрытого, например, в Патенте США 5989545; Патенте США 6461617; Патенте США 6632440; Патенте США 6843998; Патенте США 7244437; Патенте США 7413742; и Патенте США 7425338.

[0111] В дальнейшем аспекте этого варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления каспазой 3 протеазой, имеющий консенсную последовательность D-P3-P2-D*P1' (SEQ ID NO:57), где Р3 может быть любой аминокислотой, при этом Е предпочтительна, Р2 может быть любой аминокислотой и Р1' может быть любой аминокислотой, при этом G или S предпочтительны. В других аспектах варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления каспазой 3 протеазой, содержащий SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, или SEQ ID NO:63. В других дополнительных аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления каспазой 3 протеазой находится внутри двуцепочечной петли, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, или BuNT. В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления каспазой 3 протеазой локализован внутри двуцепочечной петли белка, раскрытой, например, в Патенте США 5989545; Патенте США 6461617; Патенте США 6632440; Патенте США 6843998; Патенте США 7244437; Патенте США 7413742; и Патенте США 7425338.

[0112] В еще одном аспекте этого варианта воплощения двуцепочечный петлевой участок содержит сайт расщепления энтерокиназой протеазой, имеющий имеющий консенсную последовательность DDDDK (SEQ ID NO:64). В других аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления энтерокиназой протеазой находится внутри двуцепочечной петли, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, или BuNT. В других дополнительных аспектах этого варианта воплощения сайт расщепления энтерокиназой протеазой локализован внутри двуцепочечной петли белка, раскрытой, например, в Патенте США 5989545; Патенте США 6461617; Патенте США 6632440; Патенте США 6843998; Патенте США 7244437; Патенте США 7413742; и Патенте США 7425338.

[0113] Двуцепочечный петлевой участок модифицирован для замещения природного двуцепочечного петлевого сайта расщепления протеазой на сайт расщепления экзогенной протеазой. В этой модификации природный двуцепочечный сайт расщепления протеазой делается нефункциональным и таким образом не может расщепляться своей протеазой. Только сайт расщепления экзогенной протеазой может расщепляться соответствующей экзогенной протеазой. В этом типе модификации сайт экзогенной протеазы функционально связан внутри рамки считывания с модифицированным клостридиальным токсином как гибридный белок и сайт может расщепляться соответствующей экзогенной протеазой. Замещение эндогенного двуцепочечного сайта расщепления протеазой сайтом расщепления экзогенной протеазой может происходить как замена сайтов, где экзогенный сайт конструируется в позиции, сходной с местоположением экзогенного сайта расщепления. Замещение эндогенного двуцепочечного сайта расщепления протеазой сайтом расщепления экзогенной протеазой может происходить как добавление экзогенного сайта, где экзогенный сайт конструируется в позиции, отличной от местоположения эндогенного сайта расщепления, а эндогенный сайт делается нефункциональным.

[0114] Природный сайт расщепления протеазой, находящийся внутри двуцепочечного участка, может быть сделан нефункциональным путем изменения не менее чем двух аминокислот, фланкирующих пептидную связь, расщепляемую природной протеазой двуцепочечной петли. Могут быть произведены более значительные изменения, с условием, что два цистеиновых остатка двуцепочечного петлевого участка остаются интактными и участок все еще может формировать дисульфидный мостик. Не имеющие ограничительного характера примеры изменений аминокислот включают делецию аминокислоты или замену первоначальной аминокислоты другой аминокислотой. Таким образом, в одном варианте воплощения, природный сайт расщепления протеазой, находящийся внутри двуцепочечного петлевого участка, делается нефункциональным путем изменения двух аминокислот, фланкирующих пептидную связь, расщепляемую природной протеазой. В других аспектах этого варианта воплощения природный сайт расщепления протеазой, находящийся внутри двуцепочечного петлевого участка, делается нефункциональным путем изменения, например, не менее чем три аминокислоты, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем четыре аминокислоты, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем пять аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем шесть аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем семь аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем восемь аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем девять аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем десять аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не менее чем 15 аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; или не менее чем 20 аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой.

[0115] В других аспектах этого варианта воплощения природный двуцепочечный сайт расщепления протеазой, находящийся внутри двуцепочечного участка, делается нефункциональным путем изменения, например, не более чем трех аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем четырех аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем пяти аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем шести аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем семи аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем восьми аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем девяти аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем десяти аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; не более чем 15 аминокислот, включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой; или не более чем 20 аминокислот включая две аминокислоты, фланкирующие пептидную связь, расщепляемую природной протеазой.

[0116] Способы, раскрытые в настоящем описании, включают, в числе прочего, клетку. Предполагается, что могут быть использованы все без исключения клетки. Таким образом, аспекты этого варианта воплощения включают, без ограничения, прокариотические клетки, включая, без ограничения, штаммы аэробных, микроаэрофильных, капрофильных, факультативных, анаэробных, грамотрицательных и грамположительных бактериальных клеток, таких как происходящие из, например, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens и Salmonella typhimurium; и эукариотические клетки включая, без ограничения, штаммы дрожжей, такие как, например, происходящие из Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica; клетки насекомых и клеточные линии, полученные из насекомых, такие как, например, происходящие из Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster и Manduca sexta; и клетки млекопитающих и клеточные линии, происходящие из клеток млекопитающих, такие как, например, происходящие из мышиных, крысиных, хомячьих, свиных, бычьих, конских, клеток приматов и человеческих клеток. Клеточные линии могут быть получены из коллекции культуры американского типа, европейской коллекции клеточных культур и германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур. Не имеющие ограничительного характера примеры специфических протоколов для выбора, создания и использования подходящих клеточных линий описаны, например, в insect cell culture engineering (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); insect cell cultures: fundamental and applied aspects (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & lan F. Rae, general techniques of cell culture (Cambridge University Press, 1997); cell AND tissue culture: laboratory procedures (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. lan Freshney, culture of animal cells: A manual of basic technique (Wiley-Liss, 4^th ed. 2000); animal cell culture: A practical approach (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3^rd ed. 2000); molecular cloning A laboratory manual, supra, (2001); basic cell culture: A practical approach (John M. Davis, Oxford Press, 2^nd ed. 2002); и current protocols in molecular biology, supra, (2004). Эти протоколы и стандартные процедуры находятся в пределах компетенции специалистов в данной области и в объеме изложенного здесь.

[0117] Способы, раскрытые в настоящем описании, включают, в числе прочего, введение в клетку экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, как раскрыто в настоящем описании. Экспрессионный конструкт или двойной экспрессионный конструкт, введенный в клетку, может временно или стабильно поддерживаться в этой клетке. Стабильно поддерживающиеся экспрессионные конструкты или двойные экспрессионные конструкты могут быть экстрахромосомными и реплицироваться автономно, или они могут быть интегрированы в хромосомный материал клетки и реплицироваться не автономно. Предполагается, что могут быть использованы все без исключения способы для введения в клетку экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании. Способы, используемые для введения в клетку экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта включают, без ограничительного характера, химически опосредованную трансфекцию, такую как, например, опосредованную фосфатом кальция, опосредованную диэтиламиноэтилдекстраном (DEAE), липид-опосредованную, полиэтиленимин (PEI)-опосредованную, полилизин-опосредованную и полибрен-опосредованную; физически опосредованную трансфекцию, такую как, например, доставка биолистическими частицами, микроинъекции, слияние протопластов и электропорация; и вирусно опосредованную трансфекцию, такую как, например, опосредованную ретровирусами трансфекцию, см., например. Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp.16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol.3, 3^rd ed. 2001). Специалист в данной области поймет, что выбор определенного метода введения экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта в клетку будет зависеть, в числе прочего, от того, будет ли клетка временно содержать экспрессионный конструкт или двойной экспрессионный конструкт, или же клетка постоянно будет содержать экспрессионный конструкт или двойной экспрессионный конструкт. Эти протоколы и стандартные процедуры находятся в пределах компетенции специалистов в данной области и в объеме изложенного здесь.

[0118] В одном аспекте этого варианта воплощения химически опосредованный способ, называемый трансфекцией, используется для введения экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании, в клетку. В химически опосредованных способах трансфекции химический реагент формирует комплекс с экспрессионным конструктом или двойным экспрессионным конструктом, который способствует его проникновению в клетку. Такие химические реагенты включают, без ограничительного характера, опосредованную фосфатом кальция, см., например, Martin Jordan & Florian Worm, Transaction of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); опосредованную диэтиламиноэтилдекстраном (DEAE), липид-опосредованную, опосредованную катионным полимером, такую как полиэтиленимин (PEI)-опосредованную и полилизин-опосредованную и полибрен-опосредованную, см, например, Chun Zhang et al., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004). Такие химически опосредованные системы доставки могут быть приготовлены по стандартным методам и имеются в продаже, см., например, CellPhect Transfection набор (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); Mammalian Transfection набор. Calcium phosphate и DEAE Dextran, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); Lipofectamine™ Transfection Reagent (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen 500 Transfection набор (Fermentas, Inc., Hanover, MD), и SuperFect и Effectene Transfection наборы (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

[0119] В другом аспекте этого варианта воплощения физически опосредованный способ используется для введения экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного 1:онструкта, раскрытых в настоящем описании, в клетку. Физические техники включают, без ограничительного характера, электропорацию, биолистику и микроинъекцию. Биолистические и микроинъекционные техники пробивают клеточную стенку для того чтобы ввести экспрессионный конструкт или двойной экспрессионный конструкт в клетку, см., например, Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); и John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004). Электропорация, также называемая электропермеабилизацией, использует короткие, высоковольтовые электрические импульсы для создания временных пор в мембране, через которые полинуклеотидные молекулы проникают и могут быть эффективно использованы для стабильных и временных трансфекций всех клеточных типов, см., например, М. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); и Oliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004).

[0120] В другом аспекте этого варианта воплощения, вирусно опосредованный способ, называемый трансдукцией, используется для введения экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании, в клетку. В вирусно опосредованных методах временной трансдукции процесс, благодаря которому вирусные частицы инфицируют и реплицируются в клетке хозяина, управляется, для того чтобы использовать этот механизм для введения экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта в клетку. Вирусно опосредованные способы разработаны на широком множестве вирусов, включая, без ограничительного характера, ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, вирусы простого герпеса, пикорнавирусы, альфавирусы и бакуловирусы, см., например, Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); и Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschia, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alpha-viral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); и A. Huser & С.Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003).

[0121] Аденовирусы, которые являются не покрытыми оболочкой вирусами с двунитевой ДНК, часто выбираются для трансдукции клеток млекопитающих, потому что аденовирусы обладают сравнительно большими полинуклеотидными молекулами около 36 кб, производятся с большим титром и могут эффективно инфицировать широкое множество как делящихся, так и неделящихся клеток, см., например, Wim Т. J. M. С.Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adeno viral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); и Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001). Трансдукция с использованием основанной на аденовирусах системы не поддерживает пролонгированную экспрессию белка, поскольку молекула нуклеиновой кислоты переносится эписомой в клеточные ядра, а не интегрируется в хромосому клетки хозяина. Аденовирусные векторные системы и специфические протоколы того, как использовать такие векторы, раскрыты в, например, VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002); и ADEASY™ Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) и ADEASY™ Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc..

[0122] Введение в клетку экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании, может также быть достигнуто с использованием однонитевых РНК ретровирусов, таких как, например, онкоретровирусы и лентивирусы. Опосредованная ретровирусами трансдукция часто дает трансдукционную эффективность, близкую к 100%, может легко контролировать число провирусных копий, варьируя кратность инфицирования (MOI), и может быть использована как для временной, так и для стабильной трансдукции клеток, см., например, Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); и Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004). Ретровирусные частицы содержат РНК геном, упакованный в белковую капсиду, окруженную липидной оболочкой. Ретровирус инфицирует клетку хозяина, путем введения своей РНК в цитоплазму одновременно с ферментом обратной транскриптазой. РНК матрица затем обратно транскрибируется в линейную двунитевую кДНК, которая реплицируется путем интеграции в геном клетки-хозяина. Вирусные частицы распространяются как вертикально (от родительской клетки к дочерним клеткам через провирусы), так и горизонтально (от клетки к клетке через вирионы). Такая репликационная стратегия делает возможной долговременную постоянную экспрессию, поскольку представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты стабильно интегрированы в хромосому клетки-хозяина, тем самым делая возможной долговременную экспрессию белка. Например, исследования на животных показали, что лентивирусные векторы, вводимые во множество тканей, дают длителную белковую экспрессию более чем 1 год, см., например, Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996). Основанные на онковирусах системы, такие как, например, вирус мышиного лейкоза Молони (MoMLV), широко используются и инфицируют много различных не делящихся клеток. Лентивирусы также могут инфицировать много различных типов клеток, включая делящиеся и не делящиеся клетки, и обладают белками комплекса оболочки, что делает возможной высокую специфичность связывания с клетками.

[0123] Ретровирусные векторы и специфические протоколы того, как использовать такие векторы, раскрыты, например, в Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters. Патент США 5,464,758, Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression. Патент США 5,814,618, David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same. Патент США 5,514,578, и David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, Патент США 6,245,531; Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations. Патент США 5,364,791,, Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy. Патент США 5,874,534, и Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy. Патент США 5,935,934. Кроме того, такие вирусные системы доставки могут быть приготовлены по стандартным методам и имеются в продаже, см., например, BD™ Tet-Off и Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) и BD™ Tet-Off и Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (Mar. 14, 2003), GENESWITCH™ System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and GENESWITCH™ System A Mifepristone-Regulated Expression System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov. 4, 2002); VIRAPOWER™ Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWER™ Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec. 8, 2003); and COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) and COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005e.

[0124] Способы, раскрытые в настоящем описании, включают, в числе прочего, экспрессию экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании. Предполагается, что любая из множества экспрессионных систем может быть использована для экспрессии экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании включая, без ограничений, основанные на клетке системы и бесклеточные экспрессионные системы. Основанные на клетке системы включают, без ограничительного характера, вирусные экспрессионные системы, прокариотические экспрессионные системы, дрожжевые экспрессионные системы, бакуловирусные экспрессионные системы, экспрессионные системы насекомых и экспрессионные системы млекопитающих. Бесклеточные системы включают, без ограничительного характера, экстракт из пшеничных зародышей, экстракты из ретикулоцитов кролика и экстракты Е.coli и в целом эквивалентны способам, описанным здесь. Экспрессия экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, используемых в экспрессионной системе, может включать любую из множества характеристик, включая, без ограничительного характера, индуцируемую экспрессию, не индуцируемую экспрессию, постоянную экспрессию, опосредованную вирусами экспрессию, стабильно интегрированную экспрессию и транзиентную экспрессию. Экспрессионные системы, которые включают хорошо охарактеризованные векторы, реагенты, условия и клетки, хорошо известны и имеются в продаже у торговых поставщиков, которые включают, без ограничительного характера, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; and Stratagene, La Jolla, CA. He имеющие ограничительного характера примеры выбора и использования подходящих гетерологичных экспрессионных систем описаны, например, в PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); и Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) current science 1121-1128, (2001). Эти протоколы являются общеизвестными процедурами, находящимися в пределах компетенции и в объеме изложенных здесь сведений.

[0125] Множество основанных на клетке экспрессионных процедур используются для экспрессии экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании. Не имеющие ограничительного характера примеры включают вирусные экспрессионные системы, прокариотические экспрессионные системы, дрожжевые экспрессионные системы, бакуловирусные экспрессионные системы, экспрессионные системы насекомых и экспрессионные системы млекопитающих. Вирусные экспрессионные системы включают, без ограничительного характера, VIRAPOWER™ Лентивирусные (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), Аденовирусные Экспрессионные Системы (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), ADEASY™ XL Adeno viral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA) и VIRAPORT® Ретровирусная Генная Экспрессионная Система (Stratagene, La Jolla, CA). He имеющие ограничительного характера примеры прокариотических экспрессионных систем включают CHAMPION™ рЕТ Экспрессионную Систему (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), TRIEX™ Бактериальную Экспрессионную Систему (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), QIAEXPRESS® Экспрессионную Систему (QIAGEN, Inc.), и AFFINITY® Систему Экспрессии и Очистки Белка (Stratagene, La Jolla, СА). Дрожжевые экспрессионные системы включают, без ограничительного характера, EASYSELECT™ Pichia Экспрессионный Набор (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), YES-ECHO™ Наборы Экспрессионных Векторов (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА) и SPECTRA™ S. pombe Экспрессионную Систему (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА). Не имеющие ограничительного характера примеры бакуловирусных экспрессионных систем включают BACULODIRECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), ВАС-ТО-ВАС® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), и BD BACULOGOLD™ (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, СА). Экспрессионные системы насекомых включают, без ограничительного характера, Drosophila Экспрессионную Систему (DES®) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), INSECTSELECT™ Систему (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА) и INSECTDIRECT™ Систему (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). He имеющие ограничительного характера примеры экспрессионных систем млекопитающих включают T-REX™ (Tetracycline-Regulated Expression) Систему (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), FLP-IN™ T-REX™ Систему (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), pcDNA™ систему (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), pSecTag2 систему (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), EXCHANGER® Систему, INTERPLAY™ Млекопитающих ТАР Систему (Stratagene, La Jolla, СА), COMPLETE CONTROL® Индуцируемую Экспрессионную Систему Млекопитающих (Stratagene, La Jolla, СА) b LACSWITCH II Индуцируемую Экспрессионную Систему Млекопитающих (Stratagene, La Jolla, СА).

[0126] В других процедурах экспрессии экспрессионного конструкта или двойного экспрессионного конструкта, раскрытых в настоящем описании, задействована бесклеточная экспрессионная система, такая как, без ограничительного характера, прокариотические экстракты и эукариотические экстракты. Не имеющие ограничительного характера примеры прокариотических клеточных экстрактов включают RTS 100 Е.coli HY Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), ACTIVEPRO™ In Vitro Translation Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), ECOPRO™ System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) и Expressway™ Plus Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА). Эукариотический клеточный экстракт включает, без ограничительного характера, RTS 100 Wheat Germ CECF Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems (Promega Corp., Madison, WI), Wheat Germ IVT™ Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), Retic Lysate IVT™ Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), PROTEIN SCRIPT® II System (Ambion, Inc., Austin, TX) и TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega Corp., Madison, WI).

[0127] Способы, раскрытые в настоящем описании, включают, в числе прочего, рост клетки при первой температуре в течение определенного периода времени и затем рост клетки при второй температуре в течение определенного периода времени. Первая и вторая температуры и периоды времени, в течение которых клетки растут при первой и второй температурах, определяются на основе желаемого количества белка, экспрессируемого в клетке, и желаемой эффективности расщепления сайта расщепления экзогенной протеазой, находящегося внутри двуцепочечного петлевого участка, превращающего одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[0128] В одном варианте воплощения клетка растет при первой температуре в течение определенного периода времени для того чтобы достигнуть максимальной плотности клеток. В аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 37°С в течение около 0.5 часа, около 1.0 часа, около 1.5 часов, около 2.0 часов, около 3.0 часов, около 3.5 часов, около 4.0 часов, около 5.0 часов, около 6.0 часов, около 7.0 часов, около 8.0 часов, около 9.0 часов или около 10 часов. В других аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 42°С в течение около 0.5 часов, около 1.0 часа, около 1.5 часов, около 2.0 часов, около 3.0 часов, около 3.5 часов, около 4.0 часов, около 5.0 часов. В аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 30°С в течение около 0.5 часов, около 1.0 часа, около 1.5 часов, около 2.0 часов, около 3.0 часов, около 3.5 часов, около 4.0 часов, или около 5.0 часов. В других аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 12°С в течение от около 2 часов до около 8 часов, при около 16°С в течение от около 2 часов до около 8 часов, при около 20°С в течение от около 2 часов до около 8 часов, или при около 24°С в течение от около 2 часов до около 8 часов. В других аспектах этого варианта воплощения клетка растет при от около 12°С до около 16°С в течение от около 2 часов до около 8 часов, или при от около 20°С до около 24°С в течение от около 2 часов до около 8 часов.

[0129] В другом варианте воплощения клетка растет при второй температуре в течение определенного периода времени для того чтобы достигнуть максимальной индукции экспрессии белка. В аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 37°С в течение около 1.5 часов, около 2.5 часов, около 3.5 часов, около 4.5 часов, около 5.5 часов, около 6.5 часов, около 7.5 часов, около 8.5 часов, около 9.5 часов, около 10.5 часов, около 11.5 часов, около 12.5 часов, около 13.5 часов, около 14.5 часов, около 15.5 часов, около 16.5 часов, или около 24.5 часов. В других аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 30°С в течение около 1.5 часов, около 2.5 часов, около 3.5 часов, около 4.5 часов, около 5.5 часов, около 6.5 часов, около 7.5 часов, около 8.5 часов, около 9.5 часов, около 10.5 часов, около 11.5 часов, около 12.5 часов, около 13.5 часов, около 14.5 часов, около 15.5 часов, около 16.5 часов, или около 24.5 часов. В других аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 25°С в течение около 1.5 часов, около 2.5 часов, около 3.5 часов, около 4.5 часов, около 5.5 часов, около 6.5 часов, около 7.5 часов, около 8.5 часов, около 9.5 часов, около 10.5 часов, около 11.5 часов, около 12.5 часов, около 13.5 часов, около 14.5 часов, около 15.5 часов, около 16.5 часов, или около 24.5 часов. В других аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 22°С в течение около 1.5 часов, около 2.5 часов, около 3.5 часов, около 4.5 часов, около 5.5 часов, около 6.5 часов, около 7.5 часов, около 8.5 часов, около 9.5 часов, около 10.5 часов, около 11.5 часов, около 12.5 часов, около 13.5 часов, около 14.5 часов, около 15.5 часов, около 16.5 часов, или около 24.5 часов. В дальнейших аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 16°С в течение около 1.5 часов, около 2.5 часов, около 3.5 часов, около 4.5 часов, около 5.5 часов, около 6.5 часов, около 7.5 часов, около 8.5 часов, около 9.5 часов, около 10.5 часов, около 11.5 часов, около 12.5 часов, около 13.5 часов, около 14.5 часов, около 15.5 часов, около 16.5 часов, или около 24.5 часов. В других дальнейших аспектах этого варианта воплощения клетка растет при около 12°С в течение около 1.5 часов, около 2.5 часов, около 3.5 часов, около 4.5 часов, около 5.5 часов, около 6.5 часов, около 7.5 часов, около 8.5 часов, около 9.5 часов, около 10.5 часов, около 11.5 часов, около 12.5 часов, около 13.5 часов, около 14.5 часов, около 15.5 часов, около 16.5 часов, или около 24.5 часов.

[0130] Аспекты настоящего изобретения можно также описать следующим образом:

1. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ включает в себя следующие этапы:

а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при первой температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной плотности клеток, двойной экспрессионный конструкт содержит;

i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; и

ii) открытую рамку считывания, кодирующую протеазу; при этом протеаза может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли;

б) рост клетки при второй температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной индукции экспрессии белка с открытой рамки считывания, кодирующей одноцепочечный белок,

отличающийся тем, что рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и

отличающийся тем, что производимая протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самьм превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

2. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина в его двуцепочечную форму, способ включает в себя следующие этапы:

а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение около 3,5 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит;

i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный клостридиальный токсин, одноцепочечный клостридиальный токсин, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, домен связывания и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; и

ii) открытую рамку считывания, кодирующую протеазу; при этом протеаза может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся внутри двуцепочечной петли;

б) рост клетки при 22°С от около 16 до около 18 часов,

отличающийся тем, что рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного клостридиального токсина и протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и

отличающийся тем, что производимая протеаза расщепляет одноцепочечный клостридиальный токсин в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный клостридиальный токсин в его двуцепочечную форму.

3. Внутриклеточный способ по п.2, отличающийся тем, что одноцепочечный клостридиальный токсин содержит следующую линейную амино-карбоксильную очередность одного полипептида: 1) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина; 2) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, связывающий домен клостридиального токсина и транслокационный домен клостридиального токсина; 3) связывающий домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и энзимный домен клостридиального токсина; 4) связывающий домен клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и транслокационный домен клостридиального токсина; 5) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, энзимный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина; или 6) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, клостридиальный связывающий домен и энзимный домен клостридиального токсина.

4. Внутриклеточный способ по п.2, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.

5. Внутриклеточный способ по п.2, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.

6. Внутриклеточный способ по п.2, отличающийся тем, что связывающий домен клостридиального токсина представляет собой связывающий домен BoNT/A связывающий домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/C1, связывающий домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/E, связывающий домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/G, связывающий домен TeNT, связывающий домен BaNT, или связывающий домен BuNT.

7. Внутриклеточный способ по п.2, отличающийся тем, что сайт расщепления экзогенной протеазой представляет собой сайт расщепления энтерокиназой протеазой, сайт расщепления протеазой человеческого риновируса 3С, сайт расщепления протеазой человеческого энтеровируса 3С, сайт расщепления протеазой вируса мозаики табака (TEV), сайт расщепления протеазой вируса просветления жилок турнепса (TVMV), сайт расщепления субтитилизином протеазой, или сайт расщепления каспазой 3 протеазой.

8. Внутриклеточный способ по п.2, отличающийся тем, что протеаза представляет собой энтерокиназу протеазу, 3С протеазу человеческого риновируса, 3С протеазу человеческого энтеровируса, протеазу вируса мозаики табака (TEV), протеазу вируса просветления жилок турнепса (TVMV), субтилизин протеазу, или каспазу 3 протеазу.

9. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ включает в себя следующие этапы:

а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит;

i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок содержит энзимный домен, транслокационный домен, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой, домен связывания опиоидов; и

ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу;

б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов,

отличающийся тем, что рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и

отличающийся тем, что производимая протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

10. Внутриклеточный способ по п.9, отличающийся тем, что белок содержит следующую линейную амино-карбоксильную очередность 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, 2) энзимный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, и транслокационный домен клостридиального токсина, 3) интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, транслокационный домен клостридиального токсина, и энзимный домен клостридиального токсина, 4) интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, энзимный домен клостридиального токсина, и транслокационный домен клостридиального токсина, 5) транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, и энзимный домен клостридиального токсина, или 6) транслокационный домен клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина, и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов.

11. Внутриклеточный способ по п.9, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.

12. Внутриклеточный способ по п.9, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.

13. Внутриклеточный способ по п.9, отличающийся тем, что интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов представляет собой интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания ноцицептина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания динорфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания энкефалина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания ВАМ22, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндоморфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндорфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания геморфина, или интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания риморфина.

14. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ включает в себя следующие этапы:

а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит;

i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок содержит энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и

ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу;

б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов,

отличающийся тем, что рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и

отличающийся тем, что производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри двуцепочечного участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

15. Внутриклеточный способ по п.14, отличающийся тем, что одноцепочечный клостридиальный токсин содержит следующую линейную амино-карбоксильную очередность 1) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен не клостридиального токсина; 2) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, связывающий домен не клостридиального токсина и транслокационный домен клостридиального токсина; 3) связывающий домен не клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой и энзимный домен клостридиального токсина; 4) связывающий домен не клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой и транслокационный домен клостридиального токсина; 5) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, энзимный домен клостридиального токсина и связывающий домен не клостридиального токсина; или 6) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, связывающий домен не клостридиального токсина и энзимный домен клостридиального токсина.

16. Внутриклеточный способ по п.14, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.

17. Внутриклеточный способ по п.14, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.

18. Внутриклеточный способ по п.14, отличающийся тем, что связывающий домен не клостридиального токсина является доменом связывания пептида опиоида, доменом связывания пептида меланокортина, доменом связывания пептида галанина, доменом связывания пептида гранина, доменом связывания пептида тахикинина, доменом связывания пептида, родственного нейропептиду Y, доменом связывания пептида нейрогормона, доменом связывания пептида цитокина, доменом связывания пептида кинина, доменом связывания пептида фактора роста фибробластов, доменом связывания пептида нейротрофина, доменом связывания пептида фактора некроза опухоли, доменом связывания пептида нейротрофического фактора глии, доменом связывания пептида трансформационного фактора роста β, доменом связывания пептида костного морфогенетического белка, доменом связывания пептида фактора роста и дифференциации, доменом связывания пептида активина, доменом связывания пептида фактора роста эндотелия сосудов, доменом связывания пептида инсулин фактора роста, доменом связывания пептида эпидермального фактора роста, доменом связывания пептида глюкагон-подобного гормона, доменом связывания пептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза, доменом связывания пептида гормона высвобождения гормона роста, доменом связывания вазоактивного кишечного пептида, доменом связывания пептида желудочного ингибиторного полипептида доменом связывания пептида кальцитонин-связанных пептидов висцеральных органов, или связывающего домена пептида активируемого протеазой рецептора.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 Варианты TEV протеазы

[0131] Следующий пример иллюстрирует, как создать и использовать варианты TEV протеазы, которые обладают повышенной стабильностью и/или растворимостью.

А. Создание pET29/TEV экспрессионных конструктов.

[0132] Для того чтобы произвести TEV протеазу рекомбинантно, открытая рамка считывания, кодирующая желаемую TEV протеазу, была синтезирована с использованием стандартных процедур (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA). Комплементарные олигонуклеотиды длиной от 20 до 50 оснований, охватывающих полную открытую рамку считывания, были синтезированы с использованием стандартного фосфорамидного синтеза. Эти олигонуклеотиды были гибридизированы в двухнитевые дуплексы, которые были последовательно соединены вместе для сборки полинуклеотидной молекулы полной длины. Эта полинуклеотидная молекула была клонирована с использованием стандартных методов молекулярной биологии в pUCBHB1 вектор, несущий SmaI сайт, для образования pUCBHB1/TEV плазмид. Синтезированная полинуклеотидная молекула была верифицирована путем секвенирования с использованием BIG DYE TERMINATOR™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и ABI 3100 секвенатора (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[0133] Открытые рамки считывания, кодирующие варианты TEV, были кодон-оптимизированы для экспрессии в Е.coli и все кодировали протеолитический фрагмент из приблизительно 250 аминокислот приблизительно 27.5 кДа, соответствующий основаниям 2038-2279 TEV полипротеина полной длины, с присоединенным или на N-, или на С-конце полигистидиновым «тагом» аффинной очистки. В результате рекомбинантной экспрессии TEV протеазы дикого типа получается белок, который обладает свойством расщеплять себя в Серине 219, образуя укороченную протеазу с сильно уменьшенной протеолитической активностью. Таким образом, для почти полного исключения аутопротеолиза и последующего образования такого укороченного продукта, были синтезированы TEV варианты, у которых Серии 219 был заменен или на Аспарагин (S219N), или на Валин (S219V). Кроме того, есть данные, что хотя рекомбинантная TEV протеаза дикого типа экспрессируется в очень высоких концентрациях у Е.coli, она почти полностью нерастворима (Kapust et al., 2001). Таким образом, для повышения растворимости экспрессируемой TEV, несколько вариантов аминокислот были созданы и протестированы для определения, приводят ли изменения к возрастанию растворимости белка. Синтезированные TEV варианты показаны в Таблице 3. Вариант 1 представляет кодон-оптимизированный TEV конструкт, сконструированный с C-терминальным His-«тагом» и S219N мутацией. Вариант 11 был конструктом с нативной ДНК последовательностью TEV протеазы, сконструированной с N-терминальным «тагом» и S219N мутацией.

Таблица 3 Варианты TEV протеазы Вариант Изменение исключения автопротеолиза Изменения повышения растворимости Аффинный “таг” ДНК SEQ ID NO: Белок SEQ ID NO: 1 S219N - С-конец 65 66 2 S219N L56V, S135G N-конец 67 68 3 S219N T17S, N68D, I77V N-конец 69 70 4 S219N N44V, L56V, S135G N-конец 71 72 5 S219N L56V, N68D, S135G N-конец 73 74 6 S219N T17S, L56V, N68D, I77V N-конец 75 76 7 S219N T17S, N68D, I77V, S135G N-конец 77 78 8 S219N T17S, N44V, L56V, N68D, I77V, S135G С-конец 79 80 9 S219V T17S, N44V, L56V, N68D, I77V, S135G N-конец 81 82 10 S219N T17S, N44V, L56V, N68D, I77V, S135G N-конец 83 84 11 S219N - N-конец 85 86

[0134] Для создания pET29/TEV варианта экспрессионных конструктов pUCBHB1/TEV конструкт был ращеплен рестрикционными эндонуклеазами, которые 1) вырезают вставку, включающую рамку считывания, кодирующую TEV; и 2) дают возможность этой вставке функционально связаться с рЕТ29 вектором (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). С использованием обработки Т4 ДНК лигазой эта вставка была прямо лигирована в рЕТ29 вектор, расщепленный теми же рестрикционными эндонуклеазами в сайте множественного клонирования. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы по колониям, устойчивым к канамицину. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки TEV гена. Такая стратегия клонирования приводила к получению рЕТ29 экспрессионного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую TEV варианты, функционально связанные с полигистидином аффинной очистки пептида или на карбоксильном, или на аминном конце.

В. Анализы TEV экспрессии при различных условиях индукции.

[0135] Для определения лучших используемых условий для роста и индукции белка pET29/TEV варианты 9 и 10 (Таблица 3) росли и индуцировались в IPTG индуцированной среде и в автоиндуционной среде. Кроме того, определялась продолжительность индукции.

[0136] Для индукции экспрессии с IPTG, клетки, несущие TEV экспрессионный конструкт, вначале оставляли расти на ночь для образования стартовой культуры. В свежую LB среду была посеяна на ночь культура в разведении 1:1000 и оставлена расти при перемешивании при 37°С, пока OD₆₀₀ не достигало 0.7, в это время IPTG добавлялось до конечной концентрации 0,6 мМ. Клетки собирались через 4 часа после индукции и оценивался общий клеточный лизат для определения целевой экспрессии.

[0137] Для экспрессии конструктов в условиях автоиндукции на 3,0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, несущих соответствующий экспрессионный конструкт, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. 10 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 1,0 мл ZYP-5052 автоиндукционной среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина. Клетки росли при 37°С при перемешивании и аликвоты брались на 5, 8, 12, 20 и 28 ч.

[0138] Для определения общей экспрессии TEV протеазы 40 мкл индуцированной клеточной культуры от каждой временной точки было смешано с равным объемом 2х Laemmi Sample Буфера и инкубировано при 95°С в течение 10 минут. 2 мкл 1 единицы/мкл Бензоназы в 1 М MgSO₄ было добавлено к этой смеси и инкубировано при 95°С в течение 5 минут. А 15 мкл аликвоты было загружено и разделено путем MOPS полиакриламидного гель-электрофореза с использованием NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris готовых полиакриламидных гелей (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) при денатурирующих, восстановительных условиях. Гель промывался и фиксировался в фиксирующем растворе, содержащем 10% метанола, 7% уксусной кислоты, в течение 30 минут. После фиксации фиксирующий раствор удалялся и гель инкубировался с SYPRO Ruby Protein Gel Stain при комнатной температуре в течение 3 часов. Гель затем окрашивался в растворе красителя, содержащем 10% метанола, 7% уксусной кислоты при комнатной температуре в течение 3 часов. Изображение визуализировалось на Typhoon 9410 Variable Mode формирователе изображений и программе анализаторе формирователя изображений (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

[0139] Для определения экспрессии растворимой TEV протеазы 1.0 мл индуцированной клеточной культуры было лизировано путем добавления 100 мкл раствора для лизиса клеток, содержащего 1 x FASTBREAK™ реагента для лизиса клеток (Promega Corp., Madison, WI), 500 мМ NaCl, 250 единиц/мл бензоназы нуклеазы (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), и 1 x протеазного ингибитора Смеси III (EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ) и инкубировано при комнатной температуре в течение 25 минут при постоянном перемешивании. Лизат был центрифугирован при 4300 об/мин в течение 15 минут для осадка клеточного остатка. 800 мкл супернатанта было перенесено в чистую пробирку, к которой было добавлено 30 мкл MagneHis, и смесь инкубировалась в течение 5 минут при постоянном перемешивании. После инкубации магнитные гранулы были изолированы на магнитных колонках, раствор был удален и гранулы промывались три раза 150 мкл промывочного буфера, содержащего 500 мМ NaCl. Белок был элюирован 80 мкл элюирующего буфера, был добавлен равный объем 2 x Laemmli Sample Буфера, и смесь инкубировалась при 95°С в течение 10 минут. А 15 мкл аликвоты было загружено и разделено путем MOPS полиакриламидного гель-электрофореза с использованием NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris готовых полиактиламидных гелей (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) при денатурирующих, восстановительных условиях.

[0140] Результаты индукционных экспериментов показали, что условия автоиндукции приводили к 5-10-кратному увеличению экспрессии TEV протеазы по сравнению с IPTG-индукцией. Сравнение экспрессии общей и растворимой TEV протеазы в автоиндукционной среде показало, что хотя более долгое время индукции приводило к большему количеству общего белка, количество возобновимой растворимой TEV протеазы уменьшалось. Фактически около 8 часов экспрессии при 37°С давало самое большое количество растворимого белка. Наконец, хотя как TEV S219N, так и TEV S219V варианты показывали значительно меньший автопротеолиз, TEV S219V вариант показывал более укороченный продукт при длительных временах индукуции, что подтверждает, что TEV S219V вариант более подвержен автопротеолизу.

[0141] Пока условия роста и индукции оптимизировались с использованием pET29/TEV вариантов 9 и 10, параллельно исследовалась экспрессия всех одиннадцати pET29/TEV вариантов при этих условиях. Результаты показали, что порядок возрастающего выхода растворимой TEV протеазы, от самого большого к наименьшему из пяти наивысших экспрессоров, был таков: pET29/TEV варианты 5, 10, 7, 3 и 6. В сравнение, TEV вариант 11 экспрессировался на самом низком уровне из всех.

С. Высокомасштабная экспрессия и очистка.

[0142] Для точного сравнения уровней экспрессии TEV протеазы из первых пяти pET29/TEV вариантов, с вариантом 11 как контролем, в условиях высокого масштаба, на 3,0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, была посеяна одна колония BL21(DE3) несущих соответствующий экспрессионный конструкт, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и росли при 37°С при перемешивании в течение 8 часов. Клетки осаждались центрифугированием.

[0143] Для лизиса клеток клеточный осадок ресуспендировался в 5,0 мл/грамм клеточного осадка лизирующем растворе, содержащем BUGBUSTER™ Реагента экстракции белка (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), 1 x протеазном ингибиторе Смесь Сет III (EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ), 25 единиц/мл бензоназы нуклеазы, и 1 КЕ/мл rЛизосомы (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Клеточная суспензия инкубировалась при комнатной температуре на платформе-качалке в течение 20 минут, после чего следовала инкубация на льду в течение 15 минут. Суспензия центрифугировалась при 4°С в течение 30 минут на 30350 rcf для осаждения клеток, супернатант переносился в чистую пробирку. Для подготовки нерастворимого клеточного экстракта, осажденного для SDS-PAGE анализа осадок ресуспендировался в первоначальном объеме с 1x BUGBUSTER™ Реагентом экстракции белка.

[0144] Для очистки варианта TEV протеазы путем IMAC очистки очищенный лизат был смешан с TALON™ SuperFlow металаффинной кобальтовой смолой, уравновешенной IMAC промывочным раствором, содержащем 25 мМ фосфата натрия, рН 7.0, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 35 мМ имидазола. Лизат-смоляная смесь инкубировалась на платформе-качалке при 4°С в течение 1 часа и затем переносилась в 20 мл одноразовую колонку, присоединенную к вакуумному коллектору. Колонка промывалась дважды пятью объемами колонки IMAC промывочного раствора. TEV протеаза была элюирована из смолы двумя объемами колонки IMAC элюционного раствора, содержащего 25 мМ фосфата натрия, рН 7.8, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 500 мМ имидазола, и собиралась в 1.0 мл фракции. Каждая фракция, содержащая белок, идентифицировалась смешиванием 10 мкл аликвоты с 200 мкл QUICK-START™ Bradford красящего реагента. Фракции элюционного пика были объединены и диализированы для вторичной очистки ионобменной хроматографией.

[0145] Для диализа IMAC-очищенного варианта TEV протеазы объединенная проба, содержащая фракции элюционного пика, была диализирована в FASTDIALYZER', профильтрованном через 25 кD MWCO мембрану при 4°С в 1 л деминерализованного буфера при постоянном перемешивании в течение ночи. Для катионобменной хроматографии деминерализованный буфер (Буфер А) содержал 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0.

[0146] Для очистки варианта TEV протеазы путем катионобменной хроматографии деминерализованный белковый раствор был загружен в 1 мл UNO-S1 катионобменную колонку, предварительно уравновешенную Буфером А, при скорости потока 0,5 мл/мин. Связанный белок был элюирован по градиенту NaCl Буфером В, содержащим 25 мМ фосфата натрия, рН 7.0, 1 М NaCl при скорости потока 1,0 мл/мин следующим образом: 5% Буфер В для 3 мл, 20% Буфер В для 10 мл, от 20% до 100% Буфер В для более 10 мл. Элюция белков из колонки определялась на УФ-оптическом детекторе при 214 нм, 260 нм и 280 нм, и все пиковые фракции были объединены и определена концентрация белка. Аликвоты были быстро заморожены жидким азотом и хранились при -80°С. TEV вариант 7 имел самый большой выход растворимой протеазы (са. 35 мг/л), после чего шли вариант 3 (са. 24 мг/л) и вариант 10 (са. 23 мг/л). Оставшиеся два варианта, 5 и 6, имели выход 18 и 8 мг/л соответственно. Выход TEV варианта 11 был са. 0.6 мг/л. Таким образом, все верхние пять TEV вариантов, содержащие усиливающее растворимость аминокислотное изменение, давали не менее чем 10-кратное повышение очищенной растворимой TEV протеазы по сравнению с TEV вариантом 11, который содержал только исключающее автопротеолиз аминокислотное изменение (S219N). При сравнении порядка выхода TEV протеазы по исследованиям с маломи и высокими уровнями экспрессии вариант 5 демонстрировал самый большой выход при малом уровне экспрессии (Пример 1C). Однако именно вариант 7 имел наибольший выход при высоких уровнях экспрессии. Повторяющееся сравнение выходов на партиях с высоким уровнем постоянно показывало, что вариант 7 был вариантом с самой высокой экспрессией. В результате вариант 7 представлял собой лидирующий TEV протеазный конструкт и использовался для всех дальнейших исследований, описанных здесь.

[0147] Для определения протеолитической активности вариант TEV протеазы или AcTEV протеаза в качестве позитивного контроля был добавлен к 30 мкл реакционного раствора, содержащего 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ DTT и 2.5 мкг TEV субстрата и инкубировалась при 30°С в течение 30 минут, 60 минут и 120 минут. Реакции были остановлены путем добавления 2 x Laemmi Sample Буфера и инкубации пробы при 95°С в течение 10 минут. А 15 мкл аликвоты было загружено и разделено путем MOPS полиакриламидного гель-электрофореза с использованием NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris готовых полиактиламидных гелей (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) при денатурирующих, восстановительных условиях. Гель промывался и фиксировался в фиксирующем растворе, содержащем 10% метанола, 7% уксусной кислоты, в течение 30 минут. После фиксации фиксирующий раствор удалялся и гель инкубировался с SYPRO Ruby Protein Gel Stain при комнатной температуре в течение 3 часов. Гель затем окрашивался в растворе красителя, содержащем 10% метанола, 7% уксусной кислоты, при комнатной температуре в течение 3 часов. Изображение визуализировалось благодаря Typhoon 9410 Variable Mode формирователю изображений и программе анализатора формирователя изображений (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Степень интенсивностей нерасщепленного субстрата и расщепленного субстрата использовалась для расчета процента расщепленного TEV субстрата. Результаты анализа активности TEV протеазы представлены в Таблице 4.

Таблица 4 Анализ активности TEV протеазы TEV протеаза Расщепление TEV субстрата (%) 30 минут 60 минут 120 минут AcTEV 73.9 91.6 97.2 TEV вариант 3 96.5 97.7 98.1 TEV вариант 5 95.6 97.8 95.6 TEV вариант 6 90.8 96.8 97.2 TEV вариант 7 96.6 97.8 97.7 TEV вариант 10 74.2 93.3 96.1

Пример 2

Внутриклеточная активация клостридиального токсина с сайтом расщепления TEV протеазой с использованием двух различных экспрессионных конструктов

[0148] Следующий пример иллюстрирует процедуру, используемую для экспрессии в клетке клостридиального токсина, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

А. Создание pET29/BoNT/A-TEV экспрессионного конструкта.

[0149] Для того чтобы произвести BoNT/A, содержащий сайт расщепления TEV протеазой, находящийся внутри двуцепочечного петлевого участка, открытая рамка считывания (SEQ ID NO:87) кодирующая желаемую BoNT/A-TEV (SEQ ID NO:88) была синтезирована с использованием стандартных процедур (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA). Комплементарные олигонуклеотиды длиной от 20 до 50 оснований, охватывающих полную открытую рамку считывания BoNT/A-TEV, были синтезированы с использованием стандартного фосфорамидного синтеза. Эти олигонуклеотиды были гибридизированы в двухнитевые дуплексы, которые были последовательно соединены вместе для сборки полинуклеотидной молекулы полной длины. Эта полинуклеотидная молекула была клонирована с использованием стандартных методов молекулярной биологии в pUCBHB1 вектор, несущий SmaI сайт, для образования pUCBHB1/BoNT/A-TEV конструктов. Синтезированная полинуклеотидная молекула была верифицирована путем секвенирования с использованием BIG DYE TERMINATOR™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и ABI 3100 секвенатора (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[0150] Для создания pET29/BoNT/A-TEV экспрессионного конструкта pUCBHB1/BoNT/A-TEV был ращеплен рестрикционными эндонуклеазами, которые 1) вырезают вставку, включающую рамку считывания, кодирующую BoNT/A-TEV; и 2) дают возможность этой вставке функционально связаться с рЕТ29 вектором (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). С использованием обработки Т4 ДНК лигазой эта вставка была субклонирована в рЕТ29 вектор, расщепленной аналогичными рестрикционными эндонуклеазами для производства соответствующего pET29/BoNT/A-TEV экспрессионного конструкта. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы по колониям, устойчивым к канамицину. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приводила к получению рЕТ29 экспрессионного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую BoNT/A-TEV, функционально связанные с полигистидином аффинной очистки пептида на карбоксильном конце.

В. Создание pET22/TEV экспрессионных конструктов.

[0151] Для создания pET22/TEV варианта экспрессионных конструктов pET29/TEV вариант 7 экспрессионного конструкта был ращеплен рестрикционными эндонуклеазами, которые 1) вырезают вставку, включающую открытую рамку считывания (SEQ ID NO:77), кодирующую TEV протеазу (SEQ ID NO:78); и 2) дают возможность этой вставке функционально связаться с рЕТ22 вектором (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). С использованием обработки Т4 ДНК лигазой эта вставка была субклонирована в рЕТ22 вектор, расщепленной аналогичными рестрикционными эндонуклеазами для производства соответствующего pET22/TEV экспрессионного конструкта. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл ампициллина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы как резистентные к ампициллину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приводила к получению рЕТ22 экспрессионного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую TEV вариант 7, функционально связанный с полигистидином аффинной очистки пептида на аминном конце.

С. Создание клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV и pET22/TEV экспрессионные конструкты.

[0152] Для создания клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV и pET22/TEV экспрессионные конструкты, pET29/BoNT/A-TEV экспрессионный конструкт был трансформировал в электрокомпетентные клетки Е.coli BL21(DE3), несущие pET22/TEV вариант 7 экспрессионный конструкт с использованием электропорации, помещен на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, и помещен в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие оба экспрессионных конструкта, были идентифицированы как колонии, устойчивые к канамицину и ампициллину. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами для подтверждения присутствия обоих конструктов. Такая стратегия клонирования приводила к получению клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV и pET22/TEV экспрессионные конструкты.

D. In situ активация BoNT/A-TEV.

[0153] Для производства двуцепочечных форм BoNT/A-TEV в автоиндукционных условиях на 3.0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл ампициллина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, несущих pET29/BoNT/A-TEV и pET22/TEV экспрессионные конструкты, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. Около 10 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 1,0 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл ампициллина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 3,5 часов и затем при 22°С при перемешивании в течение 18,5 часов. В качестве контроля BL21(DE3) клетки, несущие только pET29/BoNT/A-TEV, росли и индуцировались, как описано выше, за исключением того, что как селективный агент использовалось только 50 мкг/мл канамицина.

[0154] После роста и индукции клетки лизировались и очищались IMAC точно так же, как описано в Примере 1В. Очищенные IMAC пробы анализировались SDS-PAGE и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 1В.

[0155] Результаты показывают, что когда pET29/BoNT/A-TEV экспрессируется один, примерно 150 кДа полоса, соответствующая одной цепи BoNT/A-TEV, детектировалась как при восстановительных, так и при невосстановительных условиях. Напротив, когда BoNT/A-TEV коэкспрессировался с TEV протеазой, две полосы наблюдались при восстановительных условиях, одна примерно 50 кДа, а другая примерно 100 кДа. Более того, когда одинаковые пробы прогонялись при невосстановительных условиях, полосы примерно 50 кДа и примерно 100 кДа исчезали, и наблюдалась новая полоса примерно 150 кДа. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что примерно 50 кДа и примерно 100 кДа полосы, видимые при восстановительных условиях, соответствуют легкой и тяжелой цепям BoNT/A-TEV, и что присутствие этих двух полос было показателем образования двуцепочечного BoNT/A-TEV. Таким образом, коэкспрессия BoNT/A-TEV и TEV протеазы в этих клетках приводит к расщеплению BoNT/A-TEV в сайте расщепления TEV протеазой, находящимся внутри двуцепочечной петли, и последующему образованию двуцепочечной формы BoNT/A-TEV.

[0156] Для подтверждения этих результатов была проведена высокомасштабная экспрессия BL21(DE3) клеток, несущих pET29/BoNT/A-TEV и pET22/TEV экспрессионные конструкты. На 3,0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл ампициллина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV и pET22/TEV экспрессионные конструкты, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. Около 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл ампициллина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 3,5 часов и затем при 22°С при перемешивании в течение 18,5 часов. Клетки осаждались центрифугированием. Клетки лизировались и очищались IMAC, как описано в Примере 1C.

[0157] Для диализа IMAC-очищенного BoNT/A-TEV для вторичной ионообменной хроматографии объединенные пробы, содержащие фракции элюционного пика, были диализированы в FASTDIALYZER®, оснащенном 25 кД MWCO мембраной, при 4°С в 1 л деминерализованного буфера при постоянном перемешивании в течение ночи. Для анионобменной хроматографии деминерализованный буфер (Буфер А) содержал 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0.

[0158] Для очистки BoNT/A-TEV путем анионобменной хроматографии деминерализованный белковый раствор был загружен в 1 мл UNO-01 анионобменную колонку, предварительно уравновешенную Буфером А, при скорости потока 0,5 мл/мин. Связанный белок был элюирован по градиенту NaCl Буфером В, содержащим 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 М NaCl при скорости потока 0,5 мл/мин следующим образом: 3% Буфер В для 3 мл, 7% Буфер В для 10 мл, от 7% до 100% Буфер В для более чем 10 мл. Элюция белков из колонки определялась на УФ-оптическом детекторе при 214 нм, 260 нм и 280 нм, и все пиковые фракции были объединены и определена концентрация белка. Аликвоты были быстро заморожены жидким азотом и хранились при -80°С. Очищенный BoNT/A-TEV белок анализировался путем SDS-PAGE, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 1В. Результаты подтверждают первичные маломасштабные эксперименты и показывают, что одноцепочечный BoNT/A-TEV превращается в двуцепочечную форму с почти 100% эффективностью.

[0159] Для оценки активности двуцепочечных BoNT/A-TEV эти токсины оценивались анализом на основе клеток и анализом на животных.

[0160] Для тестирования активности двуцепочечных BoNT/A-TEV с использованием анализа на основе клеток, иммунологический анализ активности BoNT/A с использованием множественных ECL в «сэндвич» методе ELISA был проведен точно так же как описано в заявке на патент Fernandez-Salas, et al., Immuno-Based BoNT/A Activity Assays, Attorney Docket No. 18383 (ВОТ), которая включена сюда во всей полноте посредством ссылки.

[0161] Для получения обработанного BoNT/A-TEV лизата клеток для анализов примерно 50000 клеток из стоковой культуры SiMa клеточной линии были посеяны в поли-D-лизиновые 96-луночные планшеты, содержащие бессывороточную среду, содержащую Minimum Essential Medium, 2 мМ GlutaMAX™ I с солями Эрла, 1 x В27 добавку, 1 x N2 добавку, 0.1 мМ заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES и 25 мкг/мл GTb1. Эти клетки инкубировались в 37°С инкубаторе с 5% диоксидом углерода, пока клетки не дифференцировались, что определялось по стандартным и общепринятым морфологическим критериям, таким как задержка роста и вытягивание аксонов (примерно 3 дня). Среда аспирировалась из каждой лунки и замещалась свежей средой, содержащей 0 (необработанная проба), 0.01 нМ, 0.04 нМ, 0.12 нМ, 0.37 нМ, 1.11 нМ, 3.33 нМ или 10.0 нМ BoNT/A-TEV. После 24 ч обработки клетки промывались и инкубировались дополнительные два дня без токсина. Для того чтобы собрать клетки, среда аспирировалась, клетки промывались 1 x PBS и лизировались добавлением 30 мкл лизирующего буфера, содержащего 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1.5 мМ MgCl₂, I мМ EGTA, 1% Triton X-100 к каждой лунке, и планшет инкубировался на шейкере, вращающемся на 500 об/мин в течение 30 минут при 4°С. Планшет центрифигуровался при 4000 об/мин в течение 20 минут при 4°С до осаждения остатков клеток, и супернатант переносился в покрытый иммобилизированными антителами 96-луночный планшет для проведения этапа детекции.

[0162] Для приготовления α-SNAP-25 раствора иммобилизованных антител, α-SNAP-25 моноклональное антитело, содержащееся в асцитах из гибридомной клеточной линии 2Е2А6, было очищено с использованием стандартного протокола очистки белка А. Для приготовления раствора детекции α-SNAP-25 антитела, α-SNAP-25 кроличье поликлональное антитело S9684 (Sigma, St. Louis, МО) было конъюгировано с рутений(II)-трис-бипиридин-(4-метилсульфонат) NHS эфир маркирующим реагентом (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) в соответствии с инструкциями производителя (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Для приготовления твердофазной подложки, содержащей иммобилизованное антитело, которое было специфичным к SNAP-25 расщепленному продукту, примерно 5 мкл α-SNAP-25 моноклонального антитела 2Е2А6 раствора (20 мкг/мл в 1x PBS) было добавлено к каждой лунке 96-луночного MSD High Bind планшета, и раствор оставили высыхать на воздухе в биологически защищенном боксе в течение 2-3 часов для того чтобы жидкость испарилась из раствора. Лунки с иммобилизованным антителом затем были блокированы и использовались прямо для детекции активности BoNT/A.

[0163] Для детекции присутствия расщепленного SNAP-25 продукта по ECL «сэндвич» методу ELISA блокирующий буфер из сохраненных планшетов был аспирирован, 25 мкл лизата из клеток, обработанных BoNT/A, было добавлено в каждую лунку, и планшеты инкубировались при 4°С в течение 2 часов. Лунки планшетов промывались три раза путем аспирации лизата клеток и трехкратного промывания каждой лунки 200 мкл 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат). После промывания 25 мкл 5 мкг/мл α-SNAP-25 детекционного раствора антител, содержащего 2% Amersham Blocking Reagent в 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат) было добавлено к каждой лунке, планшет был герметично закрыт, и герметично закрытый планшет инкубировался при комнатной температуре в течение 1 часа на шейкере. После инкубации с α-SNAP-25 детекционным антителом лунки были промыты три раза 200 мкл 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат). Приближенные данные, полученные по ECL формирователю изображений, затем переносились в SigmaPlot v. 9.0 и 4-параметровая логистическая подгонка использовалась для определения дозозависимых кривых. Не было ограничений, используемых для 4-параметровой логистической функции при построении кривой данных. Графические отчеты были созданы с использованием следующих анализов: R2 (коэффициент корреляции), а (максимум для набора данных), b (склон), и ХО ± SE (EC₅₀ значение ± стандартная ошибка). Результаты двух независимых экспериментов показывают, что активность обеих двуцепочечных продуктов была почти идентична и отличалась не более чем в 2 раза от нативного двуцепочечного продукта.

[0164] Для тестирования активности двуцепочечных BoNT/A-TEV с использованием анализа на животных был проведен in vivo Цифровой Шкалы Абдукции (DAS) анализ. CD-1 Fe мыши были взвешены и разделены по выборкам по 10 животных для каждого отдельного DAS анализа. Мыши были включены в определенную выборку на основе следующих критериев: 1) хорошее здоровье; 2) устойчивый базовая DAS реакция 0; 3) вхождение в средний диапазон веса Х ± 2 г установленной для определенной выборки и 4) вес более чем 17,0 г.

[0165] Каждая мышь была инъецирована 5 мкл одной из семи различных доз BoNT/A-TEV (0.01 нМ, 0.04 нМ, 0.12 нМ, 0.37 нМ, 1.11 нМ, 3.33 нМ и 10.0 нМ) иглой 30 номера в икроножную мышцу правой задней конечности. В качестве контроля в икроножную мышцу левой задней конечности была введена инъекция 5 мкл раствора, не содержащего BoNT/A-TEV. Мыши наблюдались на DAS реакцию в течение первых 4 дней. DAS определялась при поднятии каждой мыши за хвост и тщательном осмотре инъецированных задних конечностей. Цифровое значение абдукция или отсутствие абдукции в конечности показывало эффект паралича вследствие тестируемого токсина, инъецированного в мышцу. Цифровое значение абдукции инъецированной задней конечности сравнивалось со значением неинъецированной задней конечности и соответствующей шкалой. Данные DAS анализировались подсчетом ED₅₀ дозы на основе среднего пика по DAS шкале и AUC (области под кривой) и выражались в ед/кг и/или нг/кг. Данные были представлены следующим образом: 1) средний пик по DAS шкале для каждой дозы был рассчитан в каждом исследовании; 2) любая доза, вызвавшая более чем пять смертей в любом исследовании была исключена из рассмотрения; 3) самая высокая доза, используемая в данном отдельном исследовании, была самой низкой дозой, которая вызывала средний пик 4.0; 4) самая низкая доза, используемая в данном отдельном исследовании, была самой высокой дозой, которая вызывала средний пик 0; 5) для каждого отдельного исследования были построены кривые среднего пика DAS vs. log (доза); 6) значение AUC было подсчитано для каждой группы из 10 мышей в составных группах в некоторых исследованиях; 7) кривые были построены для каждого отдельного исследования среднего AUC vs. log (доза); 8) x, у повторяющаяся кривая зависимости была построена для каждой серии составных идентичных исследований; для каждого тестируемого токсина; 9) дозозависимые данные были проанализированы нелинейной регрессией (невзвешенной) с использованием трехпараметрового логистического выравнивания (Sigma Plot v 8.0; SPSS Science, Chicago, Illinois) с использованием следующего выравнивания:

y=a/(1+(х/х0)^b)

y является ответом, а является асимптотой y_max, b является углом наклона, x является дозой, и 0 является ED₅₀ дозой, Для определений пика ED₅₀, Ymax было определено как 4 (максимальное DAS значение на шкале). Средние (пик и/или AUC) ED₅₀ значения были подсчитаны для каждого проведенного восьмидозового исследования.

[0166] Результаты двух независимых серий экспериментов показавают, что уровень активности обеих двуцепочечных продуктов был почти идентичным и не более чем в 2 раза отличался от нативного двуцепочечного продукта. Взятые вместе данные клеточного анализа и DAS анализа показывают, что процесс внутриклеточной активации приводит к выходу двуцепочечного rBoNT/A, который не только структурно сравним с in-vitro созданным материалом, но также функционально неотличим.

Пример 3

Внутриклеточная активация клостридиального токсина с сайтом расщепления TEV протеазой с использованием двух различных экспрессионных конструктов под контролем независимых промоторов

[0167] Следующий пример иллюстрирует процедуру, используемую для экспрессии в клетке клостридиального токсина, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании. В этом случае формирование двуцепочечной формы токсина регулируется TEV протеазой под контролем независимого промотора.

А. Создание pBAD/TEV экспрессионного конструкта.

[0168] Для того чтобы произвести рекомбинантную TEV протеазу, экспрессия которой была под контролем арабинозного промотора (P_BAD); открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу вариант 7 (Таблица 3 [130]), без N-терминального His «тага», была клонирована в экспрессионный вектор pBAD/Myc-HisA для создания pBAD/TEV. Для создания pBAD/TEV открытая рамка считывания, кодирующая TEV протеазу вариант 7 (SEQ ID NO:106), без N-терминального полигистидинового «тага», была синтезирована с использованием стандартных процедур (BlueHeron Biotechnology, Carlsbad, CA). Синтетический фрагмент был также фланкирован рестрикционными сайтами, для того чтобы эта вставка была способна быть функционально связанной с pBAD/Myc-HisA вектором (Life Technologies, Madison, WI). С использованием Т4 ДНК лигазной продедуры эта вставка была прямо лигирована в pBAD/Myc-HisA вектор, расщепленный теми же рестрикционными эндонуклеазами в множественном сайте клонирования. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл ампициллина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы как резистентные к ампициллину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки TEV гена. Такая стратегия клонирования приводила к получению pBAD/TEV экспрессионного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую TEV вариант 7 без полигистидина аффинной очистки пептида.

B. Создание клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV и pBAD/TEV экспрессионные конструкты.

[0169] Для создания клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV и pBAD/TEV экспрессионные конструкты, pET29/BoNT/A-TEV экспрессионный конструкт (описанный в Примере 2А) был трансформирован в электрокомпетентные клетки Е.coli BL21(DE3), несущие pBAD/TEV вариант 7 экспрессионный конструкт с использованием электропорации, помещен на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, и помещен в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие оба экспрессионных конструкта, были идентифицированы как колонии, устойчивые к канамицину и ампициллину. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами для подтверждения присутствия обеих конструктов. Такая стратегия клонирования приводила к получению клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV и pBAD/TEV экспрессионных конструктов.

С. In situ активация BoNT/A-TEV.

[0170] Для производства двуцепочечных форм BoNT/A-TEV в автоиндукционных условиях на 3.0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл ампициллина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, несущих pET29/BoNT/A-TEV и pBAD/TEV экспрессионные конструкты, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 8 часов и затем при 22°С при перемешивании в течение 14 часов. На этой точке TEV экспрессия индуцировалась 0,2% L-арабинозы и культура росла в течение дополнительных 4 часов при 22°С. В качестве контроля BL21(DE3) клетки, несущие только pET29/BoNT/A-TEV, росли и индуцировались, как описано выше, за исключением того, что как селективный агент использовался только 50 мкг/мл канамицина.

[0171] После роста и индукции клетки были лизированы и IMAC очищался точно так же, как описано в Примере 1C. Для диализа IMAC-очищенното BoNT/A-TEV для вторичной ионообменной хроматографии объединенные пробы, содержащие фракции элюционного пика, были диализированы в FASTDIALYZER®, оснащенном 25 кД MWCO мембраной, при 4°С в 1 л деминерализованного буфера при постоянном перемешивании в течение ночи. Для анионобменной хроматографии деминерализованный буфер (Буфер А) содержал 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0.

[0172] Для очистки BoNT/A-TEV путем анионобменной хроматографии деминерализованный белковый раствор был загружен в 1 мл UNO-Q1 аниононобменную колонку, предварительно уравновешенную Буфером А, при скорости потока 0,5 мл/мин. Связанный белок был элюирован по градиенту NaCl Буфером В, содержащим 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 М NaCl при скорости потока 0,5 мл/мин следующим образом: 3% Буфер В для 3 мл, 7% Буфер В для 10 мл, от 7% до 100% Буфер В для более чем 10 мл. Элюция белков из колонки определялась на УФ-оптическом детекторе при 214 нм, 260 нм и 280 нм, и все пиковые фракции были объединены и определена концентрация белка.

[0173] Очищенный BoNT/A-TEV белок анализировался SDS-PAGE, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 1В. Результаты показывают, что когда pET29/BoNT/A-TEV экспрессируется один, примерно 150 кДа полоса, соответствующая одной цепи BoNT/A-TEV, детектировалась как при восстановительных, так и при невосстановительных условиях. Напротив, когда BoNT/A-TEV коэкспрессировался с TEV протеазой под контролем P_BAD промотора и индуцировался арабинозой, две полосы наблюдались при восстановительных условиях, одна примерно 50 кДа, а другая примерно 100 кДа. Более того, когда одинаковые пробы прогонялись при невосстановительных условиях, полосы примерно 50 кДа и примерно 100 кДа исчезали и наблюдалась новая полоса примерно 150 кДа. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что примерно 50 кДа и примерно 100 кДа полосы, видимые при восстановительных условиях, соответствуют легкой и тяжелой цепям BoNT/A-TEV, и что присутствие этих двух полос было показателем образования двуцепочечного BoNT/A-TEV. Таким образом, коэкспрессия BoNT/A-TEV и TEV протеазы в этих клетках приводит к расщеплению BoNT/A-TEV в сайте расщепления TEV протеазой, находящимся внутри двуцепочечной петли, и последующему образованию двуцепочечной формы BoNT/A-TEV. Результаты показывают, что 90-95% одноцепочечного BoNT/A-TEV превращается в его двуцепочечную форму.

Пример 4

Внутриклеточная активация клостридиального токина с сайтом расщепления TEV протеазой с использованием двойного экспрессионного конструкта

[0174] Следующий пример иллюстрирует способы, используемые для очистки и количественной оценки клостридиального токсина, содержащего сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

А. Создание pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV двойного экспрессионного конструкта.

[0175] Для создания pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV двойного экспрессионного конструкта, синтетические фрагменты (SEQ ID NO:89), кодирующий последние 37 аминокислот BoNT/A-TEV, а также транскрипционные (Т7 промотор, сайт lac оператора) и трансляционные (RBS) элементы, необходимые для экспрессии Е.coli и полного кодирующего участка TEV варианта 7, были синтезированы с использованием стандартных процедур (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA). Комплементарные олигонуклеотиды длиной от 20 до 50 оснований были синтезированы с использованием стандартного фосфорамидного синтеза. Эти олигонуклеотиды были гибридизированы в двухнитевые дуплексы, которые были последовательно соединены вместе для сборки полинуклеотидной молекулы полной длины. Эта полинуклеотидная молекула была клонирована с использованием стандартных методов молекулярной биологии в pUCBHB1 вектор, несущий SmaI сайт, для образования pUCBHB1/BoNT/A-TEV_C-term/T7Prom/TEV плазмиды. Синтезированная полинуклеотидная молекула была верифицирована путем секвенирования с использованием BIG DYE TERMINATOR™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и ABI 3100 секвенатора (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[0176] Для создания pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV экспрессионного конструкта pUCBHB1/BoNT/A-TEV_C-term/T7Prom/TEV был ращеплен рестрикционными эндонуклеазами, которые 1) вырезают вставку, включающую С-конец BoNT/A-TEV; транскрипционный и трансляционный мотивы, необходимые для экспрессии Е.coli второй открытой рамки считывания и полного кодирующего участка TEV варианта и 2) дают возможность этой вставке функционально связаться после BoNT/A гена в pET29/BoNT/A-TEV векторе из Примера 1А. С использованием обработки Т4 ДНК лигазой эта вставка была субклонирована в pET29/BoNT/A-TEV вектор, расщепленный аналогичными рестрикционными эндонуклеазами для производства соответствующего pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV двойного экспрессионного конструкта, содержащего BoNT/A-TEV и TEV протеазы варианта 7 открытые рамки считывания со встроенных транскриционных и трансляционных элементов SEQ ID NO:89. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы как резистентные к канамицину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приводила к получению рЕТ29 двойного экспрессионного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую BoNT/A-TEV вариант, функционально связанный с полигистидиновым «тагом» аффинной очистки на карбоксильном конце и TEV протеазой. Организация открытой рамки считывания была такова, что инициация транскрипции с первого Т7 промотора приводила к получению мРНК с открытой рамки считывания, кодирующей BoNT/A-TEV, и открытой рамки считывания, кодирующей TEV протеазу. Кроме того, инициация транскрипции с второго Т7 промотора приводила к получению мРНК с открытой рамки считывания, кодирующей только TEV протеазу. Таким образом, в данном случае транскриптов, кодирующих TEV протеазу, в два раза больше по сравнению с BoNT/A-TEV.

В. In situ активация BoNT/A-TEV из pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV.

[0177] Для производства двуцепочечных форм BoNT/A-TEV в автоиндукционных условиях на 3.0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, содержащих pET29/BoNT/A-TEV/TEV двойной экспрессионный конструкт, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. Около 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 3,5 часов и затем при 22°С при перемешивании в течение 18,5 часов. Клетки осаждались центрифугированием. Клетки лизировались, очищались IMAC, деминерализировались, очищались анионобменной хроматографией, анализировались SDS-PAGE, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 2D. В качестве контроля BL21(DE3) клетки, несущие только pET29/BoNT/A-TEV, росли и индуцировались, как описано выше, за исключением того, что как селективный агент использовался только 50 мкг/мл канамицина.

[0178] Результаты показывают, что при одиночной экспрессии примерно 150 кДа полоса, соответствующая одной цепи BoNT/A-TEV, детектировалась как при восстановительных, так и при невосстановительных условиях. Напротив, когда BoNT/A-TEV коэкспрессировался с TEV протеазой, две полосы наблюдались при восстановительных условиях, одна примерно 50 кДа, а другая примерно 100 кДа. Более того, когда одинаковые пробы прогонялись при невосстановительных условиях, полосы примерно 50 кДа и примерно 100 кДа исчезали, и наблюдалась новая полоса примерно 150 кДа. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что примерно 50 кДа и примерно 100 кДа полосы, видимые при восстановительных условиях, соответствуют легкой и тяжелой цепям BoNT/A-TEV, и что присутствие этих двух полос было показателем образования двуцепочечного BoNT/A-TEV. Таким образом, коэкспрессия BoNT/A-TEV и TEV протеазы с двойного экспрессионного конструкта в этих клетках приводит к расщеплению BoNT/A-TEV в сайте расщепления TEV протеазой, находящимся внутри двуцепочечной петли, и последующему образованию двуцепочечной формы BoNT/A-TEV.

С. Создание pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV двойного экспрессионного конструкта.

[0179] Для определения, будет ли реверсия структуры открытой рамки считывания, кодирующей BoNT/A-TEV и TEV протеазу, влиять на выход и эффективность расщепления BoNT/A-TEV, был сделан двойной экспрессионный конструкт, в котором инициация транскрипции с первого Т7 промотора производит мРНК с открытыми рамками считывания, кодирующими TEV и BoNT/A-TEV, а инициация транскрипции со второго Т7 промотора производит мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей только BoNT/A-TEV. Таким образом, транскриптов, кодирующих BoNT/A-TEV, в два раза больше по сравнению с TEV протеазой.

[0180] Для создания pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV двойного экспрессионного конструкта были проведены две последовательные реакции клонирования. В начале открытая рамка считывания (SEQ ID NO:91), кодирующая TEV вариант 7 (SEQ ID NO:22), была амплифицирована методом PCR с pET29/TEV вариант 7 экспрессионного конструкта. 5'-конец открытой рамки считывания, кодирующей полигистидиновый аффинный «таг», был исключен из амплификации, для того чтобы кодировалась протеаза без «тага». После амплификации PCR продукт расщеплялся в уникальных сайтах рестрикции, встроенных в концы PCR продукта посредством PCR праймеров и клонировался в соответствующие сайты в MCSI (множественный сайт клонирования) двойной экспрессионной плазмиды pRSFduet-1 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) с использованием Т4 ДНК лигазной процедуры. Этот промежуточный конструкт расщеплялся pRSduet/TEV. Затем pET29/BoNT-A/TEV экспрессионный конструкт расщеплялся рестрикционными эндонуклеазами, которые которые: 1) вырезают вставку, включающую открытую рамку считвания (SEQ ID NO:87), кодирующую BoNT/A-TEV (SEQ ID NO:88); и 2) дают возможность этой вставке функционально связаться с MCS2 iв pRSFduet/TEV. BoNT/A-TEV вставка субклонировалась в MCS2 в pRSFduet векторе с использованием Т4 DNA лигазной процедуры для получения соответствующего pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV двойного экспрессионного конструкта. Такая стратегия клонирования приводила к получению pRSFduet двойного экспрессионного конструкта, в котором транскрипция с первого Т7 промотора дает мРНК, кодирующую TEV и BoNT/A-TEV, а транскрипция со второго Т7 промотора дает мРНК, кодирующую только BoNT/A-TEV.

[0181] Такая стратегия клонирования будет давать pRSFduet двойной экспрессионный конструкт, где первый Т7 промотор будет транскрибировать открытую рамку считывания, кодирующую BoNT/A-TEV, а второй Т7 промотор будет транскрибировать открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу.

D. Создание pET29/BoNT/A-TEV/TEV двойного экспрессионного конструкта.

[0182] Для определения выхода BoNT/A-TEV и эффективности превращения в двуцепочечную форму с транскрипционной единицы такой конфигурации, когда BoNT/A-TEV и TEV могут продуцироваться только со своих собственных независимых мРНК, был создан pET29/BoNT/A-TEV/TEV. Для производства pET29/BoNT/A-TEV/TEV двойного экспрессионного конструкта короткий синтетический ДНК фрагмент был использован для инкорпорации Т7 терминаторного сайта (SEQ ID NO:92) во встраивающуюся последовательность между открытыми рамками считывания BoNT/A-TEV и TEV в двойном экспрессионном конструкте pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV (Пример 3А выше). При использовании Т4 ДНК лигазной процедуры, она была практически завершена путем замены встроенного участка в pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV, в котором отсутствовал Т7 терминаторный сайт, на синтетический ДНК фрагмент, несущий встроенный транскриптон и трансляционные элементы с Т7 терминаторным сайтом SEQ ID NO:93. Получившийся в результате двойной экспрессионный конструкт, обозначенный как pET29/BoNT/A-TEV/TEV, содержит полинуклеотидную молекулу, кодирующую BoNT/A-TEV вариант, функционально связанный с полигистидиновым аффинным «тагом» на карбоксильном конце, и TEV протеазу, транскрибируемую с первого и второго Т7 промоторов, соответственно.

Е. In situ активация BoNT/A-TEV.

[0183] Рост и индукция двуцепочечных форм BoNT/A-TEV при автоиндукционных условиях были проведены точно так же, как описано в Примере 2D, за исключением того, что были использованы BL21(DE3) клетки, содержащие pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV двойной экспрессионный конструкт, pRSF/TEV/2xBoNT/A-TEV двойной экспрессионный конструкт, или pET29/BoNT/A-TEV/TEV двойной экспрессионный конструкт, и по одной колонии из каждой из этих клеточных линий были использованы для четырех параллельных посевов по 1.0 мл культуры. После роста и индукции четыре 1.0 мл репликата были объединены вместе для обработки. Клетки были лизированы и IMAC очищены, и проанализированы SDS-PAGE, и гели открашивались точно так же, как описано в Примере 1В. В качестве контроля BL21(DE3) клетки, несущие только pET29/BoNT/A-TEV, росли и индуцировались, как описано выше, за исключением того, что как селектирующий агент использовалось только 50 мкг/мл канамицина. Результаты показывают, что BoNT/A-TEV экспрессировался в очень сопоставимых уровнях из клеток, содержащих любой из трех двойных экспрессионных конструктов; однако степень превращения в двуцепочечную форму варьировала. Одноцепочечный BoNT/A-TEV превращался в двуцепочечную форму с около 96% эффетивностью когда белки экспрессировались из pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV, с около 81% эффективностьюкогда белки экспрессировались из pET29/BoNT/A-TEV/TEV, и с более чем 99% эффективностью когда белки экспрессировались из pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV.

Пример 5

Внутриклеточная активация белка, содержащего интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания апиоидов с использованием двойного экспрессионного конструкта

[0184] Следующий пример иллюстрирует способы, используемые для очистки и количественной оценки любых белков, содержащих двуцепочечную петлю, содержащую сайт расщепления экзогенной протеазой, раскрытый в настоящем описании.

А. Создание pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта.

[0185] Для создания pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта pET29/NociLHN/A-TEV был ращеплен рестрикционными эндонуклеазами, которые: 1) вырезают вставку, включающую открытую рамку считывания (SEQ ID NO:94), кодирующую NociLHN/A-TEV (SEQ ID NO:95); и 2) дают возможность этой вставке функционально связаться с MCS2 из pRSFduet/TEV, pRSFduet-1 вектора, несущем TEV вариант 7 в MCSI (описаны в Примере 3С). NociLHN/A-TEV вставка была субклонирована в MCS2 из pRSFduet/TEV конструкта с использованием Т4 ДНК лигазной процедуры для производства соответствующего pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы как резистентные к канамицину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приводила к получению a pRSFduet двойного экспрессионного конструкта, в котором транскриптон из первого Т7 промотора производил бы мРНК, кодирующую TEV и NociLHN/A-TEV, а транскриптон из второго Т7 промотора производил бы мРНК, кодирующую только NociLHN/A-TEV.

В. In situ активация NociLHN/A-TEV.

[0186] Для производства двуцепочечных форм NociLHN/A-TEV в автоиндукционных условиях на 3.0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, содержащих pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV двойной экспрессионный конструкт, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 8 часов и затем при 16°С при перемешивании в течение 18 часов. Клетки осаждались центрифугированием. Клетки лизировались, очищались IMAC, деминерализировались, очищались анионобменной хроматографией, анализировались SDS-PAGE, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 2D. В качестве контроля BL21(DE3) клетки, несущие только NociLHN/A-TEV, росли и индуцировались, как описано выше.

[0187] Результаты показывают, что при одиночной экспрессии примерно 102 кДа полоса, соответствующая одной цепи NociLHN/A-TEV, детектировалась как при восстановительных, так и при невосстановительных условиях. Напротив, когда NociLHN/A-TEV коэкспрессировался с TEV протеазой, две полосы наблюдались при восстановительных условиях, одна примерно 50,8 кДа, а другая примерно 51,3 кДа. Более того, когда одинаковые пробы прогонялись при невосстановительных условиях, полосы примерно 50,8 кДа и примерно 51,3 кДа исчезали, и наблюдалась новая полоса примерно 102 кДа. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что примерно 50,8 кДа и примерно 51,3 кДа полосы, видимые при восстановительных условиях, соответствуют энзимному домену клостридиального токсина и транслокационному домену клостридиального токсина с компонентом, мишенью которого является ноцицептин, присоединенным к аминному концу. Присутствие этих двух полос было показателем образования двуцепочечной формы NociLHN/A-TEV и того, что одноцепочечный NociLHN/A-TEV превращался в двуцепочечную форму с более чем 95% эффективностью. Таким образом, коэкспрессия NociLHN/A-TEV и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта в этих клетках приводит к расщеплению NociLHN/A-TEV в сайте расщепления TEV протеазой, находящимся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, и последующему образованию двуцепочечной формы NociLHN/A-TEV.

С. Создание pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта.

[0188] pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV двойной экспрессионный конструкт производился почти так же, как pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV. pET29/DynLHN/A-TEV экспрессионный конструкт был ращеплен рестрикционными эндонуклеазами, которые: 1) вырезают вставку, включающую открытую рамку считывания (SEQ ID NO:96), кодирующую DynLHN/A-TEV (SEQ ID NO:97); и 2) дают возможность этой вставке функционально связаться с MCS2 из pRSFduet/TEV (описаны в Примере 3С). DynLHN/A-TEV вставка была субклонирована в MCS2 из pRSFduet/TEV конструкта с использованием Т4 ДНК лигазной процедуры для производства соответствующего pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы как резистентные к канамицину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приводила к получению a pRSFduet двойного экспрессионного конструкта, в котором транскриптон из первого Т7 промотора производил бы мРНК, кодирующую TEV и DynLHN/A-TEV, а транскриптон из второго Т7 промотора производил бы мРНК, кодирующую только DynLHN/A-TEV.

D. In situ активация DynLHN/A-TEV.

[0189] Для производства двуцепочечных форм NociLHN/A-TEV в автоиндукционных условиях на 3.0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, содержащих pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV двойной экспрессионный конструкт, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 8 часов и затем при 16°С при перемешивании в течение 18 часов. Клетки осаждались центрифугированием. Клетки лизировались, очищались IMAC, деминерализировались, очищались анионобменной хроматографией, анализировались SDS-PAGE, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 2D. В качестве контроля BL21(DE3) клетки, несущие только DynLHN/A-TEV, росли и индуцировались, как описано выше.

[0190] Результаты показывают, что при одиночной экспрессии, примерно 102 кДа полоса, соответствующая одной цепи DynLHN/A-TEV, детектировалась как при восстановительных, так и при невосстановительных условиях. Напротив, когда DynLHN/A-TEV коэкспрессировался с TEV протеазой, две полосы наблюдались при восстановительных условиях, одна примерно 50,8 кДа, а другая примерно 52 кДа. Более того, когда одинаковые пробы прогонялись при невосстановительных условиях, полосы примерно 50,8 кДа и примерно 52 кДа исчезали, и наблюдалась новая полоса примерно 102 кДа. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что примерно 50,8 кДа и примерно 52 кДа полосы, видимые при восстановительных условиях, соответствуют энзимному домену клостридиального токсина и транслокационному домену клостридиального токсина с компонентом, мишенью которого является динорфин, присоединенным к аминному концу. Присутствие этих двух полос было показателем образования двуцепочечного DynLHN/A-TEV и того, что одноцепочечный DynLHN/A-TEV превращался в двуцепочечную форму с более чем 95% эффективностью. Таким образом, коэкспрессия DynLHN/A-TEV и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта в этих клетках приводит к расщеплению DynLHN/A-TEV в сайте расщепления TEV протеазой, находящимся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, и последующему образованию двуцепочечной формы DynLHN/A-TEV.

Пример 6

Внутриклеточная активация белка, содержащего интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания галанина с использованием двух различных экспрессионных конструктов

[0191] Следующий пример иллюстрирует способы, используемые для очистки и количественной оценки любых белков, содержащих двуцепочечную петлю, содержащую интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, раскрытый в настоящем описании, где целевой белок и протеаза экспрессируются с различных плазмид под контролем различных промоторов.

А. Создание pET29/GalLHN/A-TEV экспрессионного конструкта.

[0192] Для создания pET29/GalLHN/A-TEV экспрессионного конструкта pET29/DynLHN/A-TEV экспрессионный конструкт был вначале расщеплен рестрикционными эндонуклеазами для исключения ДНК сегмента, кодирующего двуцепочечную петлю, содержащую интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания динорфина. Получившийся в результате фрагмент рабочей рамки pET29/LHn/A был лигирован в синтетический ДНК фрагмент, ограниченный совместимыми сайтами рестрикции (SEQ ID NO:98), содержащими двуцепочечную петлю, содержащую интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания галанина (SEQ ID NO:99). Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы как резистентные к канамицину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приводила к получению pET29/GalLHN/A-TEV экспрессионного конструкта, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую GalLHN/A-TEV (SEQ ID NO:101), в которой экспрессия GalLHN/A-TEV находится под контролем Т7 промотора.

В. Создание pColdIV/TEV экспрессионного конструкта.

[0193] Для производства экспрессионного конструкта, в котором TEV находится под контролем промотора холодового шока (csp), открытая рамка считывания (SEQ ID NO:91), кодирующая TEV вариант 7 (SEQ ID NO:22), была амплифицирована методом PCR с pET29/TEV вариант 7 экспрессионного конструкта. 5'-конец открытой рамки считывания, кодирующей полигистидиновый аффинный «таг», был исключен из амплификации, для того чтобы кодировалась протеаза без «тага». После амплификации PCR продукт расщеплялся в уникальных сайтах рестрикции, встроенных в концы PCR продукта посредством PCR праймеров и клонировался в соответствующие сайты во множественном сайте клонирования экспрессионной плазмиды pColdIV (Clontech Laboratories, Inc. Madison, WI) с использованием Т4 ДНК лигазной процедуры. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентных клетках Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл ампициллина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, были идентифицированы как резистентные к ампициллину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приводила к получению pColdIV/TEV экспрессионного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую TEV вариант 7 под контролем промотора холодового шока.

С. Создание клеток, содержащих pET29/GalLHN/A-TEV и pColdIV/TEV экспрессионные конструкты.

[0194] Для создания клеток, содержащих pET29/GalLHN/A-TEV и pColdIV/TEV экспрессионные конструкты, pET29/GalLHN/A-TEV экспрессионный конструкт был трансформирован в электрокомпетентные клетки Е.coli BL21(DE3), несущие pColdIV/TEV, с использованием электропорации, помещен на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, и помещен в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие оба экспрессионных конструкта, были идентифицированы как колонии, устойчивые к канамицину и ампициллину. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами для подтверждения присутствия обеих конструктов. Такая стратегия клонирования приводила к получению клеток, содержащих pET29/GalLHN/A-TEV и pColdIV/TEV экспрессионные конструкты.

D. In situ активация pET29/GalLHN/A.

[0195] Для производства двуцепочечных форм GalLHN/A-TEV в автоиндукционных условиях на 3.0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, содержащих pET29/GalLHN/A-TEV и pColdIV/TEV экспрессионные конструкты, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. Около 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 8 часов и затем при 15°С при перемешивании в течение 18 часов. Клетки лизировались, очищались IMAC с использованием Magne-His смолы.

[0196] Для очистки двуцепочечного GalLHN/A-TEV путем Magne-His очистки индуцированные клетки из 250 мл экспрессионных культур были ресуспендированы в 16 мл холодного (4-6°С) IMAC промывочного буфера, содержащего 100 мМ HEPES, рН 7.5, 10% (по объему) глицерина, 10 мМ имидазола, 1 М NaCl. Клеточная суспензия была перенесена в герметичную камеру (#101-021-006, Branson Ultrasonics Corporation) и обработана ультразвуком по 15 импульсов (10 сек, 30% амплитуда, 0.5-дюймовый дезинтегратор) с 1 минутой между импульсами (Sonifier® Digital 450, Branson Ultrasonics Corporation). Во время обработки ультразвуком герметичная камера охлаждалась пропусканием охлажденной воды из циркуляционного водяного бассейна (3.5°С) через наружный контур камеры. Обработанный ультразвуком материал был перенесен из камеры в чистые пробирки Oakridge и центрифугирован на 30500 об/мин в течение 30 мин (SL-50T Rotor, Sorvall; FIBERLite® F21S-8X50 Rotor, Piramoon Technologies Inc.) при 4°C для удаления нерастворимых остатков клеток. Очищенный лизат был аспирирован шприцом и проведен сначала через 0.8 мкм и затем через 0.45 мкм шприц с фильтром (Sartorius) последовательно в чистые 50 мл коническую пробирку. Magne-His™ смола для очистки белка (Promega Corp., Madison, WI) была перемешана на вортексе в однородную суспензию и 4 мл суспензии перенесли в очищенный лизат. Пробирка была герметично закрыта и перевернута несколько раз для хорошего перемешивания частиц. Смесь инкубировалась в течение 30 мин на слабом качании для связи целевого белка при 16°С. Пробирка была перенесена в MagneSil магнитный сепаратор и оставлена на ~2 мин для захвата частиц смолы. Раствор супернатанта удалялся и пробирка удалялсь из сепаратора. Смола затем ресуспендировалась в 10 мл IMAC промывочного буфера, захваченном магнитным сепаратором, и промывочный буфер удалялся. Этап промывки повторялся еще два раза. Для элюации целевого белка смола была ресуспендирована в 5 мл Magne-His™ элюционного буфера (100 мМ HEPES, рН 7.5, 500 мМ Имидазола), инкубирована при комнатной температуре в течение 2 мин, смола захватывалась магнитным сепаратором и раствор супернатанта переносился в новую пробирку. Элюционный этап повторялся один раз.

[0197] Для диализа IMAC-очищенного GalLHN/A-TEV для вторичной ионообменной хроматографии объединенные элюционные фракции были диализированы в FASTDIALYZER®, оснащенном 25 кД MWCO мембраной, при 4°С в 1 л деминерализованного буфера (Буфер А: 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0) при постоянном перемешивании в течение ночи.

[0198] Для очистки двуцепочечного GalLHN/A-TEV путем анионобменной хроматографии деминерализованный белковый раствор был загружен в 1 мл UNO-Q1 анионобменную колонку, предварительно уравновешенную Буфером А, при скорости потока 1 мл/мин. Связанный белок был элюирован по градиенту NaCl Буфером В, содержащим 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 М NaCl при скорости потока 1 мл/мин следующим образом: 7% Буфер В для 3 мл, 15% Буфер В для 7 мл, от 10% до 50% Буфер В для более чем 10 мл. Элюция белков из колонки определялась на УФ-оптическом детекторе при 214 нм, 260 нм и 280 нм, и все пиковые фракции были объединены и определена концентрация белка. Аликвоты были быстро заморожены жидким азотом и хранились при -80°С. Очищенный BoNT/A-TEV белок анализировался путем SDS-PAGE, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 1В.

[0199] Результаты показывают, что когда GalLHN/A-TEV коэкспрессируется с TEV протеазой, две близкие накладывающиеся полосы наблюдались при восстановительных условиях, одна примерно 51,1 кДа, а другая примерно 52,1 кДа. Более того, когда одинаковые пробы прогонялись при невосстановительных условиях, полосы примерно 51,1 кДа и примерно 52,1 кДа исчезали, и наблюдалась новая полоса примерно 103 кДа. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что полоса примерно 51,1 кДа соответствует энзимному домену клостридиального токсина, а полоса примерно 52,1 кДа соответствует транслокационному домену клостридиального токсина с компонентом, мишенью которого является галанин, присоединенным к аминному концу. Присутствие этих двух полос было показателем образования двуцепочечного GalLHN/A-TEV и того, что одноцепочечный GalLHN/A-TEV превращался в двуцепочечную форму с примерно 90% эффективностью. Таким образом, коэкспрессия GalLHN/A-TEV и TEV протеазы в этих клетках из независимых плазмид приводит к расщеплению GalLHN/A-TEV в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания галанина, и последующему образованию двуцепочечной формы GalLHN/A-TEV.

Пример 7: Возможная внутриклеточная активация белка, содержащего интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания галанина с использованием двойного экспрессионного конструкта

[0200] Следующий пример иллюстрирует способы, используемые для очистки и количественной оценки любых белков, содержащих двуцепочечную петлю, содержащую интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, раскрытый в настоящем описании, где целевой белок и протеаза экспрессируются с плазмиды с двойной экспрессией.

А. Создание pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта.

[0201] Для создания pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта, подобного pRSFduet/TEV/2xNociLHWA-TEV и pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV, сконструированным ранее (см. Пример 4), a pET29/GalLHN/A-TEV экспрессионный конструкт будет расщепляться рестрикционными эндонуклеазами для: 1) вырезания вставки, содержащей открытую рамку считывания (SEQ ID NO:100), кодирующую GalLHN/A-TEV (SEQ ID NO:101); и 2) получения возможности этой вставке функционально связаться с MCS2 из pRSFduet/TEV, a pRSFduet-1 вектор, несущий TEV вариант 7 в MCSI (описан в Примере 3С). Вставка GalLHN/A-TEV будет субклонирована в MCS2 из pRSFduet/TEV конструкта с использованием Т4 ДНК лигазной процедуры для получения pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта. Лигазная смесь будет трансформирована в электрокомпетентные клетки Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 50 мкг/мл канамицина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионные конструкты, будут идентифицированы как резистентные к канамицину колонии, и представляющие интерес конструкты будут подтверждены путем рестрикционного картирования эндонуклеазами и секвенирования обеих нитей ДНК для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования приведет к получению pRSFduet двойного экспрессионного конструкта, где транскрипция с первого Т7 промотора будет производить мРНК, кодирующую TEV и GalLHN/A-TEV a транскрипция со второго T7 промотора будет производить мРНК, кодирующую только GalLHN/A-TEV.

В. In situ активация GalLHN/A-TEV.

[0202] Для производства двуцепочечных форм GalLHN/A-TEV в автоиндукционных условиях на 3.0 мл PA-0.5G среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, была посеяна одна колония BL21(DE3) клеток, содержащих pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV двойной экспрессионный конструкт, и оставлена для роста при 37°С на ночь при перемешивании. 250 мкл этой стартовой культуры использовалось для посева на 250 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и росло при 37°С при перемешивании в течение 8 часов и затем при 16°С при перемешивании в течение 18 часов. Клетки осаждались центрифугированием, лизировались, очищались IMAC, деминерализировались и очищались анионобменной хроматографией, как описано в Примере 5D. Очищенный целевой белок анализировался SDS-PAGE как при восстановительных, так и при невосстановительных условиях, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 1В для оценки уровней экспрессии и степени, в которой GalLHN/A-TEV, произведенный pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV двойным экспрессионным конструктом, был превращен в двуцепочечную форму.

Пример 8

Внутриклеточная активация белка, содержащего интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания динорфина с использованием двойного экспрессионного конструкта в BEVS

[0203] Следующий пример иллюстрирует способы, используемые для очистки и количественной оценки любых белков, содержащих двуцепочечную петлю, содержащую интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, раскрытый в настоящем описании, где целевой белок и протеаза коэкспрессируются в двойном экспрессионном конструкте и под контролем двух независимых промоторов в бакуловирусной системе экспрессионного вектора (BEVS).

А. Создание pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта.

[0204] Для создания pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта, синтетический фрагмент (SEQ ID NO:107), кодирующий рекомбинантный TEV вариант 7 ниже р10 промоторной последовательности и DynLHn/A-TEV ниже polH промоторной последовательности в противоположной ориентации был синтезирован с использованием стандартных процедур (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA). Комплементарные олигонуклеотиды длиной от 20 до 50 оснований были синтезированы с использованием стандартного фосфорамидного синтеза. Эти олигонуклеотиды были гибридизированы в двухнитевые дуплексы, которые были последовательно сшиты вместе для сборки полинуклеотидной молекулы полной длины. Эта полинуклеотидная молекула была клонирована с использованием стандартных методов молекулярной биологии в pUCBHB1 вектор, несущий SmaI сайт, для образования pUCBHB1/p10-TEV/polH-DynLHN/A-TEV плазмиды. Синтезированная полинуклеотидная молекула была верифицирована путем секвенирования с использованием BIG DYE TERMINATOR™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и ABI 3100 секвенатора (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[0205] Для создания рВАС-6/TEV/DynLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта, pUCBHB1/p10-TEV/polH-DynLHN/A-TEV был расщеплен рестрикционными эндонуклеазами для: 1) вырезания вставки, содержащей полный кодирующий участок TEV варианта 7 под контролем р10 промотора и DynLHN/A-TEV в противоположном направлении под контролем polH промотора; и 2) получения возможности этой вставке функционально связаться с рВАС-6 трансферным вектором (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Эта вставка была субклонирована с использованием Т4 ДНК лигазной процедуры в рВАС-6 трансферный вектор, расщепленный аналогичными рестрикционными эндонуклеазами для получения сконструированного рВАС-6 двойного экспрессионного конструкта, содержащего TEV протеазы варианта 7 открытую рамку считывания ниже р10 промотора и вторую открытую рамку считывания DynLHN/A-TEV ниже ро1Н промотора. Лигазная смесь была трансформирована в электрокомпетентные клетки Е.coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, помещена на 1,5% Luria-Bertani агаровые планшеты (рН 7,0), содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и помещена в 37°С инкубатор на ночь для роста. Бактерии, содержащие экспрессионный конструкт, были идентифицированы как устойчивые к ампициллину колонии. Представляющие интерес конструкты были выделены с использованием процедуры щелочного лизиса мини-препаратов плазмид и проанализированы путем рестрикционного картирования эндонуклеазами для подтверждения присутствия и интеграции вставки. Такая стратегия клонирования давала рВАС-6 двойной экспрессионный конструкт, содержащий полинуклеотидную молекулу, кодирующую DynLH/A-TEV, функционально связанный с полигистидиновым «тагом» аффинной очистки на карбоксильном конце и TEV протеазой.

В. Производство высокого титра TEV/DynLHN/A-TEV рекомбинантного бакуловирусного стока.

[0206] Перед получением двуцепочечных форм DynLHN/A-TEV был произведен высокого титра рекомбинантный бакуловирусный сток, содержащий TEV/DynLHN/A-TEV. Примерно 2×10⁶ Sf9 клеток насекомых было посеяно в 35 мм чашки в 2 мл объема культуральной среды клеток насекомых ESF921. Трансфекционный раствор был приготовлен путем смешивания Раствора А (содержащего 2 мкг pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV, 0.5 мкг линеаризованной flashBAC бакуловирусной ДНК (Oxford Expression Technologies, Oxford, UK), и 100 мкл трансфекционной среды) с раствором В (содержащем 6 мкл TRANSLT®-2020 трансфекционного реагента и 100 мкл трансфекционной среды) и инкубировался при комнатной температуре в течение 30 минут. Дополнительные 800 мкл трансфекционной среды были затем добавлены к смеси Растворов А/В, осторожно перемешаны и добавлены по каплям к клеткам. Клетки инкубировались при 28°С в течение 5 часов, в конце которых 3 мл ESF 921 добавлялся, чтобы довести конечный объем до 4 мл в каждой лунке. Инкубация продолжалась при 28°С в течение 4-5 дней для производства Р0 рекомбинантного вируса. Для производства наиболее высокого титра Р1 рекомбинантных бакуловирусных посевочных стоков, вирус, выделенный из Р0 супернатанта, титровался с использованием baculoQUANT (Oxford Expression Technologies, Oxford, UK) и затем амплифицировался во встряхиваемых колбах. Около 100-200 мл Sf9 клеток с плотностью 2×10⁶ клеток/мл были инфицированы Р0 вирусом MOI (множественное инфицирование)<1 БОЕ/клетку и инкубированы при перемешивании в течение 4-5 дней. После количественной оценки высокого титра Р1 сток использовался для инфицирования Tni клеток для высокого уровня белковой экспрессии.

С. In situ активация DynLHN/A-TEV.

[0207] Для производства двуцепочечных форм DynHN/A-TEV 50 мл Tni клеток в концентрации 1×10⁶/мл были инфицированы в MOI 5 с рекомбинантным Р1 вирусным стоком, содержащим TEV/DynLHN/A-TEV, и собирались через 3 дня после инфицирования (pi). Клетки были лизированы и IMAC очищены с использованием Magne-His смолы

[0208] Для очистки двуцепочечного DynLHN/A-TEV путем Magne-His очистки клеточный осадок был ресуспендирован в 20 мл PBS без Са²⁺ или Mg²⁺ в присутствии 100 мкл Insect PopCulture Reagent и 20 мкл (10 Е) бензоазы нуклеазы, осторожно смешивались и инкубировались в течение 15 минут При комнатной температуре. После очистки клеточного лизата центрифугированием на 16000 об/мин в течение 15 минут при 4°С супернатант смешивался с 4 мл однородно суспендированной Magne-His™ смолы для очистки белка (Promega Corp., Madison, WI). Смесь инкубировалась в течение 20 мин при комнатной температуре при слабом качании для связывания белка-мишени. Пробирка переносилась в MagneSil магнитное сепараторное устройство на примерно 2 мин для того чтобы дать возможность захвата частиц смолы. После удаления супернатанта пробирка удалялась из сепараторного устройства и смола ресуспендировалась в 10 мл IMAC промывочного буфера. Снова смола сахватывалась в магнитном сепараторном устройстве и удалялся промывочный буфер. Этап промывки повторялся еще два раза. Для элюции белка-мишени смола ресуспендировалась в 2.5 мл Magne-His™ элюционного буфера (100 мМ HEPES, рН 7.5, 500 мМ Имидазола), инкубировалась при комнатной температуре в течение 2 мин, смола захватывалась магнитным сепараторным устройством и раствор супернатанта переносился в новую пробирку. Элюционный этап повторялся снова для того чтобы максимизировать возврат мишени из магнитной смолы.

[0209] Для диализа IMAC-очищенного DynLHN/A-TEV для вторичной ионообменной хроматографии объединенные элюционные фракции были диализированы в PASTDIALYZER®, оснащенном 25 кД MWCO мембраной, при 4°С в 1 л деминерализованного буфера (Буфер А: 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0) при постоянном перемешивании в течение ночи.

[0210] Для очистки двуцепочечного DynLHN/A-TEV путем анионобменной хроматографии деминерализованный белковый раствор был загружен в 1 мл UNO-Q1 анионобменную колонку, предварительно уравновешенную Буфером А, при скорости потока 1 мл/мин. Связанный белок был элюирован по градиенту NaCl Буфером В, содержащим 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 М NaCl при скорости потока 1 мл/мин следующим образом: 7% Буфер В для 3 мл, 15% Буфер В для 7 мл, от 10% до 50% Буфер В для более чем 10 мл. Элюция белков из колонки определялась на УФ-оптическом детекторе при 214 нм, 260 нм и 280 нм, и все пиковые фракции были объединены и определена концентрация белка. Аликвоты хранились при -20°С. Очищенный DynLHN/A-TEV белок анализировался путем SDS-PAGE, и гели окрашивались точно так же, как описано в Примере 1В.

[0211] Результаты показывают, что когда DynLHN/A-TEV коэкспрессировался с TEV протеазой в клетках насекомых и очищался до почти полной гомогенности, две близкие накладывающиеся полосы наблюдались при восстановительных условиях, одна примерно 51 кДа, а другая примерно 52 кДа. Более того, когда одинаковые пробы прогонялись при невосстановительных условиях, полосы примерно 51 кДа и примерно 52 кДа исчезали, и наблюдалась новая полоса примерно 102 кДа. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что полоса примерно 51 кДа соответствует энзимному домену клостридиального токсина, а полоса примерно 52 кДа соответствует транслокационному домену клостридиального токсина с компонентом, мишенью которого является динорфин, присоединенным к аминному концу. Присутствие этих двух полос было показателем образования двуцепочечного DynLHN/A-TEV, а также того, что одноцепочечный DynLHN/A-TEV превращался в двуцепочечную форму примерно с 80-90% эффективностью. Таким образом, коэкспрессия DynLHN/A-TEV и TEV протеазы в клетках насекомых, инфицированных TEV/DynLHN/A-TEV рекомбинантным бакуловирусом, полученным из pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV двойного экспрессионного конструкта, приводит к расщеплению DynLHN/A-TEV в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания динорфина, и последующему образованию двуцепочечной формы DynLHN/A-TEV.

[0212] Хотя аспекты настоящего изобретения описываются со ссылкой на раскрытые варианты воплощения, специалист в данной области техники легко поймет, что отдельные раскрытые примеры являются только иллюстрацией этих аспектов и ни в коей мере не ограничивают настоящее изобретение. Различные модификации могут быть сделаны без отступления от существа настоящего изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыты способы активации клостридиального токсина. В клетку встраивают двойной экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания TEV протеазы и рамку одноцепочечного клостридиального токсина или белка. Клетки выращивают в два этапа. Первый этап 37ºС, второй 22ºС или 16ºС. Изобретение позволяет получать активированный внутри клетки клостридиальный токсин. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 8 пр.

1. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина, содержащего двуцепочечный петлевой участок, в его двуцепочечную форму, включающий следующие этапы:
а) выращивание клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°C в течение около 3,5 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит:
i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный клостридиальный токсин, одноцепочечный клостридиальный токсин содержит энзимный домен, транслокационный домен, домен связывания и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и
ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу;
б) выращивание клетки при 22°C в течение от около 16 до около 18 часов,
при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного клостридиального токсина и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и
производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный клостридиальный токсин в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный клостридиальный токсин в его двуцепочечную форму.

2. Внутриклеточный способ по п. 1, отличающийся тем, что одноцепочечный клостридиальный токсин содержит единый линейный полипептид с очередностью от амино к карбокси-концу: 1) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина; 2) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, связывающий домен клостридиального токсина и транслокационный домен клостридиального токсина; 3) связывающий домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, и энзимный домен клостридиального токсина; 4) связывающий домен клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой и транслокационный домен клостридиального токсина; 5) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, энзимный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина; или 6) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, клостридиальный связывающий домен и энзимный домен клостридиального токсина.

3. Внутриклеточный способ по п. 1, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.

4. Внутриклеточный способ по п. 1, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.

5. Внутриклеточный способ по п. 1, отличающийся тем, что связывающий домен клостридиального токсина представляет собой связывающий домен BoNT/A, связывающий домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/C1, связывающий домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/E, связывающий домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/G, связывающий домен TeNT, связывающий домен BaNT, или связывающий домен BuNT.

6. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, включающий следующие этапы
а) выращивание клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°C в течение около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит:
i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок содержит энзимный домен, транслокационный домен, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов; и
ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) выращивание клетки при от около 12 до около 16°C в течение от около 16 до около 18 часов,
при этом выращивание на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящийся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

7. Внутриклеточный способ по п. 6, отличающийся тем, что белок содержит единый линейный полипептид с очередностью от амино к карбокси-концу: 1) энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, 2) энзимный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, и транслокационный домен клостридиального токсина, 3) интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, транслокационный домен клостридиального токсина, и энзимный домен клостридиального токсина, 4) интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, энзимный домен клостридиального токсина, и транслокационный домен клостридиального токсина, 5) транслокационный домен клостридиального токсина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, и энзимный домен клостридиального токсина; или 6) транслокационный домен клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина, и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов.

8. Внутриклеточный способ по п. 1, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.

9. Внутриклеточный способ по п. 1, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.

10. Внутриклеточный способ по п. 1, отличающийся тем, что интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов представляет собой интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания ноцицептина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания динорфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания энкефалина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания ВАМ22, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндоморфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндорфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания геморфина, или интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания риморфина.

11. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, включающий следующие этапы
а) выращивание клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°C в течение около 8 часов, при этом двойной экспрессионный конструкт содержит: i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок,
одноцепочечный белок содержит энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и
ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу;
б) выращивание клетки при от около 12 до около 16°C в течение от около 16 до около 18 часов,
при этом выращивание на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и
производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри двуцепочечного участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

12. Внутриклеточный способ по п. 11, отличающийся тем, что одноцепочечный клостридиальный токсин содержит единый линейный полипептид с очередностью от амино к карбокси-концу: 1) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен не клостридиального токсина; 2) энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, связывающий домен не клостридиального токсина и транслокационный домен клостридиального токсина; 3) связывающий домен не клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой и энзимный домен клостридиального токсина; 4) связывающий домен не клостридиального токсина, энзимный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой и транслокационный домен клостридиального токсина; 5) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, энзимный домен клостридиального токсина и связывающий домен не клостридиального токсина; или 6) транслокационный домен клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, не клостридиальный связывающий домен и энзимный домен клостридиального токсина.

13. Внутриклеточный способ по п. 11, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.

14. Внутриклеточный способ по п. 11, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E,
транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.

15. Внутриклеточный способ по п. 11, отличающийся тем, что связывающий домен не клостридиального токсина является доменом связывания пептида опиоида, доменом связывания пептида меланокортина, доменом связывания пептида галанина, доменом связывания пептида Гранина, доменом связывания пептида тахикинина, доменом связывания пептида, родственного нейропептиду Y, доменом связывания пептида нейрогормона, доменом связывания пептида цитокина, доменом связывания пептида кинина, доменом связывания пептида фактора роста фибробластов, доменом связывания пептида нейротрофина, доменом связывания пептида фактора некроза опухоли, доменом связывания пептида нейротрофического фактора глии, доменом связывания пептида трансформационного фактора роста β, доменом связывания пептида костного морфогенетического белка, доменом связывания пептида фактора роста и дифференциации, доменом связывания пептида активина, доменом связывания пептида фактора роста эндотелия сосудов, доменом связывания пептида инсулин фактора роста, доменом связывания пептида эпидермального фактора роста, доменом связывания пептида глюкагон-подобного гормона, доменом связывания пептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза, доменом связывания пептида гормона высвобождения гормона роста, доменом связывания вазоактивного кишечного пептида, доменом связывания пептида желудочного ингибиторного полипептида, доменом связывания пептида кальцитонин-связанных пептидов висцеральных органов, или связывающего домена пептида активируемого протеазой рецептора.